Đề tài cây jatropha
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC BÀI BÁO CÁO MÔN: KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY TRỒNG ĐỀ TÀI: CÂY JATROPHA Nhóm 1.1 Sơ lược đặc điểm Cọc rào 1.1.1 Phân loại khoa học Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Malpighiales Họ: Euphorbiaceae Phân họ: Crotonoideae Tông: Jatropheae Chi: Jatropha Loài: Jatropha curcas L Hình 1: Cây Cọc rào 1.1.2 Nguồn gốc phân bố Chi Dầu mè (danh pháp khoa học: Jatropha) chi khoảng 175 loài thân mọng, bụi hay thân gỗ (một số có sớm rụng, dầu mè (Jatropha curcas L.)) Các loài chi Jatropha có nguồn gốc từ Trung Mỹ, du nhập vào nhiều khu vực nhiệt đới cận nhiệt đới khác, Ấn Độ, châu Phi, Bắc Mỹ, Xuất phát từ khu vực Caribe, chúng thương nhân Bồ Đào Nha đưa vào châu Phi châu Á loài thực vật có giá trị làm hàng rào Các trưởng thành mang cụm hoa đực đẹp mắt đồng thời chúng lại không mọc cao Cây Jatropha curcas L (JCL), thuộc chi Jatropha, họ Thầu dầu Chi Jatropha có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, ghép từ hai chữ Iatrós (bác sĩ) trophé (thức ăn), ám công dụng làm thuốc Curcas tên gọi thông thường Physic nut Malabar, Ấn Độ Tên thông dụng nước Jatropha, Việt Nam gọi Cọc giậu, Cọc rào, Cây li, Ba đậu nam, Dầu mè,… (Nguyễn Công Tạn, 2008) Loài JCL dại phân bố nhiều vùng thung lũng nhiệt đới khô nóng vùng rừng mưa nhiệt đới ẩm, thường vùng đồi núi, đất dốc thung lũng có độ cao 700-1600 m so với mực nước biển JCL loài có lịch sử 70 triệu năm, nguồn gốc từ Mexico (nơi có hóa thạch này) Trung Mỹ, người Bồ Đào Nha đưa qua Cape Verde, lan truyền sang châu Phi, châu Á, sau trồng nhiều nước, trở thành địa khắp nước nhiệt đới, cận nhiệt đới toàn giới (Nguyễn Công Tạn, 2008) 1.1.3 Đặc điểm hình thái – Đặc tính sinh học JCL gỗ nhỏ, cao đến m Cành xòe, có nhựa mủ, cành có vết sẹo Thân, vỏ, có nhựa nhớt, không màu Lá mọc so le, hình trái xoan, tròn, chia 5-7 thùy nông với chiều dài rộng khỏang 6-15cm Phiến dạng giấy lụa (Nguyễn Công Tạn, 2008) Hình 2: Cây Cọc rào Cụm hoa tận có màu vàng Hoa đơn tính, gốc, có hoa lưỡng tính Bộ nhị 10, xếp thành hai vòng riêng biệt, vòng 5, tạo thành cột đơn gần Bộ nhụy có vòi nhụy, dính với khỏang 2/3 chiều dài, phần rời núm nhụy rẽ đôi (Dehgan Webster, 1979) Hình 3: Hoa Cọc rào Quả non hình trứng, lúc chín màu vàng, sau nâu xám, chứa hạt màu đen Thông thường, có rễ tạo hạt nảy mầm, rễ rễ phụ Nếu trồng phương pháp thông thường rễ (Nguyễn Công Tạn, 2008) Hình 4: Quả Cọc rào Hình 5: Hạt Cọc rào Cây JCL ưa ánh sáng, ưa khí hậu ấm áp, chịu khô hạn, sống môi trường có lượng mưa trung bình năm 520-2000 mm, nhiệt độ bình quân năm 11-28oC Cây chịu đất xấu, đất sỏi, đất đá vôi bạc màu Cây JCL nảy chồi dễ, giâm hom, trồng hạt, có rễ rễ ngang, giâm hom rễ Nói chung, sau trồng năm, cao m Với thực sinh, sau trồng 3-4 năm kết trái Thời gian bình thường 6-20 năm, thấy tượng cách năm Ra hoa từ tháng đến tháng 4, thời gian hoa kéo dài 4-5 tháng, chín vào tháng 8-9, khó rụng Hình 6: Hình thái Jatropa curcas L a - cành hoa; e - hoa có nhị; b - vỏ cây; f - mặt cắt ngang xanh; c - gân lá; g - quả; d - hoa có nhuỵ; h - mặt cắt dọc (Hình a, c f từ Aponte năm 1978; Hình d e từ Dehgan năm 1984) (Nguyễn Công Tạn, 2008) 1.1.4 Các ưu điểm sinh học giá trị Cọc rào JCL lòai mà nhà khoa học đánh giá cao ưu điểm sinh học giá trị Ý nghĩa mặt kinh tế, xã hội Phát quan trọng từ JCL lấy hạt làm nguyên liệu sản xuất dầu diesel sinh học (biodiesel) Cây JCL có chu kỳ sống lâu lên đến 50 năm, cho quả, hạt sớm, hàng năm suất đạt đến 10 – 12 tấn/ha trồng đất tốt đầu tư cao (chăm sóc, bón phân, tưới tiêu, ), hàm lượng dầu hạt cao trung bình 32 – 35% Đây nguồn nguyên liệu dầu diesel sinh học tiềm để dần thay tài nguyên nhiên liệu hóa thạch ngày bị cạn kiệt Từ hạt JCL ép dầu thô, từ dầu thô tinh luyện diesel sinh học glycerin Mặc dù diesel sinh học sản xuất từ nhiều loại nguyên liệu: cải dầu, hướng dương, dầu cọ, mỡ động vật,… sản xuất từ JCL có giá thành rẻ chất lượng tốt tương đương với dầu diesel hóa thạch truyền thống Nếu JCL đạt suất – 10 hạt/ha/năm sản xuất diesel sinh học Loại dầu thay phần dầu diesel truyền thống cạn kiệt, giảm thiểu lượng khí thải gây hiệu ứng nhà kính, loại dầu cháy hết có lưu huỳnh, loại dầu sạch, thân thiện với môi trường Thị trường tiêu thụ sản phẩm diesel sinh học từ JCL coi vô hạn Nhà khoa học Đức Klause Becker cho ”JCL trồng mà người dân làm không sợ đầu ra” Đó ưu trội hàng đầu sản xuất JCL có vị sản xuất hàng hóa lớn Là lâu năm năm trồng thu hoạch sản phẩm hạt Hạt JCL sau ép dầu, 30% sản phẩm dầu, gần 70% khô dầu, có hàm lượng protein khoảng 30%, dùng làm phân hữu tốt, khử hết độc tố làm thức ăn gia súc cao đạm JCL tạo hiệu ứng xã hội lớn Do trồng vùng miền núi nghèo, JCL tạo nhiều việc làm thu nhập khả quan cho đồng bào dân tộc; nay, đất dốc lại vùng chưa tìm kiếm trồng diện tích lớn, có thu nhập cao, lại có thị trường ổn định (Nguyễn Công Tạn, 2007) Ý nghĩa mặt bảo vệ môi trường JCL lâu năm, phủ đất tốt, tuổi thọ 50 năm, sinh trưởng phát triển hầu hết loại đất xấu, nghèo kiệt, đất dốc, đất trơ sỏi đá, gia súc không ăn Vì vậy, JCL trồng vùng đất dốc coi “lấp đầy” lỗ hổng sinh thái vùng sinh thái xung yếu miền núi, sớm tạo thảm thực bì dày đặc chống xói mòn, chống cháy, nâng cao độ phì đất Không vậy, JCL trồng vùng đất sa mạc hóa, bãi thải khai thác khoáng sản, góp phần phục hồi hệ sinh thái vùng Vì vậy, JCL đánh giá “vệ sĩ sinh thái”, tạo hiệu ứng to lớn bảo vệ môi trường Cây JCL coi loài thân thiện với môi trường lý sau đây: 1) Chu kỳ sống dài (30 – 50 năm), khả cộng sinh với nấm rễ micorrhiza cao nên thích nghi sinh trưởng tốt lập địa suy thoái, khô cằn hoang hóa, có tác dụng cải tạo đất, cải tạo môi trường tốt; 2) Có thể thu hái hạt hàng năm, đốn hạ cây, tạo thảm thực vật có độ che phủ ổn định, có khả hấp thụ CO2 lớn, JCL có ý nghĩa bảo vệ môi trường không khí Được sử dụng làm phân bón thức ăn cho gia súc Sau ép dầu, bã khô dầu có hàm lượng N 4,14 – 4,78%, P2O5 0,50 – 0,66%, CaO 0,60 – 0,65%, MgO 0,17 – 0,21% sử dụng làm phân hữu tốt để bón cho loại trồng, cho vùng sản xuất nông nghiệp hữu cơ, nông nghiệp sạch, vừa góp phần sản xuất sản phẩm sạch, vừa nâng cao độ phì đất Trong chữa trị bệnh Trong thành phần JCL, phân tích hợp chất chủ yếu tecpen, flavon, coumarin, lipid, sterol, alkaloid Nhiều phận chữa bệnh lá, vỏ cây, hạt rễ Rễ trị tiêu viêm, cầm máu, trị ngứa; dầu hạt nhuận tràng; dịch nhựa trắng tiết từ vết thương cành trị viêm lợi, làm lành vết thương, chữa trị bệnh trĩ mụn cơm; nước sắc từ dùng để chữa bệnh phong thấp, đau răng,… Trong JCL có số độc tố, phytotoxin (curcin) hạt, nghiên cứu sâu cung cấp cho loại dược liệu 1.2 Tình hình nghiên cứu, sử dụng, phát triển nhiên liệu sinh học (NLSH) biodiesel từ Cọc rào giới Việt Nam 1.2.1 Thế giới Tháng 6/2003, Hội nghị thượng đỉnh EU lượng kêu gọi cộng đồng EU tăng cường sử dụng bio-fuels, đến năm 2005 chiếm 2-3%, năm 2010 tăng lên 5,75% năm 2020 20% Tháng 8/2004, Hội nghị nước Châu Á mở rộng tổ chức Băng Cốc Thái Lan tuyên bố điểm hợp tác chia sẻ kinh nghiệm phát triển NLSH dùng cho giao thông vận tải Tại Hội nghị quốc tế lượng APEC tổ chức từ ngày 27-29/4/2005 Vancouver, Canada, NLSH (Biofuel) chọn để sử dụng ngành lượng ngành giao thông vận tải nước APEC lộ trình sản xuất nhiên liệu thay dần cho xăng dầu khoáng Việc nghiên cứu sử dụng NLSH trở thành xu phát triển tất yếu nhiều quốc gia toàn cầu để thay dần xăng dầu khoáng thập kỷ tới Dự báo cuối kỷ 21, lượng tái tạo (mặt trời, gió, địa nhiệt, thuỷ điện nhỏ, nhiên liệu sinh học) chiếm 50% lượng thương mại (Đặng Tùng, 2007) Để giảm thiểu ô nhiễm môi trường, đảm bảo an ninh lượng lâu dài phát triển bền vững, nhiều quốc gia vòng - thập kỷ qua tập trung nghiên cứu sử dụng NLSH (xăng/diesel pha ethanol diesel sinh học), thay phần xăng, dầu khoáng, tiến tới xây dựng ngành “xăng dầu sạch” quốc gia Hiện có khoảng 50 nước giới khai thác sử dụng NLSH mức độ khác Nhìn chung, nước giới theo hai hướng phát triển NLSH: ethanol nhiên liệu, sản xuất chủ yếu từ ngô (Mỹ), mía đường (Brazil), sắn (Thái Lan), diesel sinh học sản xuất từ cải dầu, hướng dương (châu Âu), cọ dầu (Đông Nam Á), dầu mỡ phế thải, JCL, tảo, Năm 2003 toàn giới sản xuất khoảng 38 tỷ lít ethanol đến năm 2005 sản xuất 50 tỷ lít ethanol (trong 75% dùng làm NLSH) dự kiến đến 2012 khoảng 80 tỷ lít ethanol Diesel sinh học nguồn gốc động thực vật sản xuất năm 2005 đạt triệu dự kiến đến năm 2010 tăng lên đến 20 triệu Tại châu Âu , nhiều công ty nghiên cứu sản xuất diesel sinh học từ dầu đậu nành, dầu hạt cải, dầu hướng dương Các nước Anh, Pháp, Đức, Tây Ban Nha, Áo, Đan Mạch đầu tư nhiều vào chương trình NLSH Giáo sư Klause Becker Đại học Stuttgart nhận đơn đặt hàng Tập đoàn ôtô Daimler Chrysler Đức nghiên cứu JCL Giáo sư cho biết, cách 15 năm, ông người châu Âu với hãng tư vấn Áo tiến hành nghiên cứu JCL Nicaragoa Loài có cách 70 triệu năm chẳng quan tâm Sau có dự án Daimler Chrysler, dấy lên sốt JCL toàn giới Dầu diesel sinh học từ JCL sử dụng vào loại xe thông thường Dự báo đến năm 2030, xe ôtô toàn giới từ 500 triệu lên 900 triệu chiếc, Trung Quốc có tới 190 triệu Diesel sinh học từ JCL 10 Nếu trồng non ươm bầu trọn ngày râm mát, hố trồng sâu 20-25cm, bón phân nung chảy NPK 200g/hốc, phủ 15cm đất đặt xuống hốc Nếu có điều kiện tưới ẩm Nếu nước tưới trồng vào lúc đất ẩm sau trồng nén gốc, có đủ rác để giữ ẩm Chăm sóc non a Làm cỏ: Sau trồng năm đầu, phải làm cỏ 1-2 lần, năm sau cắt cỏ để che phủ gốc b Phòng trừ sâu bệnh: Jatropha bệnh, non dễ bị sâu xám loại sâu khác cắn rễ thân non, cần dùng thuốc để diệt c Bón phân: Trong 1-3 năm đầu, hàng năm bón lần vào tháng tháng 7, lần bón NPK khoảng 100g/cây, bón vào gốc theo chiều thẳng đứng tán d Quản lý nước: Jatropha chịu hạn, không chịu ngập úng Khi hạn gay gắt nên có tưới nước, mưa nhiều phải tiêu nước đọng không để thối rễ Chăm sóc vườn trưởng thành a Tạo tán cây: Sau trồng 1-2 năm, quả, sau 3-4 năm bước vào thời kỳ suất cao Khi trưởng thành vào tháng 11-12 hàng năm, tỉa bớt cành dày, giữ lại chồi năm thành thục Vào tháng 2-4, không gây sát thương cành, để phòng ngừa chảy nhựa 26 b Chăm sóc hoa, quả: Hạt vào vụ xuân, thu nhiều dầu, phẩm chất tốt nhất, cần tăng cường chăm sóc hoa non trước tháng Để tăng tỷ lệ đậu quả, vào vụ hoa rộ tháng 3-5, cần phun bổ sung vi lượng c Chăm sóc trưởng thành: Jatropha chịu đất xấu, đất tốt, đủ dinh dưỡng, sinh trưởng bình thường, không bón phân Nhưng đất xấu nghèo dinh dưỡng cần bón phân thêm lân, bổ sung N, K để tăng suất chất lượng Hàng năm có lần bón thúc NPK khoảng 100g/cây Thu hái bảo quản a Thời vụ thu hái: Jatropha hoa vào tháng 4-9, vụ xuân chín vào tháng 7-11, chất lượng hạt tốt nhất, mùa hè chín vào tháng 9-10, chất lượng hạt tốt, mùa thu năm khó chín Quả thu vào tháng 5-6 năm thứ hàm lượng dầu thấp, nên hạn chế hoa mùa thu để đảm bảo chất lượng hạt Quả chín phải thu hái kịp thời, tránh rụng xuống đất Quả sau chín, vỏ chuyển màu nâu thẫm, nứt Khi vỏ đen tức chín sinh lý hoàn toàn, lúc có hàm lượng dầu cao nhất, lúc thu hái tốt b Sau hái quả: Quả phơi khô, tách hạt sau phơi hạt bảo quản đưa chế biến c Hạt Jatropha: Được giữ bao đóng kín, để chỗ râm mát, bị ẩm phải phơi lại 1.4 Hệ thống nuôi cấy lớp mỏng tế bào nghiên cứu tái sinh, nhân giống thực vật 27 1.4.1 Khái niệm lớp mỏng tế bào Khi nghiên cứu hệ thống ức chế, GS K Trần Thanh Vân nghĩ đến khái niệm hệ thống lớp mỏng tế bào (Tran Thanh Van, 2003) Với hệ thống này, GS K Trần Thanh Vân cố gắng phân tách một vài lớp tế bào biệt hóa từ hệ thống quan, mô, tế bào; cố gắng chương trình hóa lại chúng nuôi cấy in vitro; “biệt hóa” tiêu chí quan trọng Điều cho phép nhà nghiên cứu lần theo dấu vết trở lại kiện thời điểm bắt đầu Không phải trường hợp chuyển nhân tế bào sinh dưỡng vào tế bào trứng không nhân trường hợp sinh sản vô tính cừu Dolly, tế bào hệ thống lớp mỏng tế bào giữ trạng thái nguyên nhân tế bào chất chương trình hóa lại cách đồng loạt để biểu tất trường hợp có trình biệt hóa, mà phôi làm điều Tất trình biệt hóa kiểm soát cách riêng biệt tái chương trình hóa theo trình tự thời gian không gian tùy theo người nghiên cứu không bị áp đặt trình phát triển cá thể (Dương Tấn Nhựt, 2006) 1.4.2 Định nghĩa hệ thống lớp mỏng tế bào Hệ thống lớp mỏng tế bào – TCL (Thin Cell Layer) chứa mẫu cấy có kích thước nhỏ cắt từ quan thực vật khác (chồi, lá, rễ, cụm hoa, đế hoa, quan hoa, mầm, trụ hay trụ mầm, vùng chồi đỉnh phôi) Chúng cắt theo chiều dọc – gọi lTCL ngược lại, theo chiều ngang – gọi tTCL Dạng lTCL (kích thước 1mm x - 10mm) bao gồm loại tế bào, ví dụ lớp tế bào biểu mô tách từ số quan vài lớp (3 – lớp) từ tế bào vỏ; đó, dạng tTCL (kích thước 0,2 - 0,5mm hay vài mm bề dày) bao gồm số lượng nhỏ dạng tế bào từ mô khác (biểu mô, vỏ, vùng thượng tầng, mô mạch nhu mô) Một đặc tính phổ biến lTCL 28 tTCL tính mỏng, có nghĩa mảnh cấy có số lượng tế bào tốt Đặc tính “mỏng” đóng vai trò quan trọng phân tử marker chuẩn bị cho biệt hóa xác định in situ tế bào đích (hay tế bào đáp ứng) Sự xác định vị trí cho phép giới hạn tế bào đáp ứng (Tran Thanh Van, 2003; Dương Tấn Nhựt, 2006) Việc giảm số lượng tế bào phương pháp lớp mỏng tế bào có ý nghĩa quan trọng ảnh hưởng đến trình phát triển chương trình biệt hóa mô, quan Các chương trình biệt hóa thay đổi từ việc thay đổi mối tương quan quan mô cấy với kích thước chúng nuôi môi trường có tính chất Phương pháp cắt dọc (lTCL) dùng phổ biến dạng phát sinh hình thái mong muốn tạo qua việc điều khiển mức độ nhân tố ngọai sinh (Dương Tấn Nhựt, 2006) 1.4.3 Những đặc điểm hệ thống lớp mỏng tế bào Một phổ rộng chương trình phát sinh hình thái phát sinh từ tế bào hợp tử biệt hóa Đây đặc tính hệ thống TCL Các tính chất mong muốn khác có phương pháp TCL đồng sinh lý di truyền ứng dụng phương pháp cho thực vật Tuy nhiên, điều kiện môi trường lý tưởng phù hợp cho tồn mẫu TCL phụ thuộc vào lòai đòi hỏi phải thử nghiệm lại tất điều kiện nuôi cấy in vitro như: chất ĐHSTTV, chất dinh dưỡng, ánh sáng, thẩm thấu, nhiệt độ, (Tran Thanh Van, 1981) Những kỹ thuật sinh học phân tử, sinh hóa sinh lý cho phép nhà khoa học xác định phân lập gen mang đặc tính Chúng ta cố gắng thiết lập mô hình hệ thống TCL tất tế bào đích (tế bào đáp ứng) thích nghi tiếp xúc tốt với nhân tố thành phần môi trường xác định, môi trường nuôi cấy Có hai vấn đề cần giải nuôi cấy mô thực vật Đó việc xác 29 định vị trí tế bào đích quan sát thay đổi mảnh (mẫu) cấy Đặc tính “mỏng” giúp giải hai vấn đề Bằng cách sử dụng marker trình biệt hóa, xác định vị trí tế bào đích/tế bào đáp ứng Chúng ta quan sát thay đổi mảnh cấy mà không cần phải phá vỡ mảnh cấy cách sử dụng kính hiển vi xuyên thấu Vì trình sinh tổng hợp, chuyển hóa, vận chuyển, điều hòa vị trí auxin, ABA, ethylene, cytokinin phức tạp nên tế bào đáp ứng hệ thống TCL sử dụng làm marker để nghiên cứu trình (Dương Tấn Nhựt, 2006) Trong hệ thống TCL, yếu tố nội sinh thường không lớn trình vận chuyển phức tạp so với sử dụng mẫu cấy lớn Tế bào đích/tế bào đáp ứng thường tiếp xúc với tế bào bị thương cắt khỏi quan thông qua mảnh thành tế bào oligosaccharide, dạng oligogalacturonide Người ta thấy tác động số enzym thủy phân, ảnh hưởng oligosaccharide thường có không kết hợp với nhân tố sinh trưởng trình biệt hóa, có hình thành rễ Hệ thống TCL có khoảng thời gian cho phát sinh hình thái tương đối ngắn (khoảng 14 ngày từ bắt đầu nuôi cấy), tần số phát sinh cao (100% gần 100%), tỷ lệ tế bào đáp ứng với tổng số tế bào diện TCL cao Ví dụ: mẫu lTCL thuốc (Nicotiana tabacum) cắt khỏi cuống hoa có – lớp tế bào vỏ Các quan biệt hóa mà không qua giai đoạn tạo mô sẹo, trực tiếp nằm bề mặt TCL gồm: 50 hoa môi trường tạo hoa; 500 – 700 chồi môi trường tạo chồi; 15 – 20 rễ môi trường tạo rễ 30 Lúc đầu, người ta giả thuyết biệt hóa hoa giai đoạn sinh lý đặc biệt quan cho, cuống hoa Tuy nhiên, biệt hóa chồi rễ hình thành giai đoạn sinh lý tương tự Như vậy, giả thuyết không Người ta thấy lượng RNA cần cho cảm ứng hoa lTCL không biểu thời điểm bắt đầu nuôi cấy Các trình hình thành quan thường cảm ứng, có tạo hoa Có nghĩa nhân tế bào biệt hóa môi trường tế bào chất chương trình hóa trở lại Sự hình thành phôi quan tần số cao, thời gian ngắn trực tiếp chứng minh số loài khác như: Populus (hiệu 25 lần sử dụng mảnh cấy 0,4 – 0,5mm so với mảnh cấy 1mm); Garcinia mangostana (hiệu 50 lần sử dụng phương pháp tTCL với mảnh cấy 3mm so với mảnh cấy 1/2 lá); Aranda deborah; Heliconia; Rhynchostylis gigantean; Lilium longiflorum; Brassica napus; Panax ginseng;… (Dương Tấn Nhựt, 2006) 1.4.4 Nhân giống in vitro phát sinh hình thái thân gỗ kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào Cùng với phát triển công nghệ sinh học, ngành công nghiệp rừng phát triển mạnh mẽ Điều có nhờ tiến công nghệ gen, công nghệ tế bào nhanh chóng áp dụng vào thực tiễn sản xuất Hiện nay, 116 biến đổi gen thử nghiệm toàn giới gia tăng đáng kể từ năm 1995, ban đầu bảo trợ quyền giới khoa học Hoa Kỳ châu Âu, sau đảm nhận khu vực tư nhân châu Mỹ, châu Phi Đông Nam Á Các biến đổi gen trồng Indonesia, Chile, Brazil Trung Quốc Cây gỗ loài thân gỗ khác nguồn cung cấp gỗ, nhựa, trái cây, hợp chất thứ cấp, tinh dầu,…; quan trọng hơn, chúng có nhiều giá 31 trị trồng trọt trang trí Những loài khác khoai mì nằm nhóm lương thực với lúa khoai tây, lương thực khắp giới Những đóng vai trò quan trọng chiến lược chống lại xói mòn, ô nhiễm làm ấm toàn cầu (Dương Tấn Nhựt, 2006) Trước đây, việc nhân giống thân gỗ chủ yếu dựa vào kỹ thuật cắt cành, kỹ thuật nuôi cấy in vitro gặp nhiều khó khăn Khó khăn kiểm soát môi trường nhân tố dinh dưỡng in vitro xem “tính ngoan cố” điều khiển kiểu di truyền, cộng với tốc độ tăng trưởng chậm làm cho trình chọn lọc chuyển gen làm nguyên liệu trở nên phức tạp Tuy nhiên, kỹ thuật TCL đời chứng tỏ hệ thống ưu việt việc cảm ứng hình thành quan in vitro loài thân gỗ tre, khoai mì, thông, hông, dương, hoa hồng Kỹ thuật TCL phá vỡ khái niệm trước hạn chế vi nhân giống hay “tính ngoan cố” Bởi rừng thân gỗ có chu trình sống dài nên việc cảm ứng phát sinh phôi sinh dưỡng có ý nghĩa to lớn việc áp dụng thương mại cho lĩnh vực lâm nghiệp, cung cấp đồng di truyền, loại trừ biến dị dòng sinh dưỡng, giảm rủi ro Điều có tiềm to lớn, đặc biệt công nghệ di truyền hướng đến cải tiến chất lượng bổ sung chất gỗ, làm tăng tốc độ tăng trưởng, tính kháng thuốc trừ cỏ, kháng côn trùng, tính đồng sản phẩm cô lập carbon (Dương Tấn Nhựt, 2006) 1.5 Một số nghiên cứu nhân giống in vitro Cọc rào Nhằm đáp ứng nhu cầu to lớn thị trường, nhà khoa học tiến hành nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro, tìm hiểu yếu tố ảnh hưởng đến trình tái sinh chồi chúng Để tái sinh chồi JCL, lá, đốt thân hạt thường sử dụng để làm vật 32 liệu ban đầu Hầu hết thí nghiệm sử dụng môi trường MS (Murashige and Skoog 1962) có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật auxin cytokinin, riêng lẻ phối hợp Nguồn auxin IBA, NAA IAA, nguồn cytokinin chủ yếu gồm BA, TDZ kinetin Auxin cytokinin cần cho tạo chồi in vitro từ JCL Tuy nhiên, tùy theo chất, nồng độ tỷ lệ kết hợp chúng cho kết khác Năm 1995, Sujatha cs tiến hành nuôi cấy trụ thượng diệp, cuống mảnh Các trồng vermiculite vô trùng 26-28oC ánh sáng (30 μmol/m2/s), sử dụng ánh sáng huỳnh quang trắng, mát Các mẫu trụ thượng diệp cắt từ tuần tuổi Cuống lấy từ đốt và cắt từ đốt tính từ nhánh năm tuổi Kết cho thấy: (1) môi trường bổ sung BA kết hợp IBA cho tần số tái sinh từ trụ thượng diệp cuống cao so với bổ sung zeatin kinetin; (2) thứ có khả tái sinh cao thứ 4; (3) tạo chồi bất định trực tiếp môi trường MS + 0,5 mg/l BA + 1,0 mg/l IBA với ba loại mẫu; (4) tái sinh qua trung gian mô sẹo trụ thượng diệp đạt hiệu môi trường MS + 0,5 mg/l BA + 0,1 mg/l IBA, cuống MS +0,1 mg/l BA + 0,1 mg/l IBA, với mẫu MS + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA; (5) MS chất điều hòa sinh trưởng môi trường thích hợp cho tạo rễ Năm 2004, Sujatha cs tiến hành nuôi cấy đốt thân mảnh lá 3-4 tính từ cắt từ JCL tháng tuổi Sự thích hợp môi trường BA- IBA cho tái sinh chồi bất định từ JCL trước báo cáo (Sujatha Mukta 1996; Prabakaran Sujatha 1999; Sujatha Prabakaran 2003) nồng độ cho hiệu tối ưu tái sinh chồi khác nhau, tùy theo kiểu gen Môi trường cho tái sinh chồi 33 bất định từ mảnh JCL môi trường MS bổ sung BA (1,010,0 mg/l) 1,0 mg/l IBA, môi trường nuôi cấy phụ bổ sung 0,5 mg/l BA 1,0-2,0 mg/l BA kết hợp với 0,5 mg/l IBA Các chồi tạo rễ môi trường MS1/2 bổ sung 5,4 μM NAA pH môi trường điều chỉnh 5,6 ± 0,1, hấp 104 kPa 120oC 20 phút Các mẫu cấy đặt điều kiện 26 ± 2oC với 16h/8h sáng/tối, sử dụng ánh sáng huỳnh quang trắng, mát (30 μmol/m2/s) Kết nuôi cấy mẫu đốt môi trường bổ sung ba loại cytokinin nồng độ khác dẫn đến đáp ứng khác Sau tháng, môi trường chính, số cụm chồi nhú lên 1-3 cụm Các đốt nuôi cấy môi trường với Kn cho thấy dấu hiệu đáng kể biệt hóa mẫu ngoại trừ xuất chồi với nhân kéo dài chồi có sẵn thành chồi đơn Tuy nhiên, trường hợp môi trường bổ sung 5,0 mg/l Kn, số chồi/mẫu đạt 2-4, với số chồi trung bình/mẫu đốt 3,3 Chiều dài chồi tăng lên với gia tăng nồng độ Kn Môi trường bổ sung BA kích thích phát triển mô sẹo trắng xanh lục phần chân với chồi biệt hóa tốt từ chồi bên Chiều dài chồi giảm tăng nồng độ BA Những khác biệt đáng kể thấy rõ nuôi cấy phụ mẫu đốt nuôi cấy nồng độ cytokinin khác (BA 1,0-2,0 mg/l) Trên môi trường bổ sung 1,0 mg/l BA, nhân chồi hiệu với mẫu chuyển từ môi trường có TDZ BA, với môi trường có Kn lại không hiệu Số chồi/mẫu đạt tối đa (4,0) đốt chuyển từ 1,0 mg/l BA Các mẫu đốt cho thấy đáp ứng tích cực cấy chuyền sang môi trường có 2,0 34 mg/l BA hệ số nhân đạt cao so với 1,0 mg/l BA Tần số tái sinh chồi đạt tối đa (10-12,3 chồi/đốt) đốt nuôi cấy ban đầu môi trường có bổ sung 0,5-1,0 mg/l TDZ Các mẫu đốt chuyển sang từ môi trường bổ sung BA Kn tạo chồi từ nách, mẫu đốt chuyển sang từ môi trường có TDZ biệt hóa chồi cách trực tiếp mà không cần qua trung gian mô sẹo Những đốt nuôi cấy phụ từ môi trường bổ sung TDZ tiếp tục nuôi cấy phụ lên đến lần thứ ba tiếp tục tạo chồi Việc nuôi cấy chồi bên 12 tuần bao gồm lần nuôi cấy phụ, tạo 4, 10 24 chồi đốt từ mẫu nuôi cấy ban đầu môi trường có Kn, BA TDZ, theo thứ tự Trong trường hợp JCL, TDZ tỏ hiệu BA việc tái sinh chồi từ nách Đáp ứng mang tính biệt hóa hai hệ thống cytokinin có lẽ kết tương tác tương quan kiểu mô nồng độ chất điều hòa tăng trưởng nội sinh (George 1993) Kết tái sinh chồi bất định mẫu cho thấy mô sẹo trắng trắng xanh lục phát triển phần rìa cắt Các chồi bất định phát sinh trực tiếp từ vùng bên cạnh mô sẹo cảm ứng Các chồi (3-11 chồi/mẫu) quan sát tuần đầu nuôi cấy Đối với môi trường chính, tần số tái sinh chồi tối đa ghi nhận môi trường bổ sung 5,0 mg/l BA (+ 1,0 mg/l IBA) Nuôi cấy phụ mẫu thực môi trường bổ sung 0,5 mg/l BA 1,0-2,0 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA dẫn đến biệt hóa chồi Trong loại môi trường này, môi trường bổ sung BA IBA cho tần số tái sinh chồi cao Tần số tái sinh đạt tối đa (80-90%) với mẫu nuôi cấy ban đầu môi trường có 2,0 10,0 mg/l BA kết hợp với 1,0 mg/l IBA chuyển sang môi trường có 2,0 mg/l BA 0,5 mg/l IBA Nếu không kể đến môi trường mẫu nuôi cấy môi trường có 2,0 mg/l BA 1,0 mg/l IBA cho tần số tái sinh cao 35 tất môi trường nuôi cấy phụ 1.6 SỰ PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MẪU CẤY LÁ CÂY Cọc rào Mẫu cấy Cọc rào nuôi cấy môi trường WPM có bổ sung Kinetin kết hợp với IBA 2,4-D nồng độ khác để cảm ứng hình thành mô sẹo có khả phát sinh phôi Trên môi trường có bổ sung 1,5 – 2,0 mg/l Kinetin kết hợp với 0,5 mg/l 2,4-D có xuất khối mô sẹo mềm, dễ vỡ vụn với số cấu trúc hình cầu giống phôi có màu kem sáng Ảnh hưởng thành phần khoáng đa lượng khác lên khả phát sinh phôi vô tính Dầu mè nghiên cứu Thành phần khoáng đa lượng môi trường MS tỏ hiệu việc cảm ứng hình thành khối tiền phôi hình cầu Những khối tiền phôi cấy chuyển sang môi trường có nồng độ Kinetin 2,4-D thấp để cảm ứng biệt hóa trưởng thành phôi Phôi vô tính Dầu mè nảy mầm phát triển thành hoàn chỉnh môi trường MS½ không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật Cây có rễ hoàn chỉnh phát triển mạnh nhờ gieo từ hạt Trong nghiên cứu trước đây, số yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh hình thái Dầu mè in vitro khảo sát nhờ loại mô dùng làm mẫu cấy, vị trí lấy mẫu, tuổi sinh lý mẫu cấy, nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật, thành phần môi trường nuôi cấy,… (Sujatha Mukta, 1996; Sardana cs., 2000; Rajore Batra, 2005; Jha cs., 2007; Shrivastava, Banerjee 2008) Trong đó, mẫu cấy đoạn thân có mang chồi bất định xem nguyên liệu tốt để tái sinh in vitro có tỉ lệ nhiễm thấp, giúp giảm đáng kể biến dị sinh dưỡng hệ số nhân giống đạt không cao Phương pháp phát sinh phôi vô tính công cụ mạnh ngành Công nghệ 36 sinh học áp dụng để nhân giống nhiều loại trồng khác Việc ứng dụng phương pháp phát sinh phôi vô tính Dầu mè hứa hẹn mang lại nhiều ưu điểm tạo số lượng lớn có chất lượng tốt thời gian ngắn Trong báo này, nghiên cứu ảnh hưởng Kinetin kết hợp với IBA 2,4-D lên hình thành mô sẹo có khả phát sinh phôi từ mẫu cấy Dầu mè Ảnh hưởng thành phần khoáng đa lƣợng khác môi trƣờng nuôi cấy lên phát sinh phôi vô tính Dầu mè khảo sát Cây in vitro chuyển vườn ươm để đánh giá khả sống sót hoàn thiện quy trình nhân giống Dầu mè thông qua đường phát sinh phôi vô tính từ mẫu cấy trưởng thành với hệ số nhân giống đạt tương đối cao Vật liệu phương pháp Vật liệu Vật liệu thí nghiệm Dầu mè Ấn độ đƣợc trồng vườn giống Viện Sinh Học Nhiệt Đới thuộc Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam Phương pháp Khử trùng mẫu cấy Lá đặt dƣới vòi nước chảy 30 phút sau tiến hành rửa bề mặt xà phòng loãng (Viso, Việt Nam) rửa lại nước cất vô trùng Sau đó, khử trùng dung dịch Javel 7% thời gian 15 phút rửa lại lần nước cất vô trùng Ảnh hưởng auxin cytokinin lên hình thành mô sẹo có khả phát sinh phôi Lá cắt thành mảnh nhỏ nuôi cấy môi trường WPM (Lloyd, McCown, 1980) có bổ sung 30 g/l sucrose, g/l agar, Kinetin (0,1 – 2,0 mg/l) kết hợp với IBA (0,1 – 1,0 mg/l) 2,4-D (0,1 – 1,0 mg/l) pH môi trường điều chỉnh 5,8 trước hấp khử trùng nhiệt độ 121ºC, áp suất 37 atm thời gian 30 phút Các mảnh nuôi điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày nhiệt độ 22 ± 2ºC Ảnh hưởng khoáng đa lượng lên hình thành mô sẹo có khả phát sinh phôi Bảy loại môi trường khác có chứa thành phần khoáng đa lượng MS, MS½ (Murashige Skoog, 1962), WPM (Lloyd McCown, 1980), B5 (Gamborg cs., 1968), White (White, 1963), SH (Schenk Hildebrandt, 1972), Nitsch (Nitsch Nitsch, 1969) sử dụng Mỗi môi trường bổ sung thành phần vi lượng vitamin MS, 100 mg/l myo-inositol, 3% sucrose, 1,5 mg/l Kinetin 0,5 mg/l 2,4-D Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên phát triển mô sẹo có khả phát sinh phôi Mô sẹo có khả phát sinh phôi cấy chuyền sang môi trường MS có bổ sung 1,5 mg/l Kinetin 0,5 mg/l 2,4-D với điều kiện nuôi cấy khác nhau: bán rắn (bổ sung g/l agar), lỏng tĩnh (không bổ sung agar), lỏng lắc (không bổ sung agar, lắc với tốc độ 120 vòng/phút) Bảng Thành phần ion môi trường sử dụng (theo George Sherrington, 1984) Sự trưởng thành, biệt hóa nảy mầm phôi vô tính Mô sẹo với khối tiền phôi đƣợc tách thành cụm nhỏ cấy sang môi trƣờng MS có bổ sung 1,0 mg/l Kinetin kết hợp với 2,4-D nồng độ khác (0 – 1,0 mg/l) Tách phôi giai đoạn mầm nảy chồi khỏi đám mô sẹo cấy sang môi trƣờng tái sinh (môi trƣờng MS½ không bổ sung chất điều hòa tăng trƣởng thực vật) Xử lý thống kê Các thí nghiệm đƣợc thiết kế theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên Mỗi 38 thí nghiệm đƣợc lặp lại lần, số liệu đƣợc xử lý phần mềm Statgraphics Centurion XV theo phƣơng pháp DMRT (Ducan, 1995) mức ý nghĩa 5% Hình Mô sẹo từ Dầu mè môi trƣờng điều kiện nuôi cấy khác a1 Mô sẹo môi trƣờng WMP không bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng thực vật; a2.Mô sẹo môi trƣờng WMP + 1,5 mg/l Kinetin + 0,5 mg/l IBA; a3.Mô sẹo môi trƣờng WMP + 1,5 mg/l Kinetin + 0,5 mg/l 2,4-D; b1.Mô sẹo môi trƣờng bán rắn; b2.Mô sẹo môi trƣờng lỏng tĩnh; b3.Mô sẹo môi trƣờng lỏng lắc 39 Hình Sự trƣởng thành, biệt hóa nảy mầm phôi vô tính Dầu mè a1 Phôi hình cầu; a2 Phôi hình tim; a3 Phôi hình thủy lôi; a4 Phôi giai đoạn mầm; b Hình thái giải phẫu phôi vô tính Dầu mè; c Cây nảy mầm từ phôi; d Cây vƣờn ƣơm 40 [...]... như chọn lọc cây chuyển gen làm nguyên liệu trở nên phức tạp Tuy nhiên, kỹ thuật TCL ra đời đã chứng tỏ đây là một hệ thống ưu việt trong việc cảm ứng sự hình thành cơ quan in vitro của các loài cây thân gỗ như cây tre, cây khoai mì, cây thông, cây hông, cây dương, hoa hồng Kỹ thuật TCL phá vỡ những khái niệm trước đây về sự hạn chế vi nhân giống hay “tính ngoan cố” Bởi vì các cây rừng và cây thân gỗ... tháng 7, mỗi lần bón NPK khoảng 100g /cây, bón vào gốc theo chiều thẳng đứng của tán cây d Quản lý nước: Jatropha chịu hạn, nhưng không chịu ngập úng Khi hạn gay gắt nên có tưới nước, nhưng mưa nhiều phải tiêu nước đọng không để thối rễ 5 Chăm sóc vườn cây trưởng thành a Tạo tán cây: Sau trồng 1-2 năm, cây ra quả, sau 3-4 năm đã bước vào thời kỳ năng suất cao Khi cây trưởng thành vào tháng 11-12 hàng... Phi và Đông Nam Á Các cây biến đổi gen đã được trồng ở Indonesia, Chile, Brazil và cả Trung Quốc Cây gỗ và các loài thân gỗ khác là một nguồn cung cấp gỗ, nhựa, trái cây, các hợp chất thứ cấp, tinh dầu,…; quan trọng hơn, chúng còn có nhiều giá 31 trị về trồng trọt và trang trí Những loài khác như cây khoai mì cùng nằm trong nhóm các cây lương thực với lúa và khoai tây, đây là những cây lương thực chính... của dân, không ảnh hưởng tới vấn đề an toàn lương thực tại các vùng triển khai dự án Ngược lại sẽ có tác động cải tạo môi trường đất đai, và mang lại nguồn thu nhập ổn định cho cộng đồng người nông dân thông qua việc gây trồng JCL Với tập hợp 8 xuất xứ thu thập được và 29 cây trội tuyển chọn được trong năm 14 2007, đề tài đã xây dựng thiết lập vườn tập hợp các giống, cây trội và tiến hành khảo nghiệm... 15cm đất rồi đặt cây con xuống hốc Nếu có điều kiện thì tưới ẩm Nếu không có nước tưới thì trồng vào lúc đất ẩm và sau khi trồng nén gốc, có đủ rác để giữ ẩm 4 Chăm sóc cây non a Làm cỏ: Sau trồng năm đầu, phải làm cỏ 1-2 lần, trong những năm sau chỉ cắt cỏ để che phủ gốc b Phòng trừ sâu bệnh: Jatropha rất ít bệnh, nhưng khi cây còn non dễ bị sâu xám và một loại sâu khác cắn rễ và thân cây non, cần dùng... suất 10 tấn hạt/ha/năm thì 1 ha JCL đạt doanh thu tới 35 triệu VND/năm 11 Cây JCL trồng được trên mọi loại đất, kể cả vùng sa mạc nóng bỏng ở Ai Cập, JCL vẫn phát triển tốt Ở các vùng đất dốc, đất nghèo kiệt, không trồng được các loại cây nông nghiệp khác, cây JCL vẫn phát triển tốt Chu kỳ kinh tế của cây này là 30 – 50 năm Cây JCL còn cho sản phẩm phụ là phân hữu cơ, thức ăn chăn nuôi giàu đạm (sau... đang phát triển mạnh cây JCL Thái Lan hiện có 1600 ha JCL, dự kiến sẽ tăng lên 320 nghìn ha trong vài năm tới Indonesia đặt mục tiêu đến năm 2010, nhiên liệu sinh học đáp ứng 20% nhu cầu năng lượng trong ngành điện và giao thông vận tải Ở nước này, các loại đất màu mỡ đều dành để trồng cây Cọ dầu, còn cây JCL sẽ trồng trên các loại đất khô cằn nhưng mức đầu tư chỉ bằng 10% so với cây Cọ dầu Nhà khoa... học kỹ thuật Đà Nẵng, và đã có kết quả ứng dụng bước đầu đáng khích lệ Trong năm 2007, đề tài “Nghiên cứu gây trồng phát triển cây Cọc rào (Jatropha curcas)” do Trung tâm Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam thực hiện (2007 – 2010) đã thu thập được 8 xuất xứ hạt JCL và tuyển chọn được 29 cây trội với các đặc tính vượt trội về sinh trưởng, năng suất hạt (2,8-5,0 kg/năm) và... 2) Để quản lý được vườn cây con ở thời điểm sau thanh minh làm như sau, giao giống cho các hộ gia đình theo diện tích đăng ký, hướng dẫn ươm tại vườn của từng gia đình trước khi đem trồng, thời gian ươm từ ngày ươm đến ngày đem trồng từ 30 – 40 ngày cây cơ bản đã hoá gỗ và đảm bảo khi trồng tỷ lệ sống không dưới 95%, lưu ý trước khi trồng buộc phải luyện cây non 25 Nếu trồng cây non ươm trong bầu thì... cháy một cách sạch sẽ và sạch hơn bất kỳ một loại chất đốt diesel nào khác Cây JCL trồng được trên đất bị thoái hóa, sau 10 – 15 năm, có thể tái sử dụng diện tích này để trồng các loại cây khác vì cây JCL đã chặn đứng được tình trạng rửa trôi GS Klause Becker còn cho rằng: “ Ai có thể nói lên được những cái xấu, cái bất lợi của cây JCL, tôi xin thưởng tiền cho người đó Các vị có thể vặn vẹo đủ thứ, lật