Thực hành vi ssinh vật thực phẩm

THỰC HÀNH VI SINH VẬT THỰC PHẨM BỐ CỤC CHƯƠNG TRÌNH Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật mẫu thực phẩm Bài 2: Xác định khả chuyển hóa hydratcacbon VSV Bài 3: Xác định khả thủy phân protein khả sinh tổng hợp enzym vi sinh vật Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật mẫu thực phẩm I Khái quát chung công tác xác định số lượng VSV Mục tiêu: Giúp cho người nghiên cứu biết mật độ vi sinh vật có mẫu thực phẩm bao nhiêu, phục vụ cho công tác nghiên cứu (tỷ lệ tiếp giống…), cho công tác công bố chất lượng thực phẩm Các phương pháp xác định: + Phương pháp xác định trực tiếp + Phương pháp xác định gián tiếp Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật mẫu thực phẩm II Phương pháp xác định trực tiếp số lượng vi sinh vật Nguyên tắc - Sử dụng khung đếm Goriaep (buồng đếm hồng cầu) Phương pháp xác định trực tiếp số lượng vi sinh vật Đây phiến kính dày, phần phiến kính có khắc lưới ô vuông với diện tích 1mm Phương pháp xác định trực tiếp số lượng vi sinh vật - Lưới khắc chia thành 25 ô vuông lớn  diện tích ô vuông lớn 1/25 mm - Mỗi ô vuông lớn lại chia thành 16 ô vuông nhỏ  Số ô vuông nhỏ lưới khắc 400 ô  diện tích ô vuông nhỏ 1/400 mm - Chiều sâu ô 0,1mm Phương pháp xác định trực tiếp số lượng vi sinh vật Cách tiến hành - Xác định số lượng tế bào nấm men men bánh mì khô - Pha loãng mẫu đến nồng độ 10 -4 - Nhỏ giọt dịch huyền phù có vi sinh vật vào khung đếm đậy kín kính, di chuyển nhẹ khung đếm làm dịch chiếm đầy khoang - Đặt khung đếm vào bàn kẹp tiêu kính hiển vi, chọn vật kính 10x 40x từ từ dùng ốc chỉnh thô đưa bàn kẹp tiêu lên để buồng đếm gần chạm vào vật kính - Dùng ốc vi chỉnh từ từ đưa tiêu xuống để tìm ảnh lấy nét Tiến hành đếm số tế bào ô vuông lớn 20 ô vuông nhỏ Phương pháp xác định trực tiếp số lượng vi sinh vật Tính kết quả: - N = a 10 - n 10 /h.s Trong N: số tế bào ml dịch huyền phù; a số tế bào trung bình hình vuông lưới, h chiều sâu khung đếm; n độ pha loãng dịch huyền phù; s diện tích hình vuông lưới - Lưu ý: số tế bào ô lớn không vượt 20, số tế bào ô nhỏ không vượt 10 Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật mẫu thực phẩm III Phương pháp xác định gián tiếp số lượng vi sinh vật thông qua phương pháp đếm khuẩn lạc Nguyên tắc: Mẫu đồng pha loãng đến nồng độ thích hợp cấy môi trường thạch chọn lọc cho nhóm, loài VSV Xác định số lượng khuẩn lạc bề mặt thạch sau thời gian nuôi tủ ấm Cách đếm: lấy bút chì kẻ đường vuông góc đáy hộp petri Đếm số khuẩn lạc góc theo thứ tự từ trái qua phải, từ xuống Phương pháp xác định gián tiếp số lượng vi sinh vật Cách tiến hành: - Xác định số lượng tế bào nấm men men bánh mì khô - Pha loãng mẫu đến nồng độ 10 - Chuẩn bị đĩa thạch có chứa môi trường nuôi Hansen, (chiều dày lớp môi trường từ – 3mm - Cấy 0,1ml dịch mẫu vào đĩa petri (3 đĩa/1 nồng độ) vào đĩa thạch, trang đều, ủ -6 – 10 -8 28 – 30 C - Xác định số khuẩn lạc sau 48h nuôi 10 Phương pháp xác định gián tiếp số lượng vi sinh vật Cách tiến hành: Chuẩn bị môi trường Hansen: - Thành phần môi trường: Đường saccaro: 30g/l;Pepton 10 g/l; K2HPO4: 3g/l; MgSO4.7H2O: g/l; Agar: 20g/l; Nước: 1000ml - Chuẩn bị 200ml môi trường, khử trùng 121 C/15 phút Sau để nguội, đổ vào đĩa petri khử trùng 11 Phương pháp xác định gián tiếp số lượng vi sinh vật Tính kết quả: Σ C N= (n1 x f1 + n2 x f2) x v N: Tổng số vi khuẩn hiếu khí (CFU/g CFU/ml) C: Tổng số khuẩn lạc đếm tất đĩa ni: Số lượng đĩa cấy nồng độ i fi: Độ pha loãng đĩa i v: Thể tích dịch (ml) cấy vào đĩa 12 Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật mẫu thực phẩm IV Đặt thí nghiệm cho Thí nghiệm lên men rượu: Chuẩn bị 100ml dung dịch đường saccharose 10% cho vào bình tam giác 250ml, thêm 0,1g nấm men Sac cerevisiae hòa tan Lên men nhiệt độ phòng 24h Thí nghiệm lên men lactic: Chuẩn bị 100ml sữa tươi vào bình tam giác 250ml Thêm vào 10g sữa chua Lên men 40độ C 6h Đặt thí nghiệm lên men axetic: Chuẩn bị 100ml bia + 1ml rượu + 15ml dấm ăn vào bình tam giác 250ml Lên men nhiệt độ phòng ngày 13 Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật mẫu thực phẩm V Đặt thí nghiệm cho Thí nghiệm thủy phân protein Chuẩn bị 5g thịt vụn + 150ml nước vào bình tam giác 250ml Đun sôi 10 phút Để nguội, kiểm tra pH giấy thử pH Kẹp miếng giấy thử pH miệng bình tam giác Ủ nhiệt độ phòng ngày 14 Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật mẫu thực phẩm V Đặt thí nghiệm cho 2.Thí nghiệm thử khả sinh tổng hợp enzyme amilase - Thành phần môi trường: NaNO3: 3g/l; K2HPO4: 1g/l; KCl: 0,5g/l; MgSO4.7H20: 0,5g/l; FeSO4: 0,1g/l; Tinh bột tan: 15g/l; Agar: 20g/l; Nước: 1000ml (Chú ý: Tinh bột tan hòa nước ấm cho tan thành dạng hồ đổ vào môi trường) - Chuẩn bị 200ml môi trường, khử trùng 121 C/15 phút Sau để nguội, đổ vào đĩa petri khử trùng - Cấy chấm điểm nấm mốc Aspergillus Penecillium vào đĩa (8 đĩa, mốc đĩa) 15 Bài 2: Xác định khả chuyển hóa hydratcacbon vi sinh vật - Quan sát tượng - Quan sát tế bào nấm men: Làm tiêu tươi không nhuộm, quan sát vật kính 40X, xác định hình Quá trình lên men rượu: dạng, cách xếp tế bào nấm men - Xác định tỷ lệ nấm men nảy chồi: Làm tiêu tươi không nhuộm, quan sát vật kính 40X, đếm tổng số tế bào nấm men số tế bào nấm men nảy chồi trường kính để tính Cách làm tiêu tươi không nhuộm: Nhỏ giọt dung dịch chứa VSV vào phiến kính, dùng lam kính đậy lại 16 Bài 2: Xác định khả chuyển hóa hydratcacbon vi sinh vật - Quá trình lên men rượu: Xác định tỷ lệ nấm men sống: Làm tiêu tươi nhuộm đơn safranin, quan sát vật kính 40X, đếm tổng số tế bào nấm men số tế bào nấm men sống trường kính để tính Cách làm tiêu tươi nhuộm đơn: Nhỏ giọt dung dịch chứa VSV vào phiến kính, nhỏ tiếp giọt thuốc nhuộm safarnin, trộn đều, dùng lam kính đậy lại, đếm vòng phút Lưu ý: Tế bào nấm men sống không bắt màu, tế bào nấm men chết bắt màu thuốc nhuộm 17 Bài 2: Xác định khả chuyển hóa hydratcacbon vi sinh vật - - Quá trình lên men lactic : Quan sát tượng Xác định lượng axit lactic tạo thành: Cân 10g sữa chua vào bình tam giác 250ml, thêm 20ml nước, thêm 1-2 giọt phenolphtalein, chuẩn độ dung dịch NaOH 0,1N 1ml NaOH 0.1N = 0,009g lactic - Quan sát vi khuẩn lactic: làm 01 tiêu cố định nhuộm Gram để quan sát: hình dạng, cách xếp, loại Gram chủng vi khuẩn lactic sữa chua 18 Bài 2: Xác định khả chuyển hóa hydratcacbon vi sinh vật - - Quá trình lên men axetic : Quan sát tượng Xác định lượng axit axetic tạo thành: Hút 10ml dịch lên men axetic vào bình tam giác 250ml, thêm 20ml nước, thêm 1-2 giọt phenolphtalein, chuẩn độ dung dịch NaOH 0,1N 1ml NaOH 0.1N = 0,006g axetic - Quan sát vi khuẩn axetic: làm 01 tiêu cố định nhuộm Gram để quan sát: hình dạng, cách xếp, loại Gram chủng vi khuẩn axetic dịch lên men 19 Các bước nhuộm gram Các bước nhuộm Gram - Cố định vết bôi: Đặt giọt nước cất lên phiến kính, lấy vòng que cấy tròn sinh khối vi sinh vật hòa vào giọt nước cất (hoặc lấy giọtdung dịch chứa vi sinh vật đặt lên phiến kính), dàn mỏng, hong khô - Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi - Nhỏ dd Crystal violet (tím) thấm ướt hết giấy lọc Để từ – phút ( nếu vi khuẩn lấy từ canh lỏng để phút, lấy từ thạch dinh dưỡng để phút ) Rửa nước, thấm (hong) khô.  - Tẩy cồn 96: 15 – 30 giây ( từ canh lỏng tẩy 15 giây, từ  thạch dinh dưỡng tẩy 30 giây ) Rửa nước, thấm (hong) khô Tẩy cồn bằng cách để nghiêng tiêu bản, cho cồn chảy từ từ mép trên phiến kính Quan sát mép giọt cồn vừa mất màu tím.  21 Các bước nhuộm Gram - Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi, nhuộm lần cách nhỏ dung dịch Fuschin kiềm loãng để phút Rửa nước, thấm (hong) khô tiêu bản.  - Quan Vi sát khuẩn G (+) vật bắt kính màu dầu, tím độ Crystal phóng violet, đại vi 100 khuẩn lần.  G bắt màu hồng - Chú ý: Trước lần nhỏ thuốc nhuộm lên tiêu bản, phải đặt miếng giấy lọc phủ lên vết bôi. Sau lần nhuộm phải rửa nước thấm (hong) khô tiêu bản.  22 (–) Bài 3: Xác định khả thủy phân protein khả sinh tổng hợp enzym vi sinh vật - - Xác định khả thủy phân protein VSV Quan sát tượng Xác định định tính : So sánh giá trị pH thời điểm đặt thí nghiệm thời điểm đọc kết - Quan sát vi khuẩn gây thối rữa protein: Làm 01 tiêu cố định nhuộm Gram từ dịch thủy phân để xác định: Hình dạng loài vi khuẩn, so sánh tỷ lệ vi khuẩn G(+) G(-) tiêu 23 Bài 3: Xác định khả thủy phân protein khả sinh tổng hợp enzym vi sinh vật Xác định khả sinh tổng hợp emzym amilaza - Thuốc thử: Dùng dung dịch Lugol (I2 KI) đổ vào đĩa thạch có chứa tinh bột tan nuôi nấm mốc - Xác định định tính khả sinh enzym amilase VSV: Xác định đường kính khuẩn lạc: d (mm) Xác định đường kính vòng môi trường bị thủy phân: D Hiệu số D – d đại lượng định tính để xác định khả sinh enzym vi sinh vật So sánh khả sinh enzym amilase loài nấm mốc sử dụng 24 Bài 3: Xác định khả thủy phân protein khả sinh tổng hợp enzym vi sinh vật Xác định khả sinh tổng hợp emzym amilaza - Quan sát nấm mốc: Làm 01 tiêu tươi không nhuộm: để quan sát hình dạng hệ sợi nấm (có vách ngăn hay không, có phân nhánh hay không?), màu bào tử Làm 01 tiêu tươi nhuộm đơn safranin: để quan sát phận sinh bào tử nấm mốc (bào tử trần hay bào tử nang, bào tử trần dạng bàn tay xòe hay dạng hoa hướng dương ) 25 [...]... ngày 13 Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật trong mẫu thực phẩm V Đặt thí nghiệm cho bài 3 1 Thí nghiệm thủy phân protein Chuẩn bị 5g thịt vụn + 150ml nước vào bình tam giác 250ml Đun sôi trong 10 phút Để nguội, kiểm tra pH bằng giấy thử pH Kẹp 1 miếng giấy thử pH ở miệng bình tam giác Ủ ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày 14 Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật trong mẫu thực phẩm V Đặt thí nghiệm cho bài... lượng vi sinh vật 2 Cách tiến hành: Chuẩn bị môi trường Hansen: - Thành phần môi trường: Đường saccaro: 30g/l;Pepton 10 g/l; K2HPO4: 3g/l; MgSO4.7H2O: 2 g/l; Agar: 20g/l; Nước: 1000ml - Chuẩn bị 200ml môi trường, khử trùng ở 121 0 C/15 phút Sau đó để nguội, đổ vào 9 đĩa petri đã khử trùng 11 Phương pháp xác định gián tiếp số lượng vi sinh vật 3 Tính kết quả: Σ C N= (n1 x f1 + n2 x f2) x v N: Tổng số vi. .. vết bôi: Đặt 1 giọt nước cất lên giữa phiến kính, lấy 1 vòng que cấy tròn sinh khối vi sinh vật hòa đều vào giọt nước cất (hoặc lấy 1 giọtdung dịch chứa vi sinh vật đặt lên giữa phiến kính), dàn mỏng, hong khô - Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi - Nhỏ dd Crystal violet (tím) thấm ướt hết giấy lọc Để từ 1 – 2 phút ( nếu vi khuẩn lấy từ canh lỏng để 2 phút, lấy từ thạch dinh dưỡng để 1 phút ) Rửa nước, thấm... tiêu bản.  - Quan Vi sát khuẩn bằng G (+) vật bắt kính màu dầu, tím độ Crystal phóng violet, đại vi 100 khuẩn lần.  G bắt màu hồng - Chú ý: Trước mỗi lần nhỏ thuốc nhuộm lên tiêu bản, phải đặt miếng giấy lọc phủ lên vết bôi. Sau mỗi lần nhuộm đều phải rửa nước và thấm (hong) khô tiêu bản.  22 (–) Bài 3: Xác định khả năng thủy phân protein và khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật 1 - - Xác định... của vi sinh vật 2 - - Quá trình lên men axetic : Quan sát hiện tượng Xác định lượng axit axetic tạo thành: Hút 10ml dịch lên men axetic vào bình tam giác 250ml, thêm 20ml nước, thêm 1-2 giọt phenolphtalein, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N 1ml NaOH 0.1N = 0,006g axetic - Quan sát vi khuẩn axetic: làm 01 tiêu bản cố định nhuộm Gram để quan sát: hình dạng, cách sắp xếp, loại Gram của các chủng vi khuẩn... cấy tại nồng độ i fi: Độ pha loãng đĩa i v: Thể tích dịch (ml) cấy vào mỗi đĩa 12 Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật trong mẫu thực phẩm IV Đặt thí nghiệm cho bài 2 1 Thí nghiệm lên men rượu: Chuẩn bị 100ml dung dịch đường saccharose 10% cho vào bình tam giác 250ml, thêm 0,1g nấm men Sac cerevisiae hòa tan Lên men ở nhiệt độ phòng trong 24h 2 Thí nghiệm lên men lactic: Chuẩn bị 100ml sữa tươi vào... hydratcacbon của vi sinh vật 2 - - Quá trình lên men lactic : Quan sát hiện tượng Xác định lượng axit lactic tạo thành: Cân 10g sữa chua vào bình tam giác 250ml, thêm 20ml nước, thêm 1-2 giọt phenolphtalein, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N 1ml NaOH 0.1N = 0,009g lactic - Quan sát vi khuẩn lactic: làm 01 tiêu bản cố định nhuộm Gram để quan sát: hình dạng, cách sắp xếp, loại Gram của các chủng vi khuẩn lactic... pH ở thời điểm đặt thí nghiệm và thời điểm đọc kết quả - Quan sát vi khuẩn gây thối rữa protein: Làm 01 tiêu bản cố định nhuộm Gram từ dịch thủy phân để xác định: Hình dạng của các loài vi khuẩn, so sánh tỷ lệ vi khuẩn G(+) và G(-) trong tiêu bản 23 Bài 3: Xác định khả năng thủy phân protein và khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật 2 Xác định khả năng sinh tổng hợp emzym amilaza - Thuốc thử:... mốc 4 đĩa) 15 Bài 2: Xác định khả năng chuyển hóa hydratcacbon của vi sinh vật 1 - Quan sát hiện tượng - Quan sát tế bào nấm men: Làm 1 tiêu bản tươi không nhuộm, quan sát ở vật kính 40X, xác định hình Quá trình lên men rượu: dạng, cách sắp xếp tế bào nấm men - Xác định tỷ lệ nấm men nảy chồi: Làm 1 tiêu bản tươi không nhuộm, quan sát ở vật kính 40X, đếm tổng số tế bào nấm men và số tế bào nấm men nảy... đường kính vòng môi trường đã bị thủy phân: D Hiệu số D – d là đại lượng định tính để xác định khả năng sinh enzym của vi sinh vật So sánh khả năng sinh enzym amilase của 2 loài nấm mốc đã sử dụng 24 Bài 3: Xác định khả năng thủy phân protein và khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật 2 Xác định khả năng sinh tổng hợp emzym amilaza - Quan sát nấm mốc: Làm 01 tiêu bản tươi không nhuộm: để quan sát