Nghiên cứu lên men một số chủng vi khuẩn cố định đạm Azotobacter ở quy mô phòng thí nghiệm

Nghiên cứu lên men một số chủng vi khuẩn cố định đạm Azotobacter ở quy mô phòng thí nghiệm Nghiên cứu lên men một số chủng vi khuẩn cố định đạm Azotobacter ở quy mô phòng thí nghiệm Nghiên cứu lên men một số chủng vi khuẩn cố định đạm Azotobacter ở quy mô phòng thí nghiệm

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp nỗ lực thân, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành kính trọng đến: PGS.TS Nguyễn Anh Dũng, người trực tiếp hướng dẫn khoa học, tận tình dẫn hoàn thành khóa luận tốt nghiệp TS Võ Thị Phương Khanh trưởng môn sinh học thưc nghiệm, Th.s Nguyễn Văn Bốn cố vấn học tập toàn thầy cô môn sinh học thực nghiệm thầy cô Viện công nghệ sinh học môi trường giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu đóng góp ý kiến quý báu cho hoàn thành khóa luận Các bạn sinh viên lớp Cử nhân Sinh học khóa 2010 – 2014 nhiệt tình giúp đỡ thời gian học tập thực khóa luận Bạn bè, gia đình người động viên tinh thần tạo điều kiện tốt cho học tập hoàn thành khóa luận Do thời gian tương đối hạn hẹp lần làm quen với công việc nghiên cứu khoa học, kiến thức giới hạn nên tránh khỏi thiếu sót Vì mong nhận thông cảm góp ý quý thầy cô bạn Đắk lắk, tháng 5, năm 2014 Sinh viên Hòa Thị Nguyệt ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài Nitơ có vai trò đặc biệt quan trọng sinh trưởng, phát triển trồng Nitơ có thành phần hầu hết chất : protein, axit nucleic, sắc tố quang hợp, hợp chất dự trữ lượng: ADP, ATP, chất điều hoà sinh trưởng ,… Hàm lượng nitơ thành phần chất khô thực vật dao động từ - % Tuy hàm lượng thấp nitơ có vai trò sinh lý đặc biệt quan trọng Thiếu nitơ, sinh trưởng kém, chlorophyll không tổng hợp đầy đủ, vàng, đẻ nhánh phân cành kém, sút giảm hoạt động quang hợp nên suất giảm Nếu thừa nitơ ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng, phát triển suất trồng sinh trưởng mạnh thân tăng nhanh nên yếu, dễ đổ, thu hoạch gặp nhiều khó khăn Như Nitơ vừa có vai trò cấu trúc, vừa tham gia trình trao đổi chất lượng Nitơ có vai trò định đến toàn trình sinh lý trồng Trong tự nhiên, nitơ tạo từ nguồn khác trình amon hóa, trình nitrat hóa,ngoài nguồn nitơ tạo từ trình cố định nitơ phân tử thực nhóm vi sinh vật đất, có đóng góp nhóm vi khuẩn cố định nitơ tự Azotobacter sp Các vi sinh vật thuộc nhóm có khả chuyển hóa nitơ phân tử thành hợp chất chứa nitơ mà trồng có khả hấp thụ Azotobacter sp vi khuẩn cố định nitơ sống tự đất, hiếu khí, không sinh bào tử, Gram âm Khi non tế bào thường có dạng hình que, kích thước khoảng 2,0- 7,0 × 10- 2,5 μm Đã có nhiều công trình nghiên cứu đề cập đến mối quan hệ Azotobacter sp trồng Chúng có tác dụng làm tăng cường nguồn thức ăn nito cho Nhờ đặc tính oxy hóa hiếu khí trình trao đổi chất nên hiệu cố định nito cao nhiều so với nhóm kị khí Trung bình tiêu thụ 1g glucose, Azotobacter sp có khả đồng hóa 10-15mg N Tác dụng Azotobacter sp trồng chứng minh khả tạo chất kích thích sinh trưởng thymine, acid nicotinic, acid pantotenic, biotin Hiện người ta dùng phương pháp lên men để thu lượng lớn sinh khối vi khuẩn Azotobacte sp để phục vụ vào việc tạo chế phẩm phân vi sinh có ích cho sinh trưởng phát triển trồng Đề tài: “Nghiên cứu lên men số chủng vi khuẩn cố định đạm Azotobacter quy mô phòng thí nghiệm” thực nhằm nghiên cứu điều kiện thích hợp cho lên men vi khuẩn cố định đạm Azotobacter Mục tiêu đề tài Xác định điều kiện lên men tối ưu đến việc thu sinh khối vi khuẩn Azotobacter Qua đánh giá hiệu số chủng vi khuẩn Azotobacrer đến sinh trưởng cải Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học - Xác định điều kiện thích hợp cho việc lên men vi khuẩn cố định đạm Azotobacter - Đánh giá vai trò vi sinh vật cố định nitơ tự nhiên sinh trưởng phát triển thực vật 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết đề tài góp phần vào việc áp dụng công nghệ lên men quy mô công nghiệp nhằm thu lượng lớn sinh khối vi khuẩn cố định đạm ứng dụng việc sản xuất phân bón vi sinh Giới hạn đề tài Trong trình thực đề tài thời gian có hạn nên bước đầu đánh giá ảnh hưởng số điều kiện lên men số chủng vi khuẩn Azotobacter Ngoài ra, lần làm công tác nghiên cứu khoa học nên không tránh khỏi thiếu sót Kính mong quí thầy cô bạn góp ý để báo cáo hoàn thiện PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn nitơ tự nhiên Trong nước, nitơ chủ yếu dạng hợp chất NH 4+, NO2-, NO3- Trong đất có dạng nitơ tồn nitơ vô muối khoáng nitơ hữu xác, chất tiết từ sinh vật Các hợp chất chứa nitơ xác, chất tiết động vật thực vật bị số loại nấm vi khuẩn phân giải Trong đất không khí amon chuyển hóa toàn thành hợp chất nitrat Phần lớn hợp chất nitrat thực vật hấp thụ, phần lại bị mưa rửa trôi tác dụng phản ứng nitrat hóa Hợp chất đạm mà thực vật hút từ đất phần gốc rễ trả lại đất, phần lại động vật thực vật dị dưỡng tiêu thụ, lại biến thành chất tiết trả lại đất Những chất hữu tác dụng nhiều loại vi sinh vật, nấm bị khử thành đạm dạng hữu hiệu Nitơ không khí tồn chủ yếu dạng nitơ phân tử (N 2) chiếm khoảng 80 %, dạng nguyên tử kép (N2) khóa chặt với thông qua liên kết cộng hóa trị bền vững (N≡N) Mặc dù cần nguyên tố này, hấp thụ nitơ dạng NO3- NH4+ [3] Để sử dụng nguồn nitơ lớn từ không khí có đường hóa học sinh học Hóa học: Kể từ năm 1920, phương pháp công nghiệp Haber - Bosch giúp người phá vỡ liên kết ba Biện pháp đòi hỏi phải thực nhiệt độ cao (450 - 500oC), áp suất 125 atm Fe3+ chất xúc tác Các hợp chất nitơ tổng hợp hóa học cung cấp cho trồng nguồn nitơ lớn ổn định Tuy nhiên, bên cạnh việc sử dụng phân đạm tổng hợp hóa học cho nông nghiệp làm tăng suất trồng đem lại tác hại không nhỏ, trung bình có 40 - 50 % lượng đạm bón hấp thu, phần lại gây ô nhiễm môi trường đất, nước, không khí… từ gây hại chí tiêu diệt sinh vật có lợi Các hợp chất chứa nitơ phân bón hóa học gây hại lớn cá, động vật thân mềm kể người Sinh học: Nhờ vi sinh vật tiết enzyme nitrogenase để thực trình sinh học đặc biệt - trình cố định nitơ Nhóm vi sinh vật có khả thực trình gọi vi sinh vật cố định nitơ Việc sử dụng phân bón vi sinh làm đất không bị ô nhiễm, khả giữ ẩm tốt hơn, tăng cường khả cải tạo đất hệ sinh vật có ích hoạt động mạnh làm cho đất tơi xốp hơn, dễ hút chất dinh dưỡng Ngoài ra, có đường tạo nitơ khác sấm chớp hay cháy 1.2 Vai trò nitơ thực vật Nitơ thành phần quan trọng cấu tạo nên phân tử hữu protein, diệp lục, ATP… Hàm lượng nitơ thành phần chất khô thực vật dao động từ - % Tuy hàm lượng thấp nitơ có vai trò sinh lý đặc biệt quan trọng đời sống sinh trưởng phát triển hình thành suất trồng Thiếu nitơ, sinh trưởng kém, chlorophyll không tổng hợp đầy đủ, vàng, đẻ nhánh phân cành kém, sút giảm hoạt động quang hợp nên suất giảm Nếu thừa nitơ ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng, phát triển suất trồng sinh trưởng mạnh thân tăng nhanh nên yếu, dễ đổ, thu hoạch gặp nhiều khó khăn 1.3 Quá trình chuyển hóa nitơ tự nhiên 1.3.1 Quá trình khoáng hóa Quá trình khoáng hóa trình phân hủy xác hữu tác động quần thể vi sinh vật thành chất khoáng hòa tan hay chất khí tỏa nhiệt, tùy thuộc vào điều kiện khoáng hóa mà cho sản phẩm khác Giai đoạn có tham gia chủng vi sinh vật nitrat hóa Nitrosomonas Nitrobacter vi khuẩn tham gia vào trình oxy hóa hợp chất chứa nitơ thành nitrat (NO3-), dạng thích hợp trồng hấp thu Vi khuẩn amon hóa NH4+ Hợp chất hữu Vi khuẩn nitrat hóa + NH Nitrosomonas NO Nitrobacter NO2- NO3- 1.3.2 Quá trình phản nitrat hóa Là trình phân hủy chuyển hóa hợp chất nitrat điều kiện yếm khí tác dụng vi sinh vật tạo thành nitơ NO3- Vi khuẩn phản nitrat hóa N2 1.3.3 Quá trình cố định nitơ phân tử Quá trình thực vi sinh vật cố định nitơ Rhizobium sống cộng sinh rễ họ đậu hay Azotobacter sống tự do, biến đổi N2 không khí thành NH3, từ NH3 tổng hợp hợp chất chứa nitơ khác cung cấp cho trồng đồng thời làm giàu thêm nitơ cho đất Để trình xảy phải có lực khử mạnh, ATP thực điều kiện kỵ khí (do điều kiện enzyme nitrogenase hoạt động) Nitrogenase N2 + H2 NH3 H2O NH4+ Vi khuẩn cố định đạm 1.4 Tổng quan vi khuẩn cố định Nitơ Người ta nhận thấy muốn thu hoạch 12 tạ hạt hecta, trồng lấy khỏi đất khoảng 30kg nitơ [2] Theo thống kê hàng năm sản phẩm nông nghiệp giới lấy khỏi đất khỏang 100 – 110 triệu nitơ (G Colar Greenland) [2] Trong lượng phân nitơ hóa học bù đắp phần lượng nitơ mà lấy khỏi đất, tổn thất nitơ bù đáp trình sinh học đặc biệt gọi trình cố định nitơ vi sinh vật thực hiện, chúng có khả chuyển hóa nitơ phân tử không khí thành hợp chất chứa nitơ làm giàu thêm nguồn đạm đất, xếp chúng thành ba nhóm lớn: + Nhóm vi sinh vật sống cộng sinh với thực vật + Nhóm vi khuẩn sống tự + Nhóm khuẩn lam 1.4.1 Nhóm Vi sinh vật sống cộng sinh với thực vật 1.4.1.1 vi khuẩn nốt sần cộng sinh với đậu Nhà khoa học Hà Lan M W Beijrinck phân lập loài vi khuẩn sống cộng sinh nốt sần rễ thuộc đậu ông đặt tên Basillus radicicola, vi khuẩn xếp vào chi riêng Rhizodium Trên môi trường đặc, vi khuẩn nốt sần thường có khuẩn lạc trơn bóng, nhầy, vô màu Khi non tế bào chúng có dạng hình que cầu 0.5-0.9x1.2-3.0µm, có khả di động nhờ tiêu mao; già tế bào trở nên bất động kích thước lớn phân nhánh gọi thể giả khuẩn [2], [8] Đây loài hiếu khí, nhiên vi khuẩn nốt sần sử dụng trường hợp có áp lực oxy thấp khoảng 0.01atm đa số chúng thích hợp pH = 6.5-7.5, bị cản trở pH= 4.5 – 5.0 lớn 8.0 nhiệt độ thích hợp 24-260C,ở 370C phát triển chúng bị cản trở Vi khuẩn nốt sần xâm nhiễm vào rễ đậu thông qua lông hút, thông qua vết thương vỏ rễ Người ta nhận thấy muốn xâm nhiễm tốt vi khuẩn nốt sần cần đạt tới 104 tế bào/gam đất Dưới ảnh hưởng vi khuẩn, rễ tiết enzyme polylacturonase phân hủy thành lông hút, tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào rễ Hằng năm vi khuẩn nốt sần cộng sinh rễ đậu làm giàu cho đất khoảng 50-600kg nitơ/ha [2] 1.4.1.2 Vi sinh vật cố định đạm cộng sinh số không thuộc đậu Ngoài loại thuộc đậu loài không thuộc đậu có khả tạo nốt sần như: số thực vực thuộc ngành hạt trần: Bowenia, Cycas số thực vật hai mầm: Coffee, Coriaria, Ngoài số thực vật có khả tạo nốt sần Qua nghiên cứu cho thấy, vi khuẩn nốt sần số loài xạ khuẩn thuộc chi Frankia (cộng sinh rễ loài Casuarina) nhiều loài nấm rễ (khuẩn hay mycorhiza ) có khả cố định nitơ phân tử, tạo nốt sần Có nhiều nghiên cứu cho thấy, nhờ tác dụng nấm rễ mà đất thông Pinus radiala Mỹ năm làm giàu thêm khoảng 50kg nitơ/ha [2] Ngày nay, nhà khoa học phân lập, nuôi cấy vi khuẩn cố định N cộng sinh Rhizobium để sản xuất chế phẩm Nitragin để xử lý hạt giống đậu trước gieo Vi khuẩn nuôi cấy môi trường thích hợp sau hấp phụ vào chất mang đất, than bùn để bảo quản sử dụng 1.4.2 Nhóm Vi khuẩn cố định nitơ tự 1.4.2.1 Vi khuẩn cố định nitơ tự kỵ khí Clostridium Clostridium phát lần Vinogradxki (1893) Tế bào Clostridium hình que có kích thước 2.5-7.5 x 0.7-1.3µm, đứng riêng rẽ kẹp đôi thành chuỗi ngắn Khi non có khả di động, già khả di động, bào tử nằm trung tâm, khuẩn lạc nhẵn trắng có khả chịu nhiệt độ cao khô hạn [5] Vi khuẩn Clostridium có nhiều loài có khả cố định nitơ phân tử như: Cl pasteurianum, Cl butylicum loài có khả cố định đạm cao Clostridium pasteurianum Chúng có khả cố định 5-10 mg nitơ tiêu thụ hết 1g carbon Phạm vi hoạt động cố định nitơ Clostridium khoảng pH rộng 4.7 – 8.5, tối thích 6.9 – 7.3 1.4.2.2 Vi khuẩn cố định nitơ tự hiếu khí Nhóm gồm hai chi Beijerinskia sp Azotobacter sp 1.4.2.2.1 Nhóm vi khuẩn thuộc chi Beijerinskia sp Beijerinskia sp loài vi khuẩn hiếu khí cố định nitơ giống với Azotobacter sp chúng phân lập R J Starkey (1939), tế bào có hình dạng thay đổi hình cầu, hình que, hình bầu dục Beijerinski vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử bào xác, đặc điểm chung vi khuẩn thuộc chi chịu chua cao Có khả sống tốt môi trường acid (pH=3), nhiệt độ từ 16 – 370C Trên môi trường vô đạm, sau ngày nuôi cấy xuất khuẩn lạc nhầy Lồi Vi khuẩn có khả cố định 16-20 mg N đồng hóa hết 1g dinh dưỡng carbon Ngoài khả cố định nitơ chúng có khả tổng hợp chất kích thích sinh trưởng cho trồng 1.4.2.2.2 Nhóm vi khuẩn thuộc chi Azotobacter sp Azotobacter sp đuợc phân lập lần vào năm 1901 (M Beijerinck) Chúng thuộc vi khuẩn hiếu khí chúng phát triển điều kiện kỵ khí Hầu hết loài Azobacter sp sống dị dưỡng Azotobacter sp vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử có khả cố định N tự Khi chưa trưởng thành tế bào thường có hình que, kích thước 2.0-7.0 x 1.02.5 µm, sinh sản cách phân cắt, di chuyển nhờ tiêm mao Khi trưởng thành khả di chuyển, kích thước thu nhỏ thành dạng cầu bao bọc lớp nhầy Trong môi trường không chứa nitơ, Khuẩn lạc Azotobacter sp có dạng cầu lồi, nhẵn bóng, có nhăn nheo Khi nuôi cấy môi trường đặc Khuẩn lạc có màu hồng nâu đen, sinh sắc tố hình quang màu vàng lục lam lục, sắc tố khuếch tán vào môi trường [5, 14] Azotbacter sp nhạy cảm với độ ẩm đất hàm lượng nguyên tố khoáng có đất (P, K, MO, B, Cu ) Nhiều nghiên cứu cho biết Azotobacter phát triển đươc môi trường có pH khoảng 4.5 – trình cố định nitơ thực khoảng pH 5.5 – 7.2 Nhiệt độ thích hợp từ 26-300C [2, 5] Các chủng phân lập từ tự nhiên có khả cố định 10-15 mg N tiêu thụ hết 1g dinh dưỡng Carbon Một số nòi tuyển chọn có khả cố định tới 30mg/1g dinh dưỡng Carbon Trong đất, Azotobacter sp tập trung vùng đất xung quanh rễ Ngoài khả cung cấp dinh dưỡng N cho có khả kích thích nảy mầm, kích thích sinh trưởng Trong đất, Azotobacter sp thường phổ biến chủng sau: + Azotobacter chrococum: Kích thước tế bào 2.0 x 3.1 micromet, có khả di động non Khi già hình thành nang xác, khuẩn lạc có màu nâu đen già, không khuếch tán môi trường pH Chủng Az 15.2 Az 3.1 Az 3.2 5,0 0.49 ± 6,0 0.68 ± 7,0 2.22 ± 0.02d 8,0 2.33 ± 9,0 1.25 ± 0.03a 0.25 ± 0.02b 0.56 1.92 ± 0.03d 0.08d 2.17 0.06c 0.98 ± 0.02a 0.53 ±0.03b 1.02± 2.05 ± ±0.03e 1.32 0.01c 0.31 ± ±0.03b 0.04c 0.03d ±0.02e 0.05a (Các chữ khác hàng khác biệt có ý nghĩa mức α = 0,05 ) Dựa số liệu thu được, nhận thấy chủng bốn chủng vi sinh vật tuyển chọn có khả cố định đạm dãy pH nghiên cứu (pH - 9) Tuy nhiên trình cố định đạm cao vùng pH 7- Đối với chủng Az 15.2 tăng sinh khối diễn mạnh pH = nhiên với phân hạng ta thấy pH = pH =8 có mức phân hạng tức khác biệt ý nghĩa mặt thống kê Tức pH= pH = phù hợp cho tăng sinh khối chủng Az15.2 Chủng Az 3.1 cố định đạm mạnh pH = 8, Còn chủng Az 3.2 cố định đạm mạnh pH =7 Như hầu hết chủng vi sinh vật cố định đạm tốt pH kiềm Từ biết pH tối ưu chúng để thu nguồn đạm cao Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng pH đến sinh khối chủng vi khuẩn 3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến sinh khối chủng Azotobacter Mỗi thể vi sinh vật chịu tác động nhiệt độ ba giới hạn khác nhau: Nhiệt độ thấp nhất, nhiệt độ tối thích nhiệt độ cao Chính nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến khả cố định nitơ chủng vi sinh vật cần thiết Chúng tiến hành nuôi cấy vi sinh vật ba mốc nhiệt độ khác nhau: 30 oC, 35oC, 40oC máy lắc 150 vòng/phút Sau năm ngày nuôi cấy tiến hành đo OD660nm để xác định sinh khối tế bào Kết trình bày bảng 3.4 biểu đồ 3.4 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến mật độ tế bào vi khuẩn Nhiệt độ (0C) Az 15.2 Chủng Az 3.1 Az 3.2 30 2.54 ± 0.03c 2.07 ± 0.02b 1.82 ±0.01b 35 1.91 ± 0.01b 2.26 ± 0.03c 2.09 ± 0.01c 40 0.71 ±0.03a 0.25 ±0.05a 1.09 ± 0.05a (Các chữ khác hàng khác biệt có ý nghĩa mức α = 0,05 ) Qua bảng 3.4 ta thấy nhiệt độ khác có khác biệt tốc độ sinh trưởng Cụ thể khả sinh trưởng chủng Az15.2 tối thích nhiệt độ 35oC giảm mạnh nhiệt độ 40oC Chủng Az3.1 Az3.2 lại thích hợp nhiệt độ 35oC giảm mạnh nhiệt độ 40oC Điều cho thấy nhiệt độ tối thích chủng vi khuẩn từ 30 - 35 oC Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh khối chủng vi khuẩn Azotobacter cố định nitơ từ nitơ phân tử nhờ hệ enzyme nitrogenase, enzyme hoạt động phạm vi nhiệt độ tương đối hẹp nhạy cảm với nhiệt độ cao Ở ngưỡng nhiệt độ từ 30 - 35 oC hệ thống enzyme vi khuẩn hoạt động mạnh giúp vi khuẩn tăng cường trình trao đổi chất, tăng sinh khối tế bào Ở nhiệt độ thấp, phân tử ngừng di động hoạt tính enzyme bị ngừng, nhiệt độ cao làm biến tính enzyme 3.1.5 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh khối chủng Azotobacter Nuôi cấy chủng môi trường với điều kiện thích hợp xác định với thời gian nuôi cấy khác Sau năm ngày nuôi cấy tiến hành đo OD660nm để xác định sinh khối tế bào Kết trình bày bảng 3.4 biểu đồ 3.4 Bảng 3.4 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến mật độ tế bào vi khuẩn Thời gian nuôi cấy (ngày) Chủng Az 15.2 Az 3.1 Az 3.2 0.49 ± 1.78 ± 2.30 2.41 2.01 0.05a 0.80 ± 0.04b 1.56 ± ±0.04d 2.26 ±0.01d 2.19 ±0.05c 1.82 0.02a 0.28 0.02b 0.61 ±0.02d 1.96 ±0.04d ±0.06c 1.53 ±0.01 a ±0.01 b ±0.04 d 2.15 ±0.03e ±0.01c ((Các chữ khác hàng khác biệt có ý nghĩa mức α = 0,05 ) Kết bảng 3.5 cho thấy thời gian nuôi cấy tăng hàm lượng nitơ tổng số thu tăng cao Đối với chủng Az 15.2 sinh khối thu cao 2.41 ngày thứ Tuy nhiên với mức phân hạng ngày thứ ngày thứ có mức phân hạng chứng tỏ vi khuẩn Az15.2 ngày thứ thứ ta thu mật độ tế bào cao Tương tự chủng lại sinh khối tăng dần theo thời gian nuôi cấy đạt cực đại ngày thứ thứ Có thể thấy rõ khác mật độ tế bào chủng thời gian nuôi cấy khác dựa vào biểu đồ 3.16 Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh khối chủng vi khuẩn Từ biểu đồ 3.5 cho thấy mật độ tế bào tăng dần theo thời gian nuôi cấy từ hai ngày đến năm ngày đạt giá trị cực đại -5 ngày Tuy nhiên đến giới hạn định chúng dừng lại Đối với chủng Az 15.2 mật độ tế bào tăng liên tục từ ngày thứ hai đến ngày thứ tư, đến ngày thứ năm mật độ tế bào có tăng chậm đến ngày thứ sáu mật độ lại bắt đầu giảm xuống Điều chứng tỏ thời gian nuôi cấy dài mật độ chủng vi khuẩn cao Sự tăng sinh khối chủng vi khuẩn diễn mạnh giới hạn thời gian chúng thời gian ngắn cố định đạm thấp thời gian vượt qua giới hạn tối ưu sinh khối không tăng chí giảm 3.1.6 Kết nghiên cứu ảnh hưởng tốc độ nuôi cấy đến sinh khối chủng Azotobacter Nuôi cấy chủng môi trường với điều kiện thích hợp xác định với tốc độ lắc khác Sau năm ngày nuôi cấy tiến hành đo OD660nm để xác định sinh khối tế bào Kết trình bày bảng 3.6 biểu đồ 3.6 Bảng 3.4 Ảnh hưởng tốc độ nuôi cấy đến mật độ tế bào vi khuẩn Tốc độ lắc Chủng Az 15.2 Az 3.1 Az 3.2 0rpm 0.84 ± 100rpm 1.89 ± 150rpm 2.42 200rpm 2.24 250rpm 1.49 0.06a 0.51 ± 0.01c 0.97 ± ±0.03e 1.91 ±0.08d 2.21 ±0.04b 1.39 0.01a 0.52 0.04b 1.21 ±0.01d 2.11 ±0.01e 2.03 ±0.03c 0.89 ±0.02a ±0.02c ±0.04e ±0.04d ±0.04b ((Các chữ khác hàng khác biệt có ý nghĩa mức α = 0,05 ) Qua bảng 3.5 ta thấy tốc độ lắc cao sinh trưởng tăng sinh khối chủng cao Hầu hết chủng đạt sinh khối cực đại tốc độ lắc 150rpm 200rpm Vì tìm tốc độ lắc tối ưu cho chủng 150rpm 200rpm Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến sinh khối chủng vi khuẩn Azotobacter loài hiếu khí, chúng cần oxy trình tăng trưởng Vì tốc độ khuấy tăng làm tăng mật độ tế bào vi khuẩn Tuy nhiên cố định đạm vi khuẩn lại bị ức chế oxy vi khuẩn hiếu khí, cố định nitơ xẩy có diện oxy tế bào, không diện hệ enzyme nitrogenase vi khuẩn Vậy tốc độ lắc cao dẫn đến việc giảm khả cố định đạm vi khuẩn, ảnh hưởng đến sinh trưởng tăng sinh khối chúng.Vậy tìm tốc độ lắc thích hợp nuôi cấy vi khuẩn Azotobacter 150rpm Để ứng dụng chủng vào thực tiễn tiến hành xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho tăng sinh chủng tuyển chọn ảnh hưởng vài yếu tố nguồn carbon, nồng độ carbon, nhiệt độ, giá trị pH thời gian nuôi cấy lên khả cố định đạm Sau trình nghiên cứu, nhận thấy bốn chủng tuyển chọn có điểm tương đồng với tài liệu trước vi khuẩn cố định đạm Azotobacter 3.2 Kết nghiên cứu đánh giá hiệu việc xử lí chủng vi khuẩn Azotobacter đến sinh trưởng cải Xử lí hạt trước gieo trồng biện pháp quan trọng nhằm mục đích thúc mầm, kích thích mầm mọc nhanh, tăng trao đổi chất, thúc đẩy sinh trưởng, phát triển cây, rút ngắn thời gian sinh trưởng, tăng khả chín sớm, hạn chế tác hại sâu bệnh, góp phần tăng suất đơn vị diện tích Vì tiến hành thực thí nghiệm trình bày phần phương pháp Kết ảnh hưởng xử lý chủng đến sinh trưởng rau cải sau 25 ngày tuổi thu kết sau Thí nghiệm Chiều cao Số b NT1 18.65 ±0.17 5.56 ±0.11b NT2 19.65 ± 0.17c 5.78 ± 0.11b NT3 18.99 ± 0.51bc 5.44 ±0.11b NT4 18.75 ± 0.17bc 5.33 ± 0.19ab NT5 16.88 ± 0.20a 4.89 ± 0.22a ((Các chữ khác hàng khác biệt có ý nghĩa mức α = 0,05 ) Bảng 3.7 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn Azotobacter đến chiều cao số rau cải 3.2.1 Kết ảnh hưởng xử lý chủng Azotobacter đến số rau cải Biểu đồ 3.7 Biểu diễn ảnh hưởng chủng vi khuẩn Azotobacter sp đến số rau cải Qua biểu đồ 3.7 Cho thấy tất lô ngâm hạt giống với chủng vi khuẩn Azotobacter trước gieo bổ sung 50% phân bón NPK cho số trung bình cao so với đối chứng không ngâm hạt giống trước gieo không bón phân suốt trình trồng Kết có ý nghĩa mặt thống kê (với mức ý nghĩa P< 0.05) Cụ thể chủng vi khuẩn Az 3.1 cho số trung bình cao(5.78 lá/cây) so với lô thí nghiệm không nhiễm vi khuẩn không bón phân (4.89 lá/cây) Ở ta thấy lô thí nghiệm ngâm hạt giống với chủng Az3.1 cho có số cao phần nghiên cứu khả tăng sinh khối ta thấy chủng AZ15.2 có khả nang tăng sinh khối cao Có khác biệt việc cung cấp đạm cho vi khuẩn Az 3.1 sinh nhũng chất khác với hàm lượng cao IAA làm ảnh hưởng đến sinh trưởng trồng 3.2.2 Kết ảnh hưởng xử lý chủng Azotobacter đến chiều cao rau cải Biểu đồ 3.8 Biểu diễn ảnh hưởng chủng vi khuẩn Azotobacter sp đến chiều cao rau cải Kết bảng 3.6 cho thấy xử lí hạt giống với dịch vi khuẩn Azotobacter chiều cao công thức có thay đổi so với lô thí nghiệm không xử lí không bón phân Kết có ý nghĩa mặt thống kê (với mức ý nghĩa P< 0.05) Cụ thể công thức xử lý với chủng Az 3.1 có chiều cao cao (19.65 cm) so với lô thí nghiệm không xử lí vi khuẩn không bón phân (16.88cm) Kết cho thấy chủng Az 3.1 có hiệu kích thích tăng trưởng chiều cao mạnh chủng Tuy nhiên giũa chủng có mức phân hạng giống tức kết ý nghĩa mặt thống kê (với mức ý nghĩa P< 0.05) Ta thấy lô thí nghiệm xử lí chủng Az15.2 có chiều cao 18.65 kết gần tương đương với lô thí nghiệm không xử lí vi khuẩn bón 100% phân NPK Điều cho thấy chủng vi khuẩn cung cấp gần nủa nhu cầu nitơ mà cần Nhưng việc sử dụng vi khuẩn có tác dụng cải tạo đất, tiết kiệm chi phí bảo vệ môi trường 3.2.3 Kết ảnh hưởng xử lý chủng Azotobacter đến hàm lượng diệp lục rau cải Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Hàm lượng diệp lục (mg/g) Ca Cb Ccar 0.556 ± 0.507 0.02c 0.738 ±0.05d 0.212 ± 0.01d ±0.02d 0.468 ± 0.577±0.08d 0.273 0.294 ±0.01e 0.02b 0.519 ±0.01b 0.364 0.132 ± 0.01b ±0.02b 0.146 ±0.02c 0.128 0.184 ± 0.01c ±0.008a ±0.02a 0.088 ± 0.01a (Các chữ khác hàng khác biệt có ý nghĩa mức α = 0,05 ) Bảng 3.8 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn Azotobacter đến chiều hàm lượng diệp lục rau cải Qua bảng 3.8 ta thấy hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b carotenoid lô thí nghiệm xử lí chủng vi khuẩn thí nghiệm bon 100% phân NPK cao nhiều so với thí nghiệm không bón phân không xử lí vi khuẩn Kết có ý nghĩa mặt thống kê (với mức ý nghĩa P< 0.05) Giữa lô thí nghiệm xử lí chủng vi khuẩn thí nghiệm có bón phân thí nghiệm xử lí chủng vi khuẩn Az3.1 có hàm lượng diệp lục cao Biểu đồ 3.8 Biểu diễn ảnh hưởng chủng vi khuẩn Azotobacter sp đến chlorophyll a rau cải Biểu đồ 3.9 Biểu diễn ảnh hưởng chủng vi khuẩn Azotobacter sp đến hàm lượng chlorophyll b rau cải Biểu đồ 3.10 Biểu diễn ảnh hưởng chủng vi khuẩn Azotobacter sp đến hàm lượng carotenoid rau cải 3.4.2 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn Azotobacter đến chiều hàm nitơ tổng số rau cải Thí nghiệm NT1 NT2 NT3 Hàm lượng nitơ tổng số (%) 2.82 ± 0.03c 3.14 ± 0.03d 2.81 ± 0.01c NT4 2.54 ±0.02b NT5 2.22 ±0.02b (Các chữ khác hàng khác biệt có ý nghĩa mức α = 0,05 ) Bảng 3.9 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn Azotobacter đến chiều hàm nitơ tổng số rau cải Qua bảng 3.9 ta thấy nghiệm thức xử lí vi khuẩn nghiệm thức bón phân với đối chứng không nhiễm vi khuẩn không bón phân có hàm lượng nitơ tổng số cao Tuy nhiên có nghiệm thức có ý nghĩa mặt thống kê với mức ý nghĩa P < 0.05 Còn nghiệm thức lại có hàm lượng nitơ tổng số cao đối chứng ý nghĩa mặt thống kê với mức ý nghĩa P < 0.05 Biểu đồ 3.11 Biểu diễn ảnh hưởng chủng vi khuẩn Azotobacter sp đến hàm lượng nitơ tổng số rau cải PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Qua trình thực đề tài, bước đầu có kết luận sau: Đã xây dựng qui trình nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn Az15.2, Az3.1, Az3.2 để thu sinh khối cao Cụ thể với thông số như: Môi trường thích hợp Ashby với nguồn carbon glucose có bổ sung thêm peton làm nguồn cung cấp nitơ, pH thích hợp cho nuôi cấy pH từ – 8, nhiệt độ tối ưu từ 30 oC – 35oC, thời gian nuôi cấy thích hợp từ – ngày, tốc độ lắc thích hợp 150rpm Xác định ảnh hưởng chủng vi khuẩn tới sinh trưởng cải làm tăng chiều cao cây, số lượng lá, hàm lượng diệp luc hàm lượng nitơ tổng số từ làm tăng suất trồng, tiết kiệm chi phí bón phân, cải tạo đất góp phần bảo vệ môi trường 4.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu hiệu chủng Azotobacter sp có hoạt tính cố định nitơ cao đến sinh trưởng , phát triển khả nảy mầm số loại công nghiệp Tây Nguyên Tiếp tục nghiên cứu tác động qua lại chủng Azobacter sp với chủng vi sinh vật có ích khác khu trú đất sống cộng sinh với họ đậu đến sinh trưởng, phát triển suất số loài công nông nghiêp địa bàn tỉnh Đak Lak, từ có biện pháp hợp lý để sản xuất phân vi sinh chuyên dùng cho số loài nông nghiệp [...]... vi khuẩn Azotobacter - Nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn cố định đạm Azotobacter đến sự sinh trưởng của cây rau cải ngọt 2.2 Đối tượng, vật liệu và địa điểm nghiên cứu 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu - Các chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do Az15.2, Az3.1, Az3.2 được lưu trữ tại Vi n Công nghệ sinh học và môi trường, trường Đại học Tây Nguyên 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu - Phòng thí nghiệm Vi n công... khối tế bào Mỗi chủng cấy vào 3 bình và lặp lại thí nghiệm 3 lần 2.3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối một số chủng vi khuẩn Azotobacter Để nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối của một số chủng Azotobacter ta tiến hành nuôi cấy các chủng Azotobacter trên môi trường Ashby lỏng sử dụng nguồn carbon, pH và nhiệt độ thích hợp đã nghiên cứu được ở trên, lắc trên... là ở pH= 7 hoặc pH = 8 đều phù hợp cho sự tăng sinh khối của chủng Az15.2 Chủng Az 3.1 cũng cố định đạm mạnh ở pH = 8, Còn chủng Az 3.2 thì sự cố định đạm mạnh ở pH =7 Như vậy hầu hết các chủng vi sinh vật đều cố định đạm tốt ở pH hơi kiềm Từ đó biết được pH tối ưu của chúng để thu được nguồn đạm là cao nhất Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của pH đến sinh khối của các chủng vi khuẩn 3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng... carbon thích hợp cho chúng cố định đạm Azotobacter sp không có hệ enzyme amylase hoặc có hoạt tính rất thấp để thủy phân tinh bột thành đường glucose Tóm lại glucose là nguồn carbon thích hợp cho sự cố định đạm của các chủng vi khuẩn Azotobacter 3.1.2 Kết quả của nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ trong môi trường nuôi cấy đến mật độ tế bào vi khuẩn Các chủng vi khuẩn Azotobacter đều có khả năng cố định. .. chủng vi khuẩn Az15.2, Az3.1, Az3.2 chúng tôi tiến hành nghiên cứu các ảnh hưởng sau 3.1.1 Kết quả của nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy đến mật độ tế bào vi khuẩn Vi khuẩn cố định đạm có thể sử dụng carbon từ nhiều nguồn khác nhau Tuy nhiên, không phải nguồn carbon nào cũng thích hợp cho chúng cố định đạm cao Vì vậy, xác định nguồn carbon thích hợp cho nuôi cấy vi khuẩn. .. tăng trưởng Vì vậy tốc độ khuấy tăng sẽ làm tăng mật độ tế bào của vi khuẩn Tuy nhiên sự cố định đạm của vi khuẩn lại bị ức chế bởi oxy do ở vi khuẩn hiếu khí, sự cố định nitơ xẩy ra khi có sự hiện diện của oxy trong tế bào, nhưng không hiện diện trong hệ enzyme nitrogenase của vi khuẩn Vậy khi tốc độ lắc quá cao sẽ dẫn đến vi c giảm khả năng cố định đạm của vi khuẩn, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và... để xác định sinh khối tế bào Mỗi chủng cấy vào 3 bình và lặp lại thí nghiệm 3 lần 2.3.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng tốc độ lắc đến sinh khối một số chủng vi khuẩn Azotobacter Tiến hành nuôi cấy các chủng Azotobacter ở nhiệt độ, pH, môi trường, thời gian nuôi cấy thích hợp đã nghiên cứu trên máy lắc xoay vòng ở các tốc độ 0, 100, 150, 200, 250 vòng/phút Sau thời gian thuận lợi nhất chọn ra từ các thí nghiệm. .. đo OD660nm để xác định sinh khối tế bào Mỗi chủng cấy vào 3 bình và lặp lại thí nghiệm 3 lần 2.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn cố định đạm Azotobacter đến sự sinh trưởng của rau cải ngọt 2.3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm Hạt rau cải ngọt được xử lý theo các nghiệm thức sau Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức Nghiệm thức 1 ( NT1) : Xử lí ngâm hạt rau cải với sinh khối của chủng Az15.2 + bón... (1999) nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng cố định N trong rễ lúa đến sinh trưởng của mầm lúa CR 203 Nhóm tác giả đã phân lập được 78 chủng cộng sinh với rễ lúa Các chủng này có đặc điểm của chi Azospirillum Các chủng này kích thích sự nảy mầm và ra rễ của lúa CR 203 [5] PHẦN 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện lên men đến sinh khối vi khuẩn. .. môi trường Ashby lỏng, dùng que cấy lấy vi khuẩn Azotobacter từ các ống giống, hòa tan vào bình Lắc đều bằng tay, hoặc lắc trên máy lắc ủ ấm ở nhiệt độ 30OC trong tủ ấm - Sau 24 giờ, dùng giống từ bình tam giác này để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo trong nội dung nghiên cứu 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện lên men đến sinh khối một số chủng vi khuẩn Azotobacter 2.3.2.1 Nghiên