Nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học SH BV1 phòng trừ tuyến trùng gây nốt sưng và nấm bệnh hại rễ cây hồ tiêu

Những đối tượng chính gây nên dịch hại trên chủ yếu là tuyến trùng và các loại nấm bệnh trong đất như Phytophthora spp., Fusarium spp., Pythium spp.. Từ thực tế đó, Viện Bảo vệ thực vật

NGUYỄN THỊ HẢO

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHẾ PHẨM SINH HỌC SH-BV1 PHÒNG TRỪ

TUYẾN TRÙNG NỐT SƯNG Meloidogyne spp VÀ NẤM BỆNH (Phytophthora spp., Fusarium spp.) HẠI RỄ CÂY HỒ TIÊU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khóa học : 2012 - 2014

Thái Nguyên, 2014

NGUYỄN THỊ HẢO

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHẾ PHẨM SINH HỌC SH-BV1 PHÒNG TRỪ

TUYẾN TRÙNG NỐT SƯNG Meloidogyne spp VÀ NẤM BỆNH (Phytophthora spp., Fusarium spp.) HẠI RỄ CÂY HỒ TIÊU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khóa học : 2012 - 2014 Giảng viên hướng dẫn: 1 PGS.TS Phạm Thị Vượng

2 Th.S Trần Đình Quang

Thái Nguyên, 2014

Qua một thời gian nỗ lực học tập và nghiên cứu, tới nay em đã hoàn

thành khóa luận tốt nghiệp với tên đề tài: “Nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học SH-BV1 phòng trừ tuyến trùng gây nốt sưng (Meloidogyne spp.)

và nấm bệnh (Phytophthora spp., Fusarium spp.) hại rễ cây hồ tiêu”

Trong quá trình học tập và nghiên cứu, em đã nhận được sự dạy bảo tận tình của các thầy cô, đồng thời cũng nhận được sự giúp đỡ và động viên của gia đình, bạn bè

Trước hết, em xin gửi lời chân thành cảm ơn tới tất cả quý thầy cô trong khoa CNSH - CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Cảm ơn Viện Bảo vệ thực vật đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu đề tài luận văn này

Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô PGS.TS Phạm Thị

Vượng - quyền viện trưởng Viện Bảo vệ thực vật, người đã tận tâm truyền

đạt kiến thức cho em và hơn cả là tấm gương về lòng say mê nghiên cứu khoa

học Xin gửi lời cảm ơn tới thầy ThS Trần Đình Quang đã hướng dẫn em

hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thị Chúc Quỳnh cùng toàn

thể anh, chị trong nhóm nghiên cứu Nấm côn trùng - Trung tâm Đấu tranh sinh học đã truyền đạt cho em tính chính xác, nghiêm túc trong nghiên cứu khoa học cũng như tinh thần trách nhiệm với công việc mình làm Cuối cùng

em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu nặng tới những người thân trong gia đình, bố,

mẹ, anh chị em đã động viên, giúp đỡ em cả về vật chất lẫn tinh thần trong quá trình học tập

Hà Nội, ngày 4 tháng 6 năm 2014

Sinh viên

Nguyễn Thị Hảo

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Mục đích nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài: 2

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Cơ sở khoa học 3

2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước 5

2.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 5

2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 9

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Đối tượng (vật liệu) và phạm vi nghiên cứu 14

3.1.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 14

3.1.2 Thiết bị thí nghiệm 14

3.1.3 Hóa chất 14

3.1.3 Môi trường nuôi cấy 15

3.1.4 Phạm vi nghiên cứu 16

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 16

3.3 Nội dung nghiên cứu 16

3.4 Phương pháp nghiên cứu 16

3.4.1 Đánh giá hiệu lực trừ tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne spp của chế phẩm sinh học SH-BV1 trong điều kiện phòng thí nghiệm 16

3.4.2 Đánh giá khả năng ức chế của nấm Trichoderma đối với nấm Phytophthora spp và nấm Fusarium spp trong điều kiện phòng thí nghiệm 17 3.4.3 Xác định liều lượng sử dụng chế phẩm sinh học SH-BV1 để phòng trừ tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne spp và nấm Phytophthora spp., Fusarium spp hại rễ hồ tiêu trong điều kiện nhà lưới 18

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 22

4.1 Hiệu lực phòng trừ tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne spp của chế phẩm sinh học SH-BV1 trong điều kiện phòng thí nghiệm 22

4.2.1 Khả năng ức chế của nấm Trichoderma hazianum đối với nấm

Phytophthora spp 24

4.2.2 Khả năng ức chế của Trichoderma hazianum với nấm Fusarium spp trong phòng thí nghiệm 27

4.3 Liều lượng sử dụng chế phẩm SH-BV1 để phòng trừ tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne spp và nấm Phytophthora spp., Fusarium spp hại rễ hồ tiêu trong điều kiện nhà lưới 31

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37

5.1 Kết luận 37

5.2 Ý kiến 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

Bảng 4.1: Hiệu lực trừ tuyến trùng (Meloidogyne spp.) hại rễ hồ tiêu của chế phẩm

sinh học SH-BV1 trong phòng thí nghiệm 22

Bảng 4.2: Hiệu quả ức chế của nấm Trichoderma hazianum đối với nấm

Phytophthora spp trong phòng thí nghiệm 25 Bảng 4.3: Hiệu quả ức chế của Trichoderma hazianum đối với nấm Fusarium

spp trong phòng thí nghiệm 28

Bảng 4.4: Hiệu lực trừ tuyến trùng hại rễ gây nốt sưng Meloidogyne spp

của chế phẩm sinh học SH-BV1 trong điều kiện nhà lưới 31

Bảng 4.5: Hiệu quả trừ nấm Phytophthora spp trong đất ở điều kiện nhà

lưới 33

Bảng 4.6: Hiệu quả trừ nấm Fusarium spp trong đất ở điều kiện nhà lưới 35

Hình 4.1 Hiệu lực trừ tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne spp hại rễ

hồ tiêu của chế phẩm SH-BV1 trong phòng 23

Hình 4.2 (A) Thí nghiệm hiệu lực trong phòng; Tuyến trùng Meloidogyne spp (B) 24 Hình 4.3 Hiệu quả ức chế của Trichoderma hazianum tới Phytophthora

spp trong điều kiện phòng thí nghiệm sau các ngày theo dõi 25

Hình 4.4 Bẫy Phytophthora spp (A) cánh hoa tươi - (B) cánh hoa bị mất màu 26 Hình 4.5 Bào tử nấm Phytophthora spp ở mép cánh hoa bị mất màu (A)

Tản nấm Phytophthora spp trên môi trường PDA sau 5 ngày (B) 27 Hình 4.6 Hiệu quả ức chế của nấm Trichoderma hazianum đối với nấm

Fusarium spp trong phòng thí nghiệm sau các ngày theo dõi 29 Hình 4.7 (A) Khuẩn lạc nấm Fusarium spp sau cấy 2 ngày trên PDA (B)

Bào tử Fusarium spp trên kính hiển vi với độ phóng đại 200 lần 30 Hình 4.8 Trichoderma hazianum đối kháng với nấm Fusarium spp sau 5 ngày 30 Hình 4.9 Hiệu lực trừ tuyến trùng hại rễ gây nốt sưng Meloidogyne spp

của chế phẩm SH-BV1 32 Hình 4.10 Bộ lá cây hồ tiêu sau 2 tháng (A) Xử lý chế phẩm; (B) Không xử lý 33

Hình 4.11 Hiệu quả trừ nấm Phytophthora spp trong đất ở điều kiện nhà lưới 34

Hình 4.12 Biểu đồ ảnh hưởng của chế phẩm SH-BV1 đến mật độ nấm

Fusarium trong đất ở các liều lượng khác nhau 36

PHẦN 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hồ tiêu (Piper nigrum) được xem là “vua của các loại gia vị” và là một

trong những cây công nghiệp xuất khẩu chủ lực của nước ta Theo Hiệp hội

Hồ tiêu Việt Nam (VPA), năm 2012 Việt Nam đã xuất khẩu được 110.734 tấn hồ tiêu các loại và đạt giá trị hơn 750 triệu USD, chiếm trên 50% thị phần mặt hàng này trên toàn thế giới Tính đến hết tháng 11 năm 2012, Hồ tiêu Việt Nam đã xuất khẩu tới 90 quốc gia và vùng lãnh thổ Do giá trị xuất khẩu cao nên diện tích trồng ngày càng tăng Trong thời gian từ năm 1999 đến

2012 tổng diện tích hồ tiêu của cả nước đã lên mức 60.000 ha

Tuy nhiên, trong những năm gần đây cùng với sự phát triển về diện tích

và sản lượng của hồ tiêu thì dịch hại cũng ngày càng trở nên rất nghiêm trọng như bệnh chết nhanh, bệnh vàng lá chết chậm, bệnh vàng lá do nấm và vàng

lá do rệp sáp diễn ra khá phổ biến trong cả nước Bệnh đã gây hại nặng hàng ngàn hecta hồ tiêu tại các tỉnh Gia Lai, Đăk Nông, Đăk Lăk, Bình Phước, Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu, v.v Dịch bệnh trên cây tiêu đã dẫn đến hàng trăm hecta tiêu bị chết hàng năm, những cây không chết thì năng suất và chất lượng quả giảm một cách đáng kể Những đối tượng chính gây nên dịch hại

trên chủ yếu là tuyến trùng và các loại nấm bệnh trong đất như Phytophthora spp., Fusarium spp., Pythium spp và Rhizoctonia spp.,

Việc tìm kiếm giải pháp hiệu quả và thân thiện với môi trường để kiểm soát tình hình dịch bệnh trên cây hồ tiêu là vấn đề cấp thiết, góp phần ổn định năng suất, chất lượng sản phẩm hồ tiêu của nước ta, đặc biệt khi Việt Nam đã gia nhập WTO và các sản phẩm xuất khẩu phải đạt yêu cầu đảm bảo các tiêu chuẩn an toàn thực phẩm quốc tế Từ thực tế đó, Viện Bảo vệ thực vật đã tiến hành nghiên cứu phát triển thành công chế phẩm sinh học SH-BV1 phòng trừ tuyến trùng và nấm bệnh hại rễ cây hồ tiêu Việc nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sinh học SH-BV1 trong phòng trừ tuyến trùng và nấm bệnh hại rễ hồ tiêu đang là vấn đề cấp thiết của sản xuất Xuất phát từ những lý do đó, chúng

tôi xin đề xuất thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học SH-BV1 phòng trừ tuyến trùng gây nốt sưng (Meloidogyne spp.) và nấm bệnh (Phytophthora spp., Fusarium spp.) hại rễ cây hồ tiêu” nhằm ứng

dụng chế phẩm sinh học SH-BV1 có hiệu quả cao trong công tác phòng trừ tuyến trùng và nấm bệnh hại rễ hồ tiêu, đồng thời nâng cao nâng cao năng suất chất lượng hồ tiêu và bảo vệ môi trường

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học SH-BV1 để phòng trừ tuyến

trùng Meloidogyne spp và nấm bệnh Phytophthora spp., Fusarium spp hại rễ

cây hồ tiêu trong điều kiện nhà lưới

1.3 Mục đích nghiên cứu

- Nội dung 1: Đánh giá hiệu lực trừ tuyến trùng gây nốt sưng

Meloidogyne spp của chế phẩm sinh học SH-BV1 trong điều kiện phòng thí

nghiệm

- Nội dung 2: Đánh giá khả năng ức chế của nấm Trichoderma với nấm Phytophthora spp và nấm Fusarium spp trong điều kiện phòng thí nghiệm

- Nội dung 3: Xác định liều lượng sử dụng chế phẩm sinh học SH-BV1

để phòng trừ tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne spp và nấm bệnh Phytophthora spp., Fusarium spp hại rễ cây hồ tiêu trong điều kiện nhà lưới

1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài:

- Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học góp phần định hướng nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật sử dụng chế phẩm sinh học SH-BV1 có hiệu quả cao trong phòng trừ tuyến trùng và nấm bệnh hại rễ cây hồ tiêu ngoài đồng ruộng

- Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của đề tài làm cơ sở để phát triển ứng dụng chế phẩm sinh học SH-BV1 có hiệu quả cao trong phòng trừ tuyến trùng và nấm bệnh hại rễ cây hồ tiêu ngoài đồng ruộng, giảm tối đa việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học, bảo vệ môi trường, sản xuất nông sản an toàn phục vụ xuất khẩu

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Cơ sở khoa học

Hiện nay, trên thế giới việc phát triển chế phẩm vi sinh vật dạng bón gốc phối hợp với chế phẩm phân bón hữu cơ vi sinh để quản lý dịch hại trong đất đã được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Với kết quả nghiên cứu

đã đạt được tác giả cho rằng phối sử dụng nấm Metarhizium, chế phẩm Neem

với phân bón hữu cơ sinh học sử dụng các vi sinh vật có ích cho hiệu quả trừ tuyến trùng hại rễ đạt từ 70 - 80% trên các cây trồng cạn như: Hồ tiêu, cà phê,

cà chua, bắp cải, dưa chuột, v.v… (Muhammad A., 1996) [25]

Ở Peru, sử dụng phân hữu cơ 3 kg/m2

đã làm giảm tuyến trùng nốt sưng

ở vườn cà chua còn 32% (đối chứng là 83%) sản lượng tăng 25% Phân kali

có khả năng tạo tính chống chịu của cây với tuyến trùng nốt sưng và các bệnh khác, nhưng bón quá nhiều kali sẽ làm giảm tuyến trùng hoại sinh trong đất, trong đó có những loài tuyến trùng đối kháng với tuyến trùng gây bệnh nốt sưng (Yaringano và Villaba, 1977) [34]

Tình hình sử dụng thuốc trừ sâu hóa học của nông dân hiện nay ngày càng cao vượt qua cả khuyến cáo của nhà sản xuất, trong đấy có những thuốc nằm trong danh mục bị cấm nhưng vẫn được sử dụng Tuy nhiên, thuốc hóa học chỉ có hiệu quả trong một khoảng thời gian ngắn Những cá thể không bị tiêu diệt sẽ khôi phục lại quần thể khi thuốc hóa học không còn hiệu lực và làm dịch hại càng bùng phát cao hơn và khó phòng trừ hơn do khả năng kháng thuốc Đồng thời gây ra ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng tới chất lượng cuộc sống của con người

Các biện pháp sử dụng chế phẩm sinh học ngày càng được chú trọng hơn nhất là đối với cây hồ tiêu vì các chế phẩm sinh học có tác dụng kéo dài

và thân thiện với môi trương sống Việc sử dụng chế phẩm dạng hỗn hợp không chỉ có hiệu quả cao trong việc hạn chế tác hại của sâu bệnh hại mà còn giúp cây phát triển bền vững

Tại Việt Nam năm 2006, Viện Bảo vệ thực vật và Viện Thổ nhưỡng

nông hoá tập trung thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh

học phòng trừ tuyến trùng và nấm bệnh vùng rễ cây cà phê và hồ tiêu” Cho

đến nay đề tài đã sản xuất thành công chế phẩm sinh học SH-BV1 phục vụ phòng trừ tuyến trùng và nấm bệnh hại vùng rễ hồ tiêu và cà phê SH-BV1 là chế phẩm sinh học bón gốc đa chức năng bao gồm các thành phần: Thảo dược, vi sinh vật chức năng, nấm đối kháng và chất hữu cơ Chế phẩm sinh học SH-BV1 vừa có tác dụng hạn chế tuyến trùng và nấm bệnh hại rễ vừa có tác dụng giúp cây phục hồi sinh trưởng tốt Góp phần làm tăng năng suất và chất lượng cây trồng, tăng độ phì cho đất, an toàn với môi trường Không những chế phẩm có hiệu quả cao mà thời gian còn kéo dài trong phòng trừ tuyến trùng và nấm bệnh hại rễ hồ tiêu Sử dụng chế phẩm SH-BV1 sẽ cung cấp cho đất hàm lượng vi sinh vật chức năng giúp cải tạo và nâng cao độ phì nhiêu của đất, từ đó giúp cây hồ tiêu phát triển tốt hơn, tăng sức đề kháng cho cây dẫn đến cây ít bị bệnh cho năng suất cao và ổn định Thành phần nấm đối kháng có tác dụng ức chế vi sinh vật gây bệnh hại rễ cây hồ tiêu, thảo dược có tác dụng phòng trừ tuyến trùng kí sinh gây hại rễ hồ tiêu (Viện Bảo vệ thực vật, 2011) [16]

Việc sử dụng chế phẩm dạng hỗn hợp không chỉ có hiệu quả cao trong việc hạn chế tác hại của sâu, mà còn giúp cây phát triển tốt hơn, sớm vượt qua các thời kỳ khủng hoảng trong quá trình phát triển của cây trồng Một vài công trình đã thử nghiệm phối trộn bánh dầu Neem với các vật liệu khác như rơm rạ, lúa mỳ, bùn thải, phân bón NPK cho kết quả phòng trị tuyến trùng rất tốt (Viện Bảo vệ thực vật, 2011) [16]

Tóm lại: Hiện nay, sản xuất tiêu nói riêng, nhiều cây công nghiệp có

giá trị của Tây Nguyên nói chung đã và đang bị tuyến trùng Meloidogyne spp

và các loài nấm bệnh Phytophthora spp., Fusarium spp gây hại làm giảm

diện tích, năng suất cây trồng Để phòng chống người sản xuất đã hoàn toàn dựa vào thuốc trừ sâu hóa học, việc lạm dụng thuốc hóa học đã dẫn tới:

- Phá hủy môi trường đất, nước, ảnh hưởng xấu tới con người

- Hiệu quả của thuốc hóa học không kéo dài qua thời gian sử dụng

- Ảnh hưởng đến an toàn nông sản và khả năng xuất khẩu của sản phẩm

Vì thế, đề tài này đã góp phần nghiên cứu đề xuất hướng sử dụng chế phẩm sinh học phòng chống tuyến trùng và nấm bệnh gây hại để phát triển bền vững cho cây trồng

2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước

2.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Tuyến trùng gây hại trên hồ tiêu

Tuyến trùng (Nematodes) là nhóm động vật không xương sống, đa bào

có kích thước rất nhỏ bé mà mắt thường không thể nhìn thấy được Tuyến trùng là đối tượng dịch hại khá phổ biến và gây thiệt hại lớn đối với các quốc

gia trồng tiêu trên thế giới, chỉ tính riêng tuyến trùng Meloidogyne spp đã gây

thiệt hại đến 16% ở các nước Đông Nam Châu Á (Sasser, 1979) [29] Có 36 loài tuyến trùng kí sinh gây hại, trong đó có hai đối tượng quan trọng nhất là:

Radopholus similis và Meloidogyne spp Nhóm tuyến trùng ký sinh thực vật

là đối tượng gây hại trên nhiều cây trồng nông và công nghiệp (Perry and Moens, 2006) [26] Khoảng 10% số loài tuyến trùng gây hại trên thực vật, sống xung quanh rễ cây và có nhiều loài hại trên cà phê, hồ tiêu (Souza, 2008) [30] Tùy từng loài tuyến trùng khác nhau mà có triệu trứng khác nhau Triệu trứng trên mặt đất: Cây sinh trưởng kém, có biểu hiện thiếu dinh dưỡng, cây héo khi thời tiết nóng khô, năng suất giảm Triệu chứng dưới mặt đất: hệ

thống rễ kém phát triển, có nhiều nốt sần (Meloidogyne spp.), vết thương (Pratylenchus spp., Radopholus spp.) đầu rễ sưng (Rotylenchus reniformis)

Điển hình là rễ nhánh mọc nhiều ở vùng kề cận vùng bị tuyến trùng gây hại Ngoài ra, tuyến trùng gây hại còn kèm theo các tác nhân như nấm bệnh, vi khuẩn gây ra hiện tượng thối rễ (Phan Quốc Sủng và cs, 2001) [9]

Nhóm tuyến trùng gây nốt sưng (Meloidogyne spp.): có 19 loài tuyến trùng Meloidogyne spp hại cây trồng quan trọng trên thế giới như Meloidogyne incognita, Meloidogyne exigua Trong đó Meloidogyne incognita là loài gây hại nghiêm trọng trên hồ tiêu ở nhiều vùng trồng hồ tiêu khắp thế giới Meloidogyne incognita được phát hiện sau loài Meloidogyne exigua khoảng 80 năm, gây hại trên hồ tiêu đầu tiên vào năm 1960 ở

Guatemala, Bờ biển Ngà, sau đó là Tanzania, gần đây nhất là ở Jamaica và Ấn

Độ So với Meloidogyne exigua thì Meloidogyne incognita là loài tuyến trùng

xuất hiện phổ biến và gây hại nghiêm trọng hơn cho cây trồng đặc biệt là trên cây hồ tiêu (Villian, 2008) [32]

Triệu chứng: Triệu chứng tuyến trùng ký sinh rễ hồ tiêu có biểu hiện

như tạo các nốt sưng trên rễ, gây tổn thương rễ, bộ rễ bị biến dạng, bị hủy hoại dẫn đến chết, Khi bộ rễ bị phá huỷ tùy mức độ, làm cho cây còi cọc, kém phát triển, lá úa vàng, quả và hạt nhỏ, chất lượng kém Bị hại nặng, bộ rễ bị phá huỷ

một phần hay toàn bộ, cây có thể bị chết (Phan Quốc Sủng và cs, 2001) [9]

Tác hại: Một trong các tác nhân chính gây nên hiện tượng vàng lá, thối

rễ là do tuyến trùng gây nên, chúng luôn hiện diện ở rễ cây bị bệnh với mật độ rất cao Tuy nhiên, trong vùng đất và rễ của cây bị bệnh cũng có mặt của

nhiều loài nấm đất như Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Phytophthora

spp., … có vai trò quan trọng cùng tham gia phối hợp gây hại cây trồng, làm cây héo vàng, thối rễ nhanh hơn Điều này càng làm cho việc phòng trừ trở

nên khó khăn (Phan Quốc Sủng và cs, 2001) [9]

Nấm Phytophthora spp gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu

Nấm Phytophthora spp thuộc lớp Oomycetes, giới Chromista Các du

động bào tử hình thành trong bọc bào tử và được giải phóng trực tiếp từ bọc

bào tử Một số loài như Phytophthora infestans và Phytopthora palmivora tạo

các bọc bào tử rất dễ rụng khỏi cành mang bọc bào tử và có thể được phân tán

nhờ gió Một số loài Phytophthora spp như Phytophthora cinnamomi tạo bào

tử hậu trên môi trường nhân tạo Các bào tử này có chức năng bảo tồn trong đất (Burgess L.W, 2009) [20]

Tác hại: Trên hồ tiêu, bệnh chết nhanh (quick wilt) do nấm Phytophthora spp rất phổ biến ở các vùng trồng tiêu trên thế giới và trong

nước Ước tính năm 1999, tổng thiệt hại do bệnh chết nhanh hồ tiêu ở Indonesia khoảng 1,76 triệu USD, bệnh lan rộng ra hầu hết các vùng trồng tiêu và hại hầu hết các giống tiêu của nước này Ở Malaysia năm 2002, tỷ lệ bệnh này là 5 - 7% và những năm sau bệnh vẫn tiếp tục lan rộng (Lee B.S;

Purwantara và cs, 2004) [23] Bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora spp là tác nhân gây bệnh chính, bệnh thối rễ chết nhanh do Phytophthora capsici gây

thất thoát sản lượng từ 5 - 10% hàng năm ở Mã Lai (Kularatne, 2002) [22]

Bệnh chết nhanh trước tiên được ghi nhận là do nấm Phytophthora palmivora var piperis sau đó được đặt lại tên là Phytophthora palmivora MF4 (Tsao et

al., 1985) [31]

Nấm Fusarium spp gây bệnh chết chậm trên hồ tiêu

Triệu chứng: Bệnh chết chậm thường có triệu chứng vàng lá từ từ, có

khi cây hồ tiêu bị bệnh 2 - 3 năm sau mới chết Cây bị bệnh kém phát triển, năng suất thấp, bộ rễ thường bị phá hủy Tùy thuộc vào từng vùng mà trên rễ

có biểu hiện thâm đen, khó khăn trong việc cung cấp nước và dinh dưỡng

Tác nhân gây bệnh chết chậm: Bệnh chết chậm có nhiều tác nhân tham

gia như tuyến trùng gây hại vùng rễ, rệp sáp, mối, nấm Fusarium spp Nhiều

mẫu bệnh thu thập tại các tỉnh trồng tiêu còn có sự hiện diện của cả nấm

Phytophthora spp và Pythium spp Hiện chưa có biện pháp phòng trị hữu hiệu cho cây bị nhiễm nấm Fusarium spp (Wong, 2002) [33]

Mối quan hệ giữa tuyến trùng và nấm bệnh hại rễ cây trồng

Đã có nhiều công trình nghiên cứu về mối quan hệ giữa tuyến trùng với những loại nấm bệnh hại cây trồng Trong đó, tuyến trùng nốt sưng xuất hiện

và gây hại trên bông nhưng cũng làm tăng tỷ lệ cây chết do nấm Fusarium gây ra Khi lây nhiễm hỗn hợp tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne incognita cùng với nấm Fusarium oxysporum và Fusarium cubensis trên chuối đã làm

số lượng tuyến trùng tăng lên nhanh (Atkitson, 1982) [19] Giống thuốc lá

kháng bệnh héo do nấm Furarium oxysporum khi bị nhiễm tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne incognita, Meloidogyne javanica và Meloidogyne arenaria thì các giống trên bị nhiễm nấm Furarium oxysporum, sau 3 tuần nhiễm nấm Alternaria tenuis đã làm 70% số lá bị bệnh, đặc biệt là những giống mẫn cảm với nấm Alternaria tenuis và tuyến trùng nốt sưng (Porter and Powell, 1967)

[27] Tuyến trùng nốt sưng là nguyên nhân làm tăng bệnh héo xanh trên khoai

tây do vi khuẩn Pseudomonas solanacerum tại Lima, Peru Tác giả cũng chứng minh sự tồn tại của tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne incognita là nguyên nhân làm tăng bệnh héo xanh vi khuẩn Pseudomonas solanacerum

làm cây héo và chết nhanh hơn (Lucas, 1965) [24]

Tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne spp có mối quan hệ với bệnh

do nấm Phytophthora spp và Fusarium spp., tuyến trùng tạo vết thương vùng

rễ gây nên các vết thương tạo cơ hội cho nấm bệnh tấn công rễ cây hồ tiêu (Eng L., 2002) [21]

Biện pháp sinh học phòng trừ tuyến trùng và nấm bệnh hại rễ

Khi nghiên cứu biện pháp phòng trừ sâu bệnh gây hại hồ tiêu ở

Philippin và Nhật Bản (Romulo, 1987) [28] sử dụng cây cúc vạn thọ (Tagetes erecta) trồng vào khoảng trống giữa các cây đã kiểm soát rất tốt quần thể

tuyến trùng

Ở Peru, sử dụng phân hữu cơ 3 kg/m2

đã làm giảm tuyến trùng nốt sưng

ở vườn cà chua còn 32% (đối chứng là 83%) sản lượng tăng 25% Phân kali

có khả năng tạo tính chống chịu của cây với tuyến trùng nốt sưng và các bệnh khác, nhưng bón quá nhiều kali sẽ làm giảm tuyến trùng hoại sinh trong đất, trong đó có những loài tuyến trùng đối kháng với tuyến trùng gây bệnh nốt sưng (Yaringano và Villaba, 1977) [34]

Chế phẩm vi sinh trừ tuyến trùng: Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sinh

học có nguồn gốc vi sinh vật để phòng trừ tuyến trùng đang ngày càng được quan tâm Xuất phát từ những lý do như ảnh hưởng tiêu cực của thuốc hóa học tới nhiều khía cạnh, trong một số loại đất, nấm và vi khuẩn ký sinh tuyến trùng có khả năng tăng về sinh khối với các đối tượng cây trồng lâu năm, độc canh cây trồng Tuy nhiên biện pháp sinh học không phải luôn ổn định và mang lại hiệu quả phòng trừ cao Chế phẩm vi sinh trừ tuyến trùng cũng có những hạn chế như không làm giảm quần thể tuyến trùng xuống dưới ngưỡng kinh tế, tác động chậm,… Chính vì vậy một trong những giải pháp khắc phục tình trạng này là việc sử dụng kết hợp các tác nhân sinh học Sử dụng kết hợp

nấm Trichoderma atroviride với Fusarium oxysporum không gây bệnh cho cây mang lại hiệu quả phòng trừ Radopholus similis cao hơn khi không kết hợp chúng lại Sự kết hợp của vi khuẩn Bacillus subtilis và nấm Paecilomyces lilacinus, vi khuẩn Pasteuria penetrans và nấm Verticillium chlamydosporium

Tác giả đã liệt kê các chế phẩm sinh học trừ tuyến trùng được sử dụng ở vùng

nhiệt đới châu Phi như Pasteuria penetrans, Pochonia chlamydosporia và Paeciliomyces lilacinus Đặc biệt là Pasteuria penetrans, Pochonia

chlamydosporia được người trồng rau màu ở Kenya, Tanzania, Nam Phi,

Cuba sử dụng (Agbenin, 2011) [18]

2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu tuyến trùng và nấm bệnh hại hồ tiêu

Trên hồ tiêu có 3 nhóm dịch hại cần được quan tâm nghiên cứu giải quyết là bệnh chết nhanh; bệnh chết chậm và bệnh virus Tác giả cũng cho rằng bệnh chết nhanh là nguyên nhân gây suy thoái vườn tiêu của nhiều địa phương như Cam Lộ (Quảng Trị), Chư Sê (Gia Lai), Xuân Lộc (Đồng Nai), Phú Quốc (Kiên Giang) Về nguyên nhân gây bệnh chết nhanh tác giả cho

rằng do hai nhóm nấm Phytophthora spp và Pythium spp gây ra bao gồm Phytophthora capsici, Phytophthora nicotianae, Phytophthora cinnamomi và Pythium spp Bệnh chết chậm do tác động của nhiều tác nhân như tuyến trùng, nấm Fusarium spp., Pythium spp., rệp sáp và mối Khi nghiên cứu về

biện pháp phòng trừ, tác giả cho rằng thuốc Agrifos-400 có tác động tốt đối với bệnh chết chậm, hạn chế sự lây lan của bệnh và phân hữu cơ đa chức năng MT1 có hiệu quả hạn chế tác hại của bệnh chết chậm, tăng năng suất hồ tiêu tại Đắk Nông và Quảng Trị (Ngô Vĩnh Viễn, 2007) [15]

Một số loài nấm thuộc chủng Phytophthora gây thiệt hại ngày càng cao

trên một số cây trồng ở Việt Nam, bao gồm cây ăn quả, rau, cây gia vị, và các

cây công nghiệp Mười ba loài Phytophthora đã được định danh ở nước ta, trong đó có hai loài gây thiệt hại nặng là Phytophthora infestans trên cây cà chua và Phytophthora capsici trên hồ tiêu (Đặng Vũ Thị Thanh, 2004) [10]

Bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora capsici là bệnh quan trọng nhất

hiện nay trên cây tiêu ở Việt Nam Ngoài ra, một số nấm gây bệnh khác như

Fusarium spp., Pythium spp., Rhizoctonia solani cũng là các tác nhân quan trọng Phân hữu cơ giúp đất tơi xốp là điều kiện cần thiết cho bộ rễ tiêu sinh

trưởng tốt, ngoài ra còn cung cấp lượng lớn vi sinh vật vào trong đất, tạo cân bằng sinh học cho vùng đất quanh cây tiêu Việc sử dụng các loại phân hữu cơ như phân bò, phân gà, phân rác đã hạn chế được sự phát triển của bệnh chết nhanh trên cây tiêu so với không bón (Nguyễn Tăng Tôn, 2005) [14]

Bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora capsici trên cây tiêu ở Quảng Trị là một trong những trở ngại chính cho sản xuất hồ tiêu tại địa phương Xử lý hom

tiêu trước khi trồng với thuốc trừ nấm có khả năng giảm thiệt hại do nấm

Phytophthora spp gây ra cho các vườn trồng tiêu (Trần Thị Thu Hà, 2007) [3]

Bệnh hại hồ tiêu có hướng gia tăng và ngày càng trở nên nghiêm trọng hơn ở các vùng trồng tiêu trong cả nước Người sản xuất mong đợi những giải pháp phòng trừ có hiệu quả nhưng những phương pháp phòng trừ mới ít được phổ biến và ngày càng có nhiều vườn tiêu bị huỷ hoại do bệnh hại Hàng năm, bệnh hại thường xuất hiện khá phổ biến và chủ yếu vào giai đoạn giữa và cuối mùa mưa, gây thiệt hại rất lớn cho người trồng tiêu (Vũ Triệu Mân, 2000) [7]

Bệnh hại nghiêm trọng nhất hiện nay đối với hồ tiêu là bệnh chết

nhanh, nguyên nhân gây bệnh là do loài nấm Phytophthora palmivora

(Nguyễn Đăng Long và ctv, 1987-1988) [6], kí sinh trên rễ và thân ngầm gây

ra Theo nhận xét của tác giả bệnh phụ thuộc rất nhiều vào quá trình tích luỹ của nấm bệnh ở trong đất, nếu có thêm những tác nhân từ bên ngoài tác động vào bệnh sẽ dễ dàng phát triển thành dịch Khi dịch đã phát sinh, sự lây lan nhanh chóng của bệnh theo kiểu vết dầu loang do nước mưa chảy tràn

Hồ tiêu là cây trồng bị rất nhiều loài tuyến trùng kí sinh gây hại Tại Tân Lâm (Quảng Trị), cây tiêu bị nhiễm đến 49 loài tuyến trùng, trong đó có

4 loài được đánh giá quan trọng gây nguy hiểm cho cây gồm Meloidogyne incognita gây bệnh nốt sần, Rotylenchulus gây đen rễ, Xiphinema americanum truyền virus gây bệnh vàng lá, Paratrichodorus namus truyền virus gây bệnh xoắn lá (Nguyễn Ngọc Châu, 1995) [2]

Có 12 giống tuyến trùng hiện diện trên đất trồng hồ tiêu tại Cam Lộ,

Quảng Trị Tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne spp rất phổ biến, tuyến trùng Pratylenchus spp và Tylenchus spp cũng phổ biến, còn 9 giống tuyến

trùng khác ít phổ biến hơn Mật độ tuyến trùng ký sinh thực vật và mật độ

tuyến trùng Meloidogyne spp trong đất và rễ cao nhất ở tháng 2 vì đây là thời

điểm mùa mưa thích hợp cho tuyến trùng di chuyển, tìm kiếm thức ăn và sinh sản Mật độ tuyến trùng vào tháng 10 và tháng 5 giảm đáng kể (Trần Thu Hà

và Nguyễn Đăng Tôn, 2011) [4]

Bệnh chết nhanh trên cây tiêu rất nguy hiểm, nấm gây bệnh tấn công trên tất cả các phần của cây tiêu và ở tất cả các thời kỳ sinh trưởng của cây, trường hợp nấm bệnh tấn công vào rễ hoặc cổ rễ sẽ làm cây chết đột ngột

Bệnh thường phát triển nhiều trong mùa mưa, lá bên dưới dễ nhiễm nấm bệnh sau những cơn mưa lớn vào đầu mùa mưa Nấm bệnh xâm nhập vào cây trực tiếp qua biểu bì hoặc gián tiếp qua khí khổng Nếu cây bị nhiễm bệnh ở cổ rễ sẽ chết héo, lá chuyển sang màu đen, khô sớm nhưng còn dính lại trên cây Nếu cây

bị nhiễm từ rễ, lá bị héo vàng và rụng lá từ từ (Phan Quốc Sủng, 2000) [9]

Đối với bệnh chết chậm biểu hiện sự sinh trưởng chậm, lá có màu vàng nhạt; lá, hoa và quả rụng dần từ gốc đến ngọn, các đốt cũng rụng dần từ trên xuống gốc Hiện tượng vàng lá của cây có thể do sự cộng hợp của các tác

nhân Fusarium spp., Rhyzoctonia spp., tuyến trùng Meloidogyne spp., rệp sáp

hại rễ và do cây thiếu dinh dưỡng (Phan Quốc Sủng, 2000) [9]

Khi quan sát mẫu rễ và mẫu đất trồng tiêu thấy 95% mẫu rễ và 97%

mẫu đất có tuyến trùng Meloidogyne spp Với số lượng tuyến trùng tuổi 2 đạt

trên 253 con/5g rễ và 255 con/100 g đất Số lượng tuyến trùng tăng dần từ tháng 11 trở đi và đạt mật độ cao nhất vào tháng 1, 2 với mật độ tuyến trùng

567 con tuổi 2/5g rễ và 1797 con/100 g đất (Trịnh Thị Thu Thủy, 2010) [12]

Tuyến trùng phá hại tiêu thường gặp nhất là loài Meloidogyne incognita, Radopholus similis Ngoài ra còn một số loài khác như Rotylenchulus remiformis, Uliginotylenchus, Tylenchus spp., Xiphinema spp

Trên cây tiêu, sau khi tuyến trùng tấn công, cây thường dễ bị nhiễm các nấm

bệnh như Fusarium spp., Phytophthora spp., Rhizoctonia spp., Pythium spp

gây chết nhanh hơn, các lá phía dưới chuyển màu vàng, dần dần tới các lá phía trên Cây tiêu sinh trưởng kém, lá bị vàng, xơ xác, khô và rụng từng đốt thân và cuối cùng cả cây bị chết khô, nhổ lên dễ dàng do bộ rễ đã bị phá hủy (Nguyễn Ngọc Châu, 1995) [1]

Kết quả điều tra năm 1997 - 1998, tác giả ghi nhận tuyến trùng

Meloidogyne spp gây hại 19 họ thực vật, gồm 74 loại cây trồng trong đó các

cây họ cà, bầu bí, họ hoa tán bị bệnh tương đối nặng (67,1 - 78,2%), cây họ hòa thảo, hoa thập tự bị hại nhẹ hơn (5 - 30%) Biện pháp canh tác như xới đất, tưới nước, che phủ đất bằng nilon sẽ làm giảm mật độ tuyến trùng (Lê Văn Thuyết

và ctv, 2000) [13]

Nghiên cứu biện pháp phòng trừ tuyến trùng hại cây trồng ở Việt Nam

Việc sử dụng các biện pháp hoá học phòng trừ dịch hại trong đất đã kéo

theo nhiều hậu quả không mong muốn ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ con người, gây ô nhiễm môi trường, biến đổi sâu sắc hệ sinh thái nông nghiệp Đến nay, ngoài các kỹ thuật canh tác chưa có biện pháp phòng trừ nào có hiệu quả Những kết quả nghiên cứu bước đầu đã cho thấy biện pháp sinh học sử dụng các vi sinh vật có khả năng sản sinh ra các chất làm tăng cường khả năng sinh trưởng-phát triển của cây trồng, tiêu diệt hoặc ức chế vi sinh vật gây bệnh ngày càng chứng tỏ ưu thế so với biện pháp sử dụng thuốc hoá học bảo vệ thực

vật Xu hướng này đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu

Hướng phòng trừ sinh học bệnh hại trên hồ tiêu đã được một số nhà khoa học nghiên cứu và có nhiều triển vọng Nghiên cứu về tình hình dịch hại

và đề xuất các biện pháp phòng trừ đối với vùng trồng tiêu thuộc các tỉnh Tây Nguyên, tác giả cho rằng bệnh hại rễ là các đối tượng xuất hiện phổ biến, gây

thiệt hại nghiêm trọng và rất khó phòng trừ Nấm Phytophthora spp và tuyến trùng Meloidogyne spp là quan trọng (Trần Thị Kim Loang, 2007) [5] Để

phòng trừ hiệu quả các loại bệnh hại nói trên cần phải kết hợp nhiều biện pháp, trong đó biện pháp thường xuyên sử dụng phân hữu cơ, phân bón lá kết hợp sử dụng hợp lý thuốc bảo vệ thực vật sẽ đem lại hiệu quả cao hơn Hiệu quả kiểm soát tuyến trùng của các loại phân hữu cơ có thể kéo dài cả năm (Phạm Thanh Sơn, 2004) [8]

Hướng phòng trừ sinh học bệnh hại trên hồ tiêu đã được một số nhà khoa học nghiên cứu và có nhiều triển vọng Đối với tuyến trùng có nhiều loài

nấm có khả năng tiêu diệt như Dactylella oviparasitica, Arthrobotrys oligospore, Verticillium chlamydosporium, Monacrosporium gepgyropagum

đã được thử nghiệm Đặc biệt, khi phối hợp giữa nấm với vi khuẩn Pasteuria penetrans thì hiệu quả phòng trừ Meloidogyne incognita tăng lên rõ rệt (Ngô Thị Xuyên, 2002) [17] Việc sử dụng tính chất đối kháng của một số loại vi sinh vật như nấm Trichoderma đang được sử dụng khá phổ biến trong phòng trừ nấm Phytophthora spp Hiện nay Viện Khoa học Kỹ thuật Nông lâm nghiệp Tây Nguyên đang nghiên cứu chế phẩm sinh học Trichoderma để phòng trừ bệnh do nấm Phytophthora spp gây ra trên cây ca cao và cây tiêu

Tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne incognita ký sinh ở phạm vi rộng

tại các vùng trồng hồ tiêu tại Quảng Trị Chiếm tỷ lệ vườn bị nhiễm tới 85,7%

và cấp bệnh là 3/5 Từ các kết quả khảo sát, tác giả đã đề xuất ngưỡng gây hại của loài này trên hồ tiêu là 120 con/250 cm3 thì cần phòng trừ Tuyến trùng

nốt sưng Meloidogyne incognita gây hại trên hồ tiêu ở Lệ Ninh, Bến Hải,

Quyết Thắng (Quảng Trị) làm cho lá vàng và rụng, năng suất giảm đáng kể Tác giả còn chỉ rõ để hạn chế tác hại của tuyến trùng nốt sưng trên hồ tiêu, cần phải áp dụng biện pháp quản lý tổng hợp Trong số các biện pháp thì sử

dụng thuốc thảo mộc sản xuất từ hạt và lá cây Bruca javanita với liều lượng

bột khô là 200 g/cây hoặc 3 - 4 kg lá tươi sẽ góp phần làm giảm số lượng tuyến trùng nốt sưng trên hồ tiêu (Nguyễn Ngọc Châu, 1995) [2]

Theo báo cáo khoa học của Viện Bảo vệ thực vật năm 2011 [16], Việt Nam đã có rất nhiều thành công trong phát triển các chế phẩm sinh học để phòng trừ dịch hại Nổi bật là phát triển các chế phẩm phân bón hữu cơ sinh học và các chế phẩm sinh học trừ dịch hại dạng phun trên tán cây Tuy nhiên, việc nghiên cứu phát triển các chế phẩm trừ dịch hại trong đất vẫn còn rất khiêm tốn Do yêu cầu khá chặt chẽ về điều kiện sử dụng các chế phẩm sinh học, như phải tránh ánh sáng trực xạ, cần độ ẩm không khí cao và biên độ nhiệt độ ít biến động, nên hiệu lực trừ dịch hại của các chế phẩm sinh học dạng phun lên tán cây ít mang lại thành công như mong muốn Mặt khác, ở vùng

rễ cây trồng luôn có nhiều tác nhân dịch hại và giữa chúng có tác động tương hỗ nhau trong quá trình xâm nhiễm Vì vậy, để phòng trừ dịch hại trong đất có hiệu quả cao cần tác động theo hướng tổng hợp, vừa hạn chế được tuyến trùng và nấm bệnh hại trong đất vừa tạo điều kiện giúp cây sinh trưởng tốt hơn

Viện Bảo vệ thực vật đã phân lập được 10 nguồn nấm Trichoderma thu

thập từ các mẫu đất, cây trồng bị bệnh (lúa, ngô, đậu tương, lạc ) nhưng chỉ xác định được có 5 chủng phát triển tốt, đã tuyển chọn được chủng

Trichoderma harzianum có hoạt lực cao và là nguồn được chọn để sản xuất chế phẩm Đã sản xuất được 2.100 kg chế phẩm nấm Trichoderma harzianum

PHẦN 3

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng (vật liệu) và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

- Tuyến trùng gây nốt sưng hại rễ hồ tiêu (Meloidogyne spp.) trong đất

và trong rễ hồ tiêu của vùng trồng tiêu Đắk Nông

- Loài nấm bệnh hại rễ hồ tiêu (Phytophthora spp và Fusarium spp.)

trong đất trồng hồ tiêu của Đắk Nông

- Cây hồ tiêu (Piper nigrum) - Cây giống Đắk Nông

- Chế phẩm sinh học SH-BV1 - Viện Bảo vệ thực vật

3.1.2 Thiết bị thí nghiệm

Tên thiết bị Hãng sản xuất Nước sản xuất

Micropipet 100 - 500,

Đức Đĩa Petri

Merch Que trang thủy tinh

Cốc đong 500ml

- Agar: Hạ Long, Việt Nam

- Đường Dextrose, Pepton, KH2 PO4, MgSO4.7H2O, : Merch, Đức

3.1.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường chọn lọc nấm Phytophthora spp (PSM) (Burgess L.W and

Môi trường chọn lọc nấm Fusarium spp (PPA-Pepton PCNb Agar)

(Burgess L.W and Hien P.T., 2009) [20]

3.1.4 Phạm vi nghiên cứu

- Nội dung 1: Đánh giá hiệu lực trừ tuyến trùng gây nốt sưng

Meloidogyne spp của chế phẩm sinh học SH-BV1 trong điều kiện phòng thí

nghiệm

- Nội dung 2: Đánh giá khả năng ức chế của nấm Trichoderma đối với nấm Phytophthora spp và nấm Fusarium spp trong điều kiện phòng thí

nghiệm

- Nội dung 3: Xác định liều lượng sử dụng chế phẩm sinh học SH-BV1

để phòng trừ tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne spp và nấm

Phytophthora spp., Fusarium spp hại rễ cây hồ tiêu trong điều kiện nhà lưới

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu: Viện Bảo vệ thực vật - Phường Đức Thắng,

Quận Bắc Từ Liêm, Hà Nội

- Thời gian thực hiện: Từ 4/3/2014 đến 7/6/2014

3.3 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Đánh giá hiệu lực trừ tuyến trùng gây nốt sưng

Meloidogyne spp của chế phẩm sinh học SH-BV1 trong điều kiện phòng thí

nghiệm

- Nội dung 2: Đánh giá khả năng ức chế của nấm Trichoderma đối với nấm Phytophthora spp và nấm Fusarium spp trong phòng thí nghiệm

- Nội dung 3: Xác định liều lượng sử dụng chế phẩm sinh học SH-BV1

để phòng trừ tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne spp và nấm

Phytophthora spp., Fusarium spp hại rễ cây hồ tiêu trong điều kiện nhà lưới

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Đánh giá hiệu lực trừ tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne spp của chế phẩm sinh học SH-BV1 trong điều kiện phòng thí nghiệm

Cân 100 gram chế phẩm SH-BV1 hòa với 500 ml nước cất Để dung dịch trong 1h, sau đó lọc dung dịch qua vải màn, lấy dịch trong

Thí nghiệm được bố trí với 4 công thức như sau:

Công thức 1: 1 ml dung dịch chế phẩm SH-BV1 + dịch chứa tuyến trùng Công thức 2: 2 ml dung dịch chế phẩm SH-BV1 + dịch chứa tuyến trùng Công thức 3: 3 ml dung dịch chế phẩm SH-BV1 + dịch chứa tuyến trùng

Công thức 4 (đối chứng): dịch chứa tuyến trùng

Mỗi đĩa petri lấy 15 ml dịch có chứa tuyến trùng và số dịch chiết chế phẩm theo các công thức, sau đó để trong điều kiện phòng thí nghiệm Mỗi công thức bố trí 3 lần nhắc lại Theo phương pháp nghiên cứu tại Viện Bảo vệ thực vật

- Chỉ tiêu theo dõi: Số tuyến trùng sống ở mỗi lần nhắc lại của các công

thức sau các ngày thí nghiệm

- Tính hiệu lực của chế phẩm theo công thức Henderson Tilton

ĐCttn: Đối chứng trước thí nghiệm

ĐCstn: Đối chứng sau thí nghiệm

CTttn: Công thức trước thí nghiệm

CTstn: Công thức sau thí nghiệm

3.4.2 Đánh giá khả năng ức chế của nấm Trichoderma đối với nấm Phytophthora spp và nấm Fusarium spp trong điều kiện phòng thí nghiệm

a Đối với nấm Phytophthora spp

Sử dụng phương pháp bẫy du động bào tử bằng cánh hoa Phương pháp

sử dụng mồi bẫy: Phương pháp của Erwin, D.C and Riberrio O.K (1996) (Burgess L.W, 2009) [20] Lấy mẫu đất từ vùng bị dịch nặng ở Tây Nguyên (Đăk Song, Đăk Nông) Cân 50g đất cho nước cất vô trùng vào tới khi đạt ¾ cốc Khuấy nhẹ đất trong cốc, để đất lắng xuống (qua đêm) Đặt mồi bẫy cánh hoa hồng (kích thước 0,5 x 0,5 cm) vào cốc nước trên để cốc bẫy bào tử qua đêm ở nhiệt độ phòng Quan sát cánh hoa sau 24h Khi thấy cánh hoa bị mất màu đưa cánh

hoa lên kính hiển vi quan sát thấy bào tử nấm Phytophthora spp ở mép cánh hoa bị mất màu Đặt cánh hoa bị mất màu lên môi trường PSM: Dùng panh

gắp cánh hoa bị mất màu khử trùng bằng cồn 700, đặt cánh hoa hồng có bào

tử nấm Phytophthora spp., đã được khử trùng lên môi trường PSM Sau 1

ngày, 2 ngày từ mép cánh hoa có hệ sợi nấm mọc ra, cắt hệ sợi nấm đặt lên

môi trường PSM Sau 1-2 ngày soi khuẩn lạc nấm trên kính hiển vi để kiểm

tra lại nấm Phytophthora spp., cắt đỉnh sinh trưởng của nấm Phytophthora

spp đặt lên môi trường PDA kháng sinh 2-3 lần để làm thuần

b Đối với nấm Fusarium spp

Đất nghiền nhỏ, trộn đều, cân 10 gram đất pha với 90 ml nước cất vô trùng được nồng độ pha loãng 10-1, sau đó lấy 5 ml dung dịch 10-1 pha với 45ml nước cất được nồng độ pha loãng 10-2, tiếp tục pha loãng đến nồng độ

10-3, dùng micropipet lấy 100 µl dung dịch pha loãng nồng độ 10-3 trang đều vào đĩa môi trường PPA dùng que trang thủy tinh tam giác trang đều sau đó

úp ngược đĩa môi trường xuống, sau 5-7 ngày chọn các khuẩn lạc điển hình

trên môi trường PPA soi trên kính hiển vi kiểm tra bào tử Fusarium spp., cấy

truyền các khuẩn lạc điển hình đó lên môi trường PPA Sau 5 ngày, dùng kính hiển vi soi và cắt đỉnh sinh trưởng của khuẩn lạc đặt lên môi trường PDA kháng sinh 2-3 lần để làm thuần

Cấy đối xứng nấm Trichoderma hazianum (thành phần nấm đối kháng

có trong chế phẩm SH-BV1 đã được phân lập và làm thuần trên môi trường

PDA) vào cùng một đĩa petri có chứa nấm Phytophthora spp hoặc Fusarium spp Cấy nấm Phytophthora spp hoặc Fusarium spp ra các đĩa petri riêng để

làm đối chứng Sau đó quan sát đường kính của các tản nấm (ở cả đối kháng

và đối chứng) Cấy 5 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 2 đĩa

Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính tản nấm sau cấy 5 ngày, 7 ngày và 10 ngày Tính hiệu quả ức chế của nấm Trichoderma hazianum đối với nấm Phytophthora spp và Fusarium spp theo công thức Abbott

ĐCstn - CTstn

C (%) = x 100

ĐCstnTrong đó:

C: Hiệu quả ức chế (%)

CTstn : Công thức sau thí nghiệm

ĐCstn: Đối chứng sau thí nghiệm

3.4.3 Xác định liều lượng sử dụng chế phẩm sinh học SH-BV1 để phòng trừ tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne spp và nấm Phytophthora spp., Fusarium spp hại rễ hồ tiêu trong điều kiện nhà lưới

Thí nghiệm được bố trí với 4 công thức, tương ứng với các liều lượng bón khác nhau, cụ thể như sau:

Công thức 1: 13g chế phẩm SH-BV1/chậu 3kg đất

Công thức 2: 17g chế phẩm SH-BV1/chậu 3kg đất

Công thức 3: 26g chế phẩm SH-BV1/chậu 3kg đất

Công thức 4 (đối chứng): không bón chế phẩm

Mỗi công thức trồng 10 chậu, mỗi chậu trồng 3 cây, chiều cao cây 40cm Lây nhiễm tuyến trùng và nấm bệnh Sau đó theo dõi đánh giá hiệu lực của chế phẩm SH-BV1 ở các công thức thí nghiệm được tiến hành theo các bước sau:

30 Bước 1: Chuẩn bị đất: Đất trồng được trộn theo tỷ lệ 80% đất và 20%

mùn hữu cơ Sau đó, hấp khử trùng ở điều kiện 1210C trong 45 phút Sử dụng loại chậu cao su được rửa sạch, phơi khô trước khi làm thí nghiệm

- Bước 2: Trồng hồ tiêu: Chậu được lót một lớp nilon Sử dụng cây

giống sạch bệnh, đã được kiểm tra không có tuyến trùng trong đất và rễ, cây sinh trưởng và phát triển tốt, được trồng trong bầu có đường kính 10cm, cao 15cm Cân 2,3kg đất và mùn hữu cơ đã khử trùng cho mỗi chậu, trộn đều với chế phẩm (tuỳ theo từng công thức) Đổ 1/3 khối lượng đất vào chậu, bóc bỏ túi nilon làm bầu cây giống và đặt cây vào giữa chậu Sau đó đổ số đất còn lại vào chậu, tưới nhẹ xung quanh gốc Sau 1 tuần cây sinh trưởng ổn định, chọc

3 lỗ đáy để thoát nước Chậu luôn được đặt trên đĩa nhựa để giữ tuyến trùng Hàng ngày chăm sóc, vệ sinh và tưới đủ ẩm cho cây

- Bước 3: Nhiễm tuyến trùng: Nguồn đất được lấy từ vùng trồng hồ tiêu

bị tuyến trùng hại nặng tại Đắk Song (Đắk Nông) đem về phòng thí nghiệm Viện Bảo vệ thực vật Đất lấy về được trộn đều và cân 0,7kg cho vào mỗi chậu, giữ 1 phần lại để kiểm tra tuyến trùng và nấm bệnh có trong đất trước khi làm thí nghiệm

Phương pháp xác định mật độ tuyến trùng trong đất và trong rễ

- Xác định mật độ tuyến trùng trong đất: Tuyến trùng được lọc bằng

phương pháp lọc Berman có cải tiến (Burgess L.W, 2009) [20] Cân 50g đất cho vào rây (rổ nhựa) có đường kính 15 x 15cm, bên trong rây (rổ nhựa) đặt một mảnh giấy lọc, sau đó đặt lên một đĩa trũng lòng vừa với kích thước rây lọc (Chú ý: không cho đất và tàn dư thực vật rơi xuống đĩa), cho nước sạch vào và giữ mực nước xấp xỉ bề mặt đất trong rây (rổ nhựa) Sau 24h tuyến trùng

sẽ di chuyển qua màng lọc xuống đĩa, bỏ rây lọc (rổ nhựa) ra khỏi đĩa Đổ nước trong đĩa ra cốc và đếm số lượng tuyến trùng có trong nước ở mỗi đĩa

+ Chỉ tiêu theo dõi: Mật độ tuyến trùng trong đất (con/50g đất)

- Xác định mật độ tuyến trùng trong rễ: Mỗi đợt theo dõi lấy 3 chậu, cắt

lấy toàn bộ rễ cây Các mẫu rễ thu được rửa sạch, cắt thành đoạn 0,2 - 0,5cm cho vào rây (rổ nhựa) có đường kính 15 x 15cm, bên trong rổ nhựa đặt một mảnh giấy lọc Sau đó, đặt lên một đĩa trũng lòng vừa với kích thước rây lọc, cho nước sạch vào và giữ mực nước xấp xỉ bề mặt đất trong rây (rổ nhựa) Sau 48h,

bỏ rây lọc (rổ nhựa) ra khỏi đĩa Đổ nước trong đĩa ra cốc và đếm số lượng tuyến trùng có trong nước ở mỗi đĩa

+ Chỉ tiêu theo dõi:

• Mật độ tuyến trùng có trong rễ (con/5g rễ)

• Tình trạng sinh trưởng của cây và sự phát triển của bộ rễ (cân nặng, chiều dài bộ rễ)

Tính hiệu lực của chế phẩm theo công thức Abbot:

Phương pháp phân tích nấm trong đất trồng hồ tiêu

- Đối với nấm Phytophthora spp

Sử dụng phương pháp bẫy du động bào tử bằng cánh hoa Phương pháp

sử dụng mồi bẫy: Phương pháp của Erwin, D.C and Riberrio O.K (1996) [21] Lấy mẫu đất ở các công thức, cân 50 g đất ở mỗi lần nhắc lại của các công thức, cho đất vào cốc, thêm nước cất vô trùng vào tới khi đạt 3/4 cốc Khuấy nhẹ đất trong cốc, để đất lắng xuống (qua đêm) Cắt cánh hoa hồng có màu sắc 0,5 x 0,5 cm (1 mồi bẫy) thả vào cốc nước trên Mỗi cốc thả 50 mồi, để ở nhiệt độ phòng Theo dõi số cánh hoa bị mất màu sau 24h Đếm số mồi bẫy bị mất màu

- Chỉ tiêu theo dõi: Số cánh hoa bị mất màu

- Tính hiệu lực của chế phẩm theo công thức Henderson Tilton

- Đối với nấm Fusarium spp

Đất được nghiền nhỏ, trộn đều, lấy 10 gram đất sau đó pha với 90 ml nước cất vô trùng được nồng độ pha loãng là 10-1, sau đó lấy 5 ml dung dịch trên hoà với 45 ml nước cất ta được nồng độ pha loãng 10-2, tiếp tục pha loãng đến nồng độ 10-3, dùng micropipet lấy 100 µl dung dịch 10-3 trang đều vào đĩa môi trường PPA, sau 5-7 ngày đếm số lượng khuẩn lạc nấm hình thành trên đĩa petri

Công thức tính số lượng bào tử nấm/g đất:

∑ C

N =

d x V x n Trong đó:

N là số vi sinh vật trong một đơn vị kiểm tra (CFU/g hoặc ml)

∑ C là tổng số khuẩn lạc đếm trên các đĩa Petri

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1 Hiệu lực phòng trừ tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne spp của

chế phẩm sinh học SH-BV1 trong điều kiện phòng thí nghiệm

Bố trí thí nghiệm với 4 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại Qua quá trình theo dõi trước và sau xử lý chế phẩm của các ngày có kết quả như

bảng sau:

Bảng 4.1: Hiệu lực trừ tuyến trùng (Meloidogyne spp.) hại rễ hồ tiêu của chế

phẩm sinh học SH-BV1 trong điều kiện phòng thí nghiệm

Hiệu lực (%)

Số lượng tuyến trùng (con)

Hiệu lực (%)

Số lượng tuyến trùng (con)

Hiệu lực (%)

Số lượng tuyến trùng (con)

Hiệu lực (%)

Số lượng tuyến trùng (con)

Hiệu lực (%)

Ghi chú: a, b, bc, c là chỉ số thể hiện sự sai khác có ý nghĩa khi xử lý bằng phần

mềm Statistix 8.2 Trong đó, trên cùng một cột các công thức có chỉ số giống nhau thể hiện

sự sai khác không có ý nghĩa ở mức 95%, các công thức khác nhau có chỉ số khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa ở mức 95%

CT1: 1ml dịch chiết chế phẩm SH-BV1 + 15 ml dịch chứa tuyến trùng (6,67% dịch chiết)

CT2: 2ml dịch chiết chế phẩm SH-BV1 + 15 ml dịch chứa tuyến trùng (13,33% dịch chiết) CT3: 3ml dịch chiết chế phẩm SH-BV1 + 15 ml dịch chứa tuyến trùng (20,00% dịch chiết) CT4 (Đ/C): 15 ml dịch chứa tuyến trùng

Hình 4.1 Hiệu lực trừ tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne spp hại rễ

hồ tiêu của chế phẩm SH-BV1 trong phòng

Kết quả thí nghiệm đánh giá hiệu lực trừ tuyến trùng gây nốt sưng

(Meloidogyne spp.) của chế phẩm sinh học SH-BV1 trong điều kiện phòng thí

nghiệm, kết quả bảng 4.1 cho thấy, chế phẩm có hiệu quả cao đối với tuyến

trùng (Meloidogyne spp ) hại rễ hồ tiêu Tuy nhiên, hiệu quả của chế phẩm

phụ thuộc vào nồng độ của chế phẩm và thời gian xử lý Trong 3 công thức nồng độ thí nghiệm thì công thức 3 với nồng độ 3ml dịch chiết chế phẩm/đĩa petri (20% dịch chiết chế phẩm) có hiệu lực đạt cao nhất là 98,95%, tiếp đến là công thức 2 đạt 85,55% (13,33% dịch chiết chế phẩm) và thấp nhất là công thức

1 đạt 65,48% (6,67% dịch chiết chế phẩm) sau 5 ngày xử lý chế phẩm SH-BV1

Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy chế phẩm bắt đầu có hiệu quả từ ngày thứ nhất, tuy nhiên hiệu lực đạt không cao 17,78% đến ngày thứ 2 sau

xử lý hiệu lực của chế phẩm đạt tới 50,76% và kết quả đạt cao nhất vào ngày thứ 5 sau xử lý là 98,95% (20% dịch chiết chế phẩm)

Hình 4.2 (A) Thí nghiệm hiệu lực trong phòng

Tuyến trùng Meloidogyne spp (B)

Hình 4.2 (A): Đĩa chứa nước tuyến trùng theo các liều lượng dịch chiết chế phẩm ở từng công thức, từ trái qua phải lần lượt là công thức 1, 2, 3, 4 và từ trên xuống dưới là các lần nhắc lại 1, 2, 3

4.2 Khả năng ức chế của nấm Trichoderma đối với nấm Phytophthora spp và nấm Fusarium spp trong điều kiện phòng thí nghiệm

4.2.1 Khả năng ức chế của nấm Trichoderma hazianum đối với nấm Phytophthora spp

Sau khi đã phân lập và làm thuần được nấm Phytophthora spp từ đất, cấy Trichoderma hazianum đối xứng với Phytophthora spp vào cùng một đĩa petri và cấy Phytopthora spp ra đĩa riêng để làm đối chứng, cấy 5 lần nhắc

lại, mỗi lần nhắc lại cấy 2 đĩa Sau các ngày theo dõi có kết quả sau:

Bảng 4.2: Hiệu quả ức chế của nấm Trichoderma hazianum đối với

nấm Phytophthora spp trong phòng thí nghiệm

Nhắc

lại

Đường kính tản nấm Phytophthora spp sau cấy

Đối kháng

(cm)

Đối chứng (cm)

Hiệu quả

ức chế (%)

Đối kháng (cm)

Đối chứng (cm)

Hiệu quả

ức chế (%)

Đối kháng (cm)

Đối chứng (cm)

Hiệu quả

ức chế (%)

Ghi chú: a, b là chỉ số thể hiện sự sai khác có ý nghĩa khi xử lý bằng phần mềm

Statistix 8.2 Trong đó, trên cùng một hàng các công thức có chỉ số khác nhau thể hiện sự

sai khác có ý nghĩa ở mức 95%

Hình 4.3 Hiệu quả ức chế của Trichoderma hazianum tới Phytophthora

spp trong điều kiện phòng thí nghiệm sau các ngày theo dõi

Qua theo dõi quá trình phát triển của nấm Trichoderma hazianum và Phytophthora spp cho thấy, sau cấy 2 ngày cả hai nấm đều phát triển nhanh

trên môi trường PDA không kháng sinh, đến ngày thứ 3 giữa vùng nấm gây

bệnh và nấm Trichoderma hazianum hình thành một đường ranh giới rõ gọi là

“viền đối kháng” Từ ngày thứ 4 sau cấy trở đi nấm Trichoderma hazianum

ký sinh lên sợi nấm Phytophthora spp làm cho sợi nấm gây bệnh teo và chết

dần Kết quả ở bảng 4.2 cho thấy, sau cấy 5 ngày hiệu quả ức chế của

Trichoderma hazianum đối với nấm Phytophthora spp đạt 50,23%; đạt 54,77%

vào ngày thứ 7 sau cấy và ngày thứ 10 sau cấy hiệu quả ức chế đạt 61,14%

Sau cấy 5 ngày, nấm Phytophthora spp có đường kính là 4,38 cm và chỉ sau 10 ngày đường kính tản nấm Phytophthora spp đã giảm xuống còn 3,42 cm (đối kháng có Trichoderma hazianum), tuy nhiên ở công thức đối chứng (không có Trichoderma hazianum) nấm Phytophthora spp sinh trưởng

và phát triển tốt đạt đường kính tối đa (8,80 cm) sau 5 ngày cấy

Hình 4.4 Bẫy Phytophthora spp (A) cánh hoa tươi - (B) cánh hoa bị mất màu

(A) Cánh hoa hồng (bẫy) trong cốc nước trước thí nghiệm, các bẫy còn tươi không bị mất màu (B) Mép cánh hoa bị mất màu sau 24h, có biểu hiện bạc màu cánh hoa (cánh hoa bị biến màu)

Hình 4.5 Bào tử nấm Phytophthora spp ở mép cánh hoa bị mất màu (A) Tản nấm Phytophthora spp trên môi trường PDA sau 5 ngày (B)

(A) Mép cánh hoa soi trên kính hiển vi, bào tử nấm Phytophthora spp các

quả bào tử bắn ra Túi bào tử giống hình quả chanh dây

(B) Tản nấm Phytophthora spp trên môi trường PDA sau 5 ngày có hình

bông hoa, mặt mịn trên môi trường

4.2.2 Khả năng ức chế của Trichoderma hazianum với nấm Fusarium spp trong phòng thí nghiệm

Sau khi đã phân lập và làm thuần được nấm Fusarium spp từ đất, cấy Trichoderma hazianum đối xứng với Fusarium spp vào cùng một đĩa petri và cấy Fusarium spp ra đĩa riêng để làm đối chứng, nhắc lại 5 lần, mỗi lần nhắc

lại cấy 2 đĩa Sau các ngày theo dõi được kết quả như bảng 4.3:

B

A