Báo cáo môn công nghệ hợp chất nano hữu cơ đề tài liposome

Báo cáo môn công nghệ hợp chất nano hữu cơ đề tài liposome

Môn Công nghệ hợp chất Nano hữu cơ

LIPOSOMENHÓM 3

GVHD: TS Lê Thị Hồng Nhan

MỤC LỤC:

MỤC LỤC: 1

BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC:

1 Thuyết trình bằng Power Point và soạn nội dung trong file Word:

- Phần I: Phạm Huỳnh Minh Trang;

- Phần II: Đặng Thị Tuyết Vân;

- Phần III: Trần Thị Thùy Trang

2 Tổng hợp, chỉnh sửa và trình bày Power Point, Word:

Phạm Huỳnh Minh Trang

3 Tìm tài liệu và trả lời câu hỏi thuyết trình: cả nhóm

I CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT CỦA LIPOSOME:

1 Liposome là gì?

- Liposome là những tiểu phân hình cầu có kích thước nano, có màng gồm hai lớpphospholipid, bao gồm hai dạng phospholipid tự nhiên và tổng hợp, với một đầuphân tử hòa tan được trong nước, đầu kia của phân tử không hòa tan trong nước

- Có khả năng lưu trữ các chất ưa nước trong khoang chứa nước (Aqueous cavity)

và các loại thuốc kỵ nước trong màng

- Tránh được sự hòa tan của thuốc trong nước

- Liposome có cấu trúc hoàn toàn tương tự với màng tế bào nhưng hình dạng khácnhau

2 Cấu trúc của màng tế bào trong cơ thể động vật có vú như thế nào?

- Màng tế bào (cell membrane): Màng có chức năng bao bọc và phân tách tế bào

với môi trường xung quanh Màng được cấu thành bởi một lớp lipid kép và cácprotein Các phân tử protein hoạt động như các kênh vận chuyển và bơm đượcnằm khảm vào lớp lipid một cách linh động (có thể di chuyển tương đối)

- Năm 1972, hai nhà khoa học là Singer và Nicolson đã đưa ra mô hình cấu trúcmàng sinh chất gọi là mô hình khảm - động Theo mô hình này, màng sinh chất cólớp kép phospholipid Liên kết phân tử protein và lipid còn có thêm nhiều phân tửcarbonhydrat Ngoài ra, màng sinh chất ở tế bào động vật còn có thêm nhiều phân

tử cholesterol có tác dụng tăng cường sự ổn định Màng sinh chất là ranh giới bênngoài và là bộ phận chọn lọc các chất từ môi trường đi vào tế bào và ngược lại.Màng sinh chất đảm nhận nhiều chức năng quan trọng của tế bào như: vận chuyểncác chất, tiếp nhận và truyền thông tin từ bên ngoài vào trong tế bào, là nơi định vịcủa nhiều loại enzim, các protein màng làm nhiệm vụ ghép nối các tế bào trongmột mô Màng sinh chất có các "dâu chuẩn" là glycoprotein đặc trưng cho từngloại tế bào Nhờ vậy, các tế bào của cùng một cơ thể nhận biết ra nhau và nhậnbiết được các tế bào lạ của cơ thể khác

3 Sự tự đóng gói của Liposome:

Tính chất vật lý, hóa học chủ yếu của Liposome như tính thấm, mật độ điện tích

và sự cản trở không gian của Liposome dựa trên các tính chất của các phân tửPhospholipid đơn phân cấu tạo nên nó Các phân tử Phospholipid có khả năng tự đónggói lại, hình thành lớp màng phospholipid kép nhờ tính phân cực của chính các phân tửphospholipid Quá trình hình thành Liposome được cho là tự phát, bởi lẽ các phân tửphospholipid có khả năng tự kết hợp thêm vào lớp màng phospholipids kép đã hoặc đangđược tổng hợp nhờ tương tác kị nước Tức là đầu photphat-choline tích điện sẽ hướng vềphía trong hay phía ngoài Liposome - nơi có các phân tử nước, còn các đầu lipid kị nước

sẽ quay vào nhau để tránh sự tiếp xúc với các phân tử nước

4 Kích thước của Liposome:

Kích thước của Liposome có thể từ vài chục nanomet đến vài chục micromet, phụthuộc vào cách tạo ra nó

5 Thành phần chính của Liposome:

- Thành phần chính của Liposome gồm phospholipid và sterol

- Phospholipid là thành phần cấu trúc chính trong màng sinh học và màng tế bào

- Các phospholipid phổ biến nhất trong màng sinh học là:

o Phosphoglycerides: trung hòa về điện;

o Sphingolipid: có sự phân cực

- Sterol: gần như không phân cực Điển hình là các cholesterol.

Vai trò của nó:

o Tăng tương tác không phân cực giữa các phân tử phospholipid, nhờ đó tăng

độ bền của màng tế bào và giảm khả năng thấm qua màng phospholipid(không cho phân tử lạ thấm qua)

o Làm tăng độ bền của màng tế bào trong các cơ thể sống

Ảnh hưởng của sterol (cholesterol) lên tính ổn định của Liposome:

o Hầu như không phân cực => Tăng tương tác kỵ nước giữa các lớpphospholipid kép => Giảm tính lưu động (tính lưu biến) của màng

o Giảm tính thấm qua màng của các lớp phospholipid kép

 Tăng tính ổn định cho Liposome

6 Phân loại Liposome: dựa vào kích thước của nó.

II CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ LIPOSOME:

Có rất nhiều phương pháp để điều chế hệ Liposome Tuy nhiên các phương phápnày đều bao gồm các giai đoạn cơ bản sau:

- Làm khô lipid trong dung môi hữu cơ,

- Phân tán lipid vào môi trường dung môi nước,

- Làm tinh sạch và phân tích hệ Liposome thu được

Hiện nay, để điều chế Liposome, người ta thường sử dụng một số phương phápsau:

- Phương pháp hydrate hoá màng mỏng;

- Phương pháp phun dung môi hữu cơ;

- Phương pháp bay hơi pha đảo;

- Phương pháp loại bỏ dung môi

Ngoài ra còn rất nhiều các phương pháp khác hoặc phương pháp kết hợp từ cácphương pháp trên

1 Phương pháp Hydrate hóa màng mỏng:

Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất hiện nay để tạo Liposome.Phương pháp này tương đối đơn giản nhưng theo kết quả của nhiều nghiên cứu cho thấyhiệu quả mang thuốc của nó khá cao so với các phương pháp khác Như hình bên dưới,ban đầu lipid được hoà tan trong hệ dung môi Tiến hành cô quay hệ dung dịch này đểlàm bay hơi dung môi, tăng dần nồng độ lipid trong hệ Các phân tử lipid theo cơ chế tựhợp sẽ tạo thành các lớp màng lipid mỏng Sau khi làm bay hơi hết dung môi, người tatiến hành hydrate hoá lớp màng mỏng lipid này bằng dung dịch đệm hoặc dung dịchmang thuốc Quá trình này được tiến hành bằng cách khuấy trộn để tạo được cácLiposome có kích thước lớn và các Liposome đa lớp Để làm nhỏ các hạt này và tạoLiposome đơn lớp, người ta còn phải áp dụng thêm các phương pháp khác như: dùngsóng siêu âm, qua màng đùn, đồng hoá…

Trong phương pháp này, tuỳ vào bản chất của thuốc mà người ta có thể đưa thuốcvào Liposome ở các giai đoạn khác nhau như hình bên dưới Thuốc thuộc hệ ưa dầu sẽđược hoà tan cùng với lipid trong dung môi ở giai đoạn đầu Hiệu suất mang thuốc khácao, có thể gần đạt 100 % Tuy nhiên, nếu thuốc là hệ ưa nước sẽ được hoà tan với dungdịch đệm dùng để hydrate lớp màng lipid Trong trường hợp này, hiệu suất thu được sẽkhông cao < 30 % [1]

Hình: Sơ đồ phương pháp hydrate hóa màng mỏng

2 Phương pháp bay hơi pha đảo:

Phương pháp này có ưu điểm rất lớn là nâng cao hiệu suất đưa thuốc ưa nước vàoLiposome, có thể đạt tới 80 % [1]

Hình: Sơ đồ phuơng pháp bay hơi pha đảo

Trong phương pháp này, lipid đóng vai trò như chất hoạt động bề mặt để phân tánpha nước chứa thuốc vào dung môi không phân cực Sau quá trình khuấy trộn, người tatạo được hệ micell các hạt lipid bao gói dung dịch thuốc bên trong Tiến hành cô quaydung dịch này để bay hơi hết dung môi hữu cơ, các micell sẽ tụ hợp với nhau tạo thànhcác lớp gel Tiến hành hydrate hoá gel này ta thu được hệ Liposome mang thuốc

3 Phương pháp phun dung môi hữu cơ:

Hình: Phương pháp phun dung môiPhương pháp phun dung môi hữu cơ có khả năng ứng dụng tạo Liposome mangthuốc ở quy mô lớn Tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm là: do phải tiếp xúc trựctiếp với dung môi có thể làm ảnh hưởng đến hoạt tính của thuốc Ngoài ra, rất khó để loại

bỏ hoàn toàn dung môi ra khỏi hệ Liposome [1]

Hình: Sơ đồ phương pháp ép đùn

Trong phương pháp đùn qua màng, hệ Liposome sẽ được ép đùn qua màng có kíchthước lỗ màng 0.2 – 0.4 μm Quá trình này có thể đồng thời vô trùng được hệ Liposome mang thuốc ứng dụng trong sản xuất các loại thuốc tiêm Bên dưới là hình ảnh hệ

Liposome trước và sau khi qua ép đùn Sau khi qua ép đùn hệ sẽ có kích thước nhỏ và đồng nhất hơn [3]

Hình: a) chưa ép đùn, b) ép qua màng 0.4μm c) ép qua màng 0.2μm

5 Một số ví dụ điều chế Liposome:

Trong nghiên cứu của Shuoye Yang, Jiayin Chen, Di Zhao, Deen Han, Xijing Chen, so sánh các phương pháp điều chế DC-Chol/DOPE Liposomes và tối ưu hiệu suất bao gói thuốc (2012), Liposome được điều chế theo 3 phương pháp [5]

- Làm khô màng mỏng (dry film): 20 mol lipid được hoà tan trong 5 ml chloroform

- Và dung dịch được cô quay trong 50 phút ở 45oC Sau khi lớp màng khô hìnhthành, người ta dùng khí N2 để loại bỏ hoàn toàn dung môi Màng lipid đượchydrate hoá bằng nước khử ion và phân tán bằng máy votex Hệ sau đó được đánhsiêu âm

- Bay hơi pha đảo: Hỗn hợp 20 mol DC-Chol/DOPE được hoà tan trong

Chloroform Nước khử ion được đưa vào để tạo hệ nhũ hoá và dung môi được loại

bỏ bằng phương pháp cô quay

- Phun ethanol: 20 mol lipid được hoà tan trong 4 ml ethanol Sau đó tiến hành cô quay loại bỏ ethanol đến khi hỗn hợp còn lại 2 ml Cho vào một lượng nước khử

ion Liposome sẽ hình thành sau quá trình cô quay liên tục để loại bỏ ethanol Hệ Liposome cuối cùng sẽ được ép đùn qua màng kích thước 0.2 μm.

Ta có hình ảnh hệ Liposome chụp qua kính hiển vi điện tử và các kết quả phân tích liên quan bên dưới Cả ba phương pháp đều cho hình thái Liposome gần tương tự như nhau Tuy nhiên qua bảng kết quả có thể nhận thấy phương pháp hydrate màng mỏngcho Liposome kích thước nhỏ nhất và có tính ổn định cao nhất

Bojana D Isailović, Ivana T Kostić, Alenka

Hình: Ảnh chụp TEM Liposome A (DF), B (RPE), C (EI)

Zvonar, Verica B Đorđević,

Trong một nghiên cứu khác của Mirjana Gašperlin,Viktor A Nedović, Branko M Bugarski Các kỹ thuật điều chế Liposome mang Resveratrol Innovative (2013),

Resveratrol là một loại thuốc thuộc hệ ưa dầu được bao gói vào Liposome bằng 2 phươngpháp Ta có bảng tóm tắt phương pháp điều chế Liposome ở bên dưới [6]

Kết quả cho thấy cả 2 phương pháp đều cho hiệu suất bao gói thuốc cao > 90% Tuy nhiên phương pháp dùng sóng siêu âm để đồng nhất hệ Liposome làm giảm hiệu suất bao gói thuốc xuống còn khoảng 40 – 50 % Trong khi phương pháp ép đùn qua màng gần như không làm ảnh hưởng đến hiệu suất bao gói thuốc Điều này được lý giải

do năng lượng cao từ sóng siêu âm làm rò rỉ thuốc ra khỏi bề mặt Liposome [6]

III CƠ SỞ ỨNG DỤNG LIPOSOME TRONG DẪN TRUYỀN THUỐC:

1 Các thế hệ Liposome:

Thế hệ Liposome đầu tiên là Liposome cổ truyền (Conventional Liposome, C

Liposome) C Liposome không bền vững trong dịch sinh học và dẫn thuốc không hiệu

quả C Liposome được xem là các hạt “ngoại lai” và được hấp thu vào tế bào của hệ

thống thực bào đơn nhân (Mononuclear Phagocytic System, MPS) Phần lớn MPS là các

tế bào Kuffer ở gan và đại thực bào của lá lách Do không bền vững trong dịch sinh họcnên C Liposome phóng thích nhanh các phân tử đã được kết nang ở bên trong nhờ sựtương tác qua lại với hai nhóm protein plasma là HDL và opsonin đã hấp thu lên bề mặtLiposome HDL và opsonin đóng vai trò là các chất trung gian cho sự nhập bào củaLiposome bởi MPS Vì vậy tốc độ thanh thải của Liposome từ sự tuần hoàn máu phụthuộc vào khả năng bám vào bề mặt Liposome của opsonin Mặt khác sự thanh thải củaLiposome từ dòng máu phụ thuộc vào các đặc tính của Liposome như trạng thái lỏng củalớp màng kép, bề mặt và kích thước của túi Khuynh hướng rõ rệt của C Liposome là bịhút vào các tế bào đích của MPS Ðiều này là rất thuận lợi cho việc phân phối thuốc đếncác đại thực bào nhưng lại cản trở sự sử dụng Liposome trong cơ thể để dẫn thuốc mộtcách chọn lọc đến các vị trí khác C Liposome bị hấp thu bởi các tế bào MPS đã hạn chế

sự phát triển của Liposome trong việc làm phương tiện dẫn thuốc trong nhiều năm qua

Sau nhiều công trình nghiên cứu khác nhau, các Liposome với độ bền cao đã đượctạo ra Liposome cấu tạo từ lipid có nguồn gốc từ polyethylene glycol (PEG) với các đặctính tránh được sự hấp thụ của MPS và tăng thời gian lưu thông trong tuần hoàn máu,Liposome “khéo léo” có thể chịu được các sửa đổi một cách đặc biệt của màng kép hoặc

có thể được bao phủ với các phân tử khác nhau Các loại Liposome này bao gồm proteo

Liposome, mang protein kích thích dung hợp; Liposome nhạy cảm với pH (pH-sensitive

Liposome), có khả năng tránh được sự phân hủy của lysosome; Liposome cation (cationic Liposome), tạo ra các phức hợp với DNA; Liposome nhạy cảm với tế bào đích (target sensitive Liposome), không hợp nhất sau khi bám vào tế bào đích và giải phóng

vật chất chứa bên trong vào vùng lân cận tế bào này; Liposome miễn dịch (immune

Liposome), điều khiển các vị trí đặc hiệu bởi các kháng thể ghép đôi (coupling antibody)

tới các bề mặt của chúng

2 Liposome lưu thông lâu dài:

Như đã đề cập ở trên, C Liposome bị hấp thụ nhanh chóng bởi MPS đã hạn chếkhả năng sử dụng đối với các loại tế bào khác Các Liposome nhỏ, cứng, giàu cholesterollàm tăng tính bền vững trong plasma, tránh được sự hấp thụ của MPS đã được cấu trúc

Các phương pháp khác nhằm làm tăng thời gian lưu thông của Liposome trong máu là kếthợp vào Liposome các polyvinyl pyrolidone polyacrylamide lipid, glucoronic acid lipidhoặc phospholipid distearoyl phosphatidylcholine Bao bọc Liposome với protein,polysaccharide và glycolipid của hồng cầu cũng làm tăng thời gian lưu thông trong máucủa chúng

Một cấu trúc khác đã cho thấy thời gian lưu thông trong dòng máu dài hơn làLiposome mang phospholipid kết hợp với một polymer ưa nước tổng hợp (PEG) CácLiposome này là Liposome có cấu trúc không gian bền vững (sterically stabilizedLiposome=SS Liposome) có khả năng giảm thiểu sự hấp thụ của MPS tốt nhất PolymerPEG cản trở sự tương tác qua lại của protein huyết thanh với bề mặt của Liposome do tácdụng kỵ nước và tính linh động của chúng và kết quả là làm giảm sự hấp thụ Liposomecủa các tế bào MPS Sự phát hiện này đã phục hồi lại nhiều hứa hẹn xem Liposome là

“viên đạn kỳ diệu” có thể dẫn thuốc và các gen ngoại lai đến các vị trí đặc hiệu

3 Liposome đích (Targeted Liposome):

Phương pháp có nhiều triển vọng nhất đối với sự chọn lọc tế bào đích củaLiposome với các vị trí đặc hiệu là gắn vào bề mặt của Liposome các phối tử (ví dụ nhưcác kháng thể, đường dư lượng, protein hoặc hormone) có thể nhận ra các phân tử đặchiệu Các kháng thể hoặc các phối tử khác nhau như folate, transferrin, anionizedalbumin, dextran bám vào các thụ quan làm tăng khả năng điều hòa trên bề mặt của tếbào đích Chúng có thể được gắn lên bề mặt của Liposome bằng cách sử dụng các gaidạng neo hoặc đầu mút PEG, xen vào lớp màng kép của Liposome nhờ một chất dẫn xuấtcủa phospholipid

Liposome miễn dịch là Liposome mang trên bề mặt các kháng thể cặp đôi đồnghóa trị, đảm bảo sự phân phối thuốc đến các kháng nguyên bề mặt đặc hiệu Một số kếtquả khả quan đã đạt được trên mô hình động vật trong ống nghiệm và trong cơ thể Mặc

dù đã sử dụng kháng thể người để điều trị ung thư nhưng chúng vẫn chưa được phổ biếnrộng rãi trong lâm sàng Nhiều phân tử đã được phát hiện trên bề mặt tế bào trong cácđiều kiện bệnh lý, vì vậy Liposome miễn dịch được xem là một công cụ chẩn đoán vàchữa bệnh đầy hứa hẹn trong tương lai Tuy nhiên tính bám đặc hiệu của Liposome với tếbào đích không luôn luôn dẫn đến sự phân phối thuốc có hiệu quả Các kháng nguyênđích mà tế bào tiếp thu có thể làm trung gian phân phối thuốc nội bào có hiệu quả Vì vậychiến lược tạo ra Liposome miễn dịch được tối ưu hóa để sự phân phối thuốc và sự tiếpthu nội bào xảy ra

4 Liposome nhạy cảm:

Ðể tránh sự phân hủy của lysosome, Liposome nhạy pH, không ổn định và kíchthích dung hợp ở pH 6 ra đời

Kiểu Liposome này bao gồm một hỗn hợp phosphatidyl ethanolamine (PE) vớiacidic phospholipid Ở pH 6.5, sau khi proton hóa lớp màng kép, PE chuyển phase màngkép thành phase hexagon, không bền, trở nên kích thích dung hợp và giải phóng các chấtchứa trong Liposome vào cytosol Liposome nhạy pH đã được sử dụng một cách thànhcông trong việc làm vector chuyển nucleic acid

b Liposome nhạy nhiệt:

Liposome nhạy với nhiệt đã được tổng hợp từ phospholipid với nhiệt độ chuyểnphase khoảng 40ºC Làm nóng các vị trí mà ở đó Liposome đã được tích lũy, gây ra sựgiải phóng nhanh các chất chứa trong Liposome Loại Liposome này đã được sử dụngthành công trong các mô hình in vitro và động vật nhưng chưa được đưa vào lâm sàngmặc dù sự tăng nhiệt cục bộ đã được sử dụng để điều trị kháng ung thư và nhiệt độ trên40ºC là dễ dàng có được ở các mô khác nhau

c Liposome nhạy với tế bào đích:

Liposome nhạy với tế bào đích đã được tổng hợp thành công nhờ sự bền vững của

PE trong lớp màng kép với các kháng thể có nguồn gốc từ aicd béo (thường là palmiticacid) Sau khi bám vào bề mặt các tế bào đích, sự tập trung của các phân tử globulin miễndịch ở các điểm tiếp xúc làm cho lớp màng kép của Liposome không ổn định Tại vị trínày, các chất chứa trong Liposome được giải phóng vào các vùng lân cận của tế bào đích.Kỹ thuật này đã được sử dụng để phân phối các tác nhân kháng virus

Liposome được sử dụng trong liệu pháp gen, liệu pháp kháng ung thư, điều trị cácbệnh nhiễm trùng, chúng còn được sử dụng như là hệ thống vaccine

Liệu pháp gen là quá trình các trình tự DNA của gen đã biến đổi đặc hiệu đượcđưa đến các tế bào với mục đích chữa bệnh hoặc điều trị bệnh di truyền Vì vậy, thay choviệc điều trị các triệu chứng của bệnh như trong y học cổ truyền, liệu pháp gen có thể sửachữa chính xác nguyên nhân cơ bản của bệnh di truyền Trong khi liệu pháp gen là mộtkhái niệm đơn giản thì sự phân phối gen đến các vùng bị bệnh lại là một nhiệm vụ khókhăn Vấn đề này cùng với sự sử dụng vector virus đối với liệu pháp gen đã dẫn đến sựnghiên cứu hệ thống phân phối không có bản chất virus, ít may rủi Khi lựa chọn vớivector virus, Liposome cation đã được sử dụng để chuyển gen vì chúng không giới hạnkích thước của gen chuyển và có khả năng sinh miễn dịch thấp Hiệu quả của loạiLiposome này bị giới hạn do sự gắn không đặc hiệu với nhiều loại tế bào Ðể chuyển gen