Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase

Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase

Bài báo biến tính tinh bột cyclomaltodextrinase GVHD: Nguyễn Minh Hải BIẾN TÍNH TINH BỘT BẰNG CÁCH SỬ DỤNG CYCLOMALTODEXTRINASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS ƯA KIỀM ĐỂ LÀM GIẢM HÀM LƯỢNG AMYLOSE Cyclomaltodextrinase (CDase) phân lập từ vi khuẩn Bacillus ưa kiềm sp I-5 (CDase I-5) tồn dạng dodecameric, nhóm gồm sáu dimer, vị trí xúc tác enzyme nằm rãnh hẹp bề mặt đơn vị dimer Hình 1: Dạng dodecameric Hình 2: Dạng dimers [2] Do hình dạng hình học vị trí xúc tác, enzyme phân biệt kích thước phân tử chất Một phân tích phản ứng thủy phân enzyme cho thấy giá trị k cat/Km amylose 14.6 s-1(mg/mL)-1, amylopectin 0.92 s-1(mg/mL)-1, cho thấy ưa thích cao enzyme amylose CDase I-5 dùng để biến tính cấu trúc tinh bột để tạo sản phẩm tinh bột có hàm lượng amylose thấp cách ủ tinh bột gạo với enzyme Chúng ta thấy lượng amylose tinh bột gạo giảm từ 28.5% xuống 9%, lượng amylopectin giữ nguyên với thay đổi không đáng kể xếp chiều dài chuỗi Tinh bột gạo xử lý CDase I-5 trữ nhiệt độ 4ºC ngày, tốc độ thoái hóa chậm so sánh với tốc độ thoái hóa mẫu kiểm soát Giới thiệu Tinh bột nguồn cung ứng carbonhydrate chủ yếu thực vật, tìm thấy dạng hạt Tinh bột bao gồm chủ yếu hai polymer khác cấu trúc amylose amylopectin Amylopectin (AP) polymer có chứa liên kết D-glucose α-(1,4) với 4-5% liên kết α-(1,6) mạch Nhóm Trang Bài báo biến tính tinh bột cyclomaltodextrinase GVHD: Nguyễn Minh Hải nhánh, amylose (AM) chủ yếu liên kết α-(1,4) D-glucan mạch thẳng với nhánh Tỉ lệ AM AP tinh bột khác nhau, phụ thuộc phần lớn vào nguồn gốc thực vật Ví dụ, tinh bột bắp hàm lượng amylose cao (50-70%), tinh bột dạng sáp không chứa amylose Tỉ lệ AM/AP khác tinh bột thực vật gây nên khác biệt tính chất, chức năng, dinh dưỡng Bảng 1: Bảng so sánh khác amylose amylopectin [1] Chỉ tiêu so sánh Amylose Amylopectin Cấu tạo Liên kết 1,4-glucoside Liên kết 1,4-glucoside liên kết 1,6 Chỉ có đầu khử Có đầu không khử đầu khử Phân tử lượng 3.105-1.106 5.104-1.106 Độ hòa tan Dễ hòa tan nước ấm Chỉ hòa tan đun nóng Độ nhớt Không cao Cao Phản ứng với Iot Tạo phức hợp có màu xanh Tạo phức hợp có màu tím đỏ Độ bền Dễ bị thoái hóa nhiệt độ hạ thấp (tạo gel vô định hình, kết tủa không thuận nghịch…) Không có xu hướng kết tinh phân tử cồng kềnh Khả giữ nước Kém Tốt Khả trương phồng Thấp Cao Enzyme làm thoái hóa cyclodextrin biết đến cyclomaltodextrinase (CDases; E.C 3.2.1.54) thủy phân cyclomaltodextrins hiệu (CDs), có cấu tạo oligomer glucose dạng vòng liên kết liên kết α-D-(1,4) glycosidic Gen mã hóa CDase nhân lên từ Bacillus sp I-5 ưa kiềm, cấu trúc gen, đặc tính hóa sinh, cấu trúc protein 3D CDase I-5 mô tả phòng thí nghiệm Gen CDase I5 gồm hệ thống 559 amino acid với trọng lượng phân tử tương đối 65kDa Cấu trúc 3D CDase I-5 cho thấy enzyme tồn dạng dodecameric, gồm dimer CDase I-5 tinh thủy phân cyclomaltoheptaose (β-CD) tinh bột pullulan hòa tan mô tả hoạt động chuyển hóa glucosyl Những đặc tính enzyme CDase phân biệt với đặc tính enzyme α-amylase điển hình (ví dụ TAKAamylase A (TTA; E.C 3.2.1.1) từ Aspergillus oryzae) Một nghiên cứu cho thấy TTA không thủy phân CDs có vài loại α-amylose thủy phân CDs tốc độ chậm Rãnh trung tâm hoạt động enzyme làm thoái hóa CD dạng nhị trùng (dimeric) để hình thành đường rãnh hẹp sâu đỉnh khối, tâm hoạt động rộng cạn quan sát α-amylase Sự ưa thích chất CDase theo CDs dạng phẳng mỏng giải thích hình dáng đặc thù tâm hoạt động CDase Hành động phân biệt mẫu CDase sử dụng để sản xuất tinh bột hàm lượng amylose thấp việc làm biến đổi phân tử amylose Trong nghiên cứu này, hành động phân biệt mẫu Bacillus I-5 ưa kiềm CDase (CDase I-5) cấu trúc tinh bột kiểm tra số lượng; khả ứng dụng kiểm tra việc chế biến thức ăn giàu tinh bột cách đánh giá hiệu chống thoái hóa tinh bột gạo xử lý CDase Enzyme biến tính tinh bột sử dụng để làm giảm độ nhớt cải thiện ổn định gel, cảm quan, dáng vẻ, cấu trúc, tạo khả kháng nhiệt cho tinh bột Ngoài ra, CDase I-5 sử dụng để sản xuất tinh bột không chứa amylose, mối quan tâm nhiều ngành công nghiệp 2.1 Nguyên liệu phương pháp Nguyên liệu: Amylose, amylopectin tinh bột cung cấp từ tập đoàn Sigma-Aldrich (St Louis, MO) Các chất hóa học khác sử dụng loại hóa chất công bố 2.2 Tinh sạch protein, dòng vi khuẩn và plasmids Nhân dòng gen vi khuẩn E Coli CDase của Bacillus I-5 ưa kiềm được tinh sạch từ canh trường của vi khuẩn E Coli MC1061([ F¯, araD139, araABC-leu] 7696, galU, kalK, lacX74, rpsL, t6hi, hsdR2, mcrB) chứa gen CDase thể plasmid pUC18 Để mô tả đặc tính enzyme của CDase I-5, protein được sản xuất từ E coli tái tổ hợp MC1061  Phương pháp sắc kí trao đổi ion: mục đích để tách protein từ chủng E coli tái tổ hợp MC1061 Nguyên tắc: Tại điểm pH trừ điểm đẳng điện, protein có mang điện tích tương ứng với điểm pH Dựa vào điện tích thực chúng điểm pH định, ta phân tách hỗn hợp protein.[3] Trong phương pháp này, pha tĩnh hạt mang sẵn điện tích định, hạt tương tác với phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng Cụ thể, hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình gọi sắc ký trao đổi ion dương, tương tác với phân tử mang điện tích dương Ngược lại, hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl- Nhóm Trang Bài báo biến tính tinh bột cyclomaltodextrinase GVHD: Nguyễn Minh Hải cellulose (DEAE-cellulose)), gọi sắc ký trao đổi ion âm, tương tác với phân tử mang điện tích âm Vì thế, protein dấu với cột chạy khỏi cột protein trái dấu bị giữ lại cột Để phóng thích protein này, ta tăng nồng độ ion pha động, ion thay phân tử protein tương tác với hạt mang điện tích Ví dụ, sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác dung dịch tách giải ion natri tranh bám vào cột với protein có điện tích dương, đó, protein mang điện tích dương phóng thích cột theo độ lớn điện tích Hình 3: Phương pháp sắc ký trao đổi ion  Tủa muối ammonium sulfate: sau tách thành phần protein hỗn hợp ta tiến hành tách sơ enzyme CDase I-5 phương pháp tủa muối ammonium sulfate Nguyên tắc: Ở nồng độ muối cao, phần lớn protein giảm tính hòa tan, tượng gọi tủa muối Mỗi loại protein kết tủa nồng độ muối định Vì vậy, tượng tủa muối dùng để phân đoạn protein CDase I-5 phần lớn bị kết tủa có mặt 50% (w/v) ammonium sulfate Sau lượng muối loại bỏ phương pháp thẩm tách  Cuối enzyme CDase tinh FPLC sử dụng cột Q-sepharose cột DEAE-8HR Phương pháp FPLC ( Fast protein liquid chromatoraphy) kỹ thuật tương tự sắc kí lỏng cao áp HPLC, sử dụng để phân tách làm protein hỗn hợp Nguyên tắc: lượng nhỏ hỗn hợp cần phân tách theo pha động đưa vào đầu cột, tiếp xúc với pha tĩnh bên cột Do lực khác cấu tử pha tĩnh pha động mà chúng phân bố vị trí khác bên cột pha động lôi khỏi cột sắc kí với vận tốc khác Những cấu tử có lực lớn với pha động pha động lôi kéo với vận tốc lớn tách khỏi cột nhanh hơn, cấu tử có lực yếu với pha động khỏi cột chậm Điều đặc trưng thời gian lưu cấu tử cột sắc kí Sau khỏi cột, cấu tử đầu dò ghi nhận truyền tín hiệu cho máy tính xử lý, từ ta định tính định lượng cấu tử mẫu Nhóm Trang Bài báo biến tính tinh bột cyclomaltodextrinase GVHD: Nguyễn Minh Hải Pha tĩnh hạt nhựa agarose liên kết ngang pha động dung môi không phân cực hexane Áp lực sử dụng phương pháp tối đa 3-4Mpa Hình 4: Phương pháp FPLC Sau tiến hành phương pháp FPLC CDase I-5 tinh Để kiểm tra độ tinh Cdase I-5 ta sử dụng phương pháp SDS-PAGE nêu phần 2.3 Hoạt động enzym Hoạt động CDase I-5 thử nghiệm phương pháp xác định nồng độ đường khử 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) Hỗn hợp thử nghiệm chứa 0.5% (w/v) β-CD 0.1% (v/v) CDase I-5 50mM dung dịch đệm sodium phosphate (pH 7.0) ủ 50 oC vòng 10 phút Phản ứng ngừng lại thêm gấp lần dung dịch DNS (v/v) đun sôi khoảng phút Khả hấp thụ hỗn hợp phản ứng đo 575 nm Đương lượng liên kết glycosidic bị thủy phân đương lượng đường maltose dựa đường cong maltose chuẩn Một đơn vị hoạt động enzym xác định lượng enzym giải phóng 1µmol đường khử phút 2.4 Nghiên cứu động học dựa thủy phân chất khác Phương pháp copper bicinchoninate (BCA) thực để đo nồng độ đường khử sinh trình thủy phân enzyme, thông số động học CDase I-5 loại chất khác (β-CD, amylase, amylopectin) xác định để so sánh đặc trưng riêng loại chất 2.5 Hàm lượng amylose amylopectin Hàm lượng amylose tinh bột đo phương pháp iot Ví dụ cân xác 100 mg mẫu tinh bột cho vào bình Erlen 50ml với 1ml ethanol 95% ml NaOH 1N Sau đun sôi 10 phút để hồ hóa tinh bột Sau làm nguội xuống nhiệt độ phòng cho vào bình thể tích 100ml định mức lên 100ml nước cất Hút 5ml dung dịch hồ tinh bột vào bình 100ml cho vào 1ml acid acetic 1N 2ml dung dịch iot (0.2g iot 2.0g potassium iodide 100ml nước) Sau dung dịch định mức lên 100ml nước cất, lắc để yên 20 phút Dùng máy quang phổ đo khả hấp thụ 620nm Để xác định thay đổi tỷ lệ thành phần riêng lẻ phản ứng CDase I-5, tinh bột gạo bình thường hòa tan DMSO 90% cách gia nhiệt sử dụng chất cho phản ứng Hỗn hợp phản ứng bao gồm 0.5% tinh bột gạo CDase I-5 (1U/mg chất) 50mM dung dịch đệm sodium phosphate, hàm lượng amylose, amylopectin lượng đường khử phân tích thời gian 10, 30, 60 phút Hàm lượng amylose đo theo phương pháp hấp thụ iot, hàm lượng đường khử đo theo phương pháp DNS lượng đường maltose Hàm lượng amylopectin tính cách lấy tổng trừ hàm lượng amylose đường khử Cách xác định hàm lượng đường khử phương pháp DNS • Nguyên tắc: Phương pháp dựa sở phản ứng tạo màu đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS) Cường độ màu hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử phạm vi định Tiến hành so màu bước sóng 540nm Dựa theo đồ thị đường chuẩn glucose tinh khiết với thuốc thử DNS tính hàm lượng đường khử mẫu nghiên cứu [4] Nhóm Trang Bài báo biến tính tinh bột cyclomaltodextrinase GVHD: Nguyễn Minh Hải Một số kiến thức thuốc thử DNS Thuốc thử DNS (dinitrosalicylic acid), bao gồm thành phần như:  Nước cất 60-70 ml  NaOH rắn 1,6g  Acid Dinitrosalicylic (DNS: C7H4N2O7) 1g  Muối seignette (C4H4O6KNa.4H2O) 30g Khuấy tan hỗn hợp máy khuấy từ định mức đến vạch 100ml bình định mức Thuốc thử bảo quản điều kiện nhiệt độ thấp tránh ánh sáng • Cách thực Chuẩn bị mẫu phân tích: Chuẩn bị mẫu trắng: Dùng ống nghiệm cho vào ống nghiệm dung dịch glucose chuẩn 0,1%, nước cất, thuốc thử DNS Chuẩn bị mẫu chuẩn: Dùng ống nghiệm, cho vào ống dung dịch mẫu, nước cất, thuốc thử DNS Đun cách thủy: Đun sôi cách thủy ống nghiệm thời gian phút Sau đó, làm nguội nhanh đến nhiệt độ phòng Phân phối mẫu: Đổ ống nghiệm vào cuvet nhựa, sau đó, tiến hành đo mật độ quang Đo: Dùng máy quang phổ so màu UV-VIS đo mật độ quang bước sóng 540nm với mẫu chuẩn mẫu trắng Xử lý số liệu Sau tiến hành đo mật độ quang cuả mẫu trắng mẫu chuẩn xử l ý số liệu thu được, dựa vào đường cong chuẩn suy hàm lượng đường khử 2.6 Sự cô cạn protein Một lượng protein đo phương thức miêu tả Bradford Hỗn hợp phản ứng bao gồm 100 ml dung dịch enzyme loãng 900 ml dung dịch Bradford (100 mg thuốc thử Coomassie Brillant Blue G-250 50 ml ethanol, 100 ml acid phosphoric 85% 850 ml nước cất) Hỗn hợp phản ứng thực nhiệt độ phòng khoảng phút sau khả hấp thụ đo 595 nm phương pháp quang phổ Mẫu trắng chuẩn bị việc thay dung dịch enzym dung dịch đệm Sử dụng serum albumin (BSA) để xây dựng đường cong chuẩn Từ đường cong chuẩn suy đoán lượng protein cần xác định 2.7 SDS- PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) Protein điện di gel polyacrylamide không liên tục với có mặt SDS (sodium dodecyl sulfate) Nguyên tắc: Sự tách protein phụ thuộc vào va chạm protein bên môi trường điện tích phân tử protein Sự di chuyển = (điện thực nghiệm)(lưới điện tích phân tử) Sự va chạm phân tử Protein mang điện tích âm mang diện tích dương Điều phụ thuộc vào pH dung dịch pI chúng Protein mang điện tích âm pH > pI mang điện tích dương pH < pI Điện tích điện thực nghiệm định protein di chuyển bao xa từ trường Điện cao điện tích protein mạnh di chuyển phân tử protein từ trường lớn Khi có va chạm di chuyển protein giảm Ngoài hình dạng kích thước phân tử protein định di chuyển phân tử protein môi trường gel Nhóm Trang Bài báo biến tính tinh bột cyclomaltodextrinase GVHD: Nguyễn Minh Hải Khi điện di gel polyacrylamide, protein phản ứng với chất hoạt động bề mặt mang điện tích âm SDS (Sodium Dodecy Sulfate) để tạo thành phức hợp mang điện tích âm di chuyển phía cực dương điện trường Thêm vào chất khử Mercaptoethanol Dithithreitol (DTT) để phá vỡ cầu nối disulfur (-S-S-) Nghĩa sau xử lí với SDS, protein trở thành dạng phân tử polymer cấu trúc Đồng thời, SDS tạo thành lớp vỏ ion làm phân tử protein tích điện âm đồng Nhờ đó, di chuyển gel phân tử protein điều kiện phụ thuộc vào kích thước Những phân tử nhỏ kích thước lỗ gel di chuyển xuyên qua gel, phân tử lớn lỗ gel gần không di chuyển Những phân tử có kích thước trung bình di chuyển gel với nhiều vận tốc khác Từ đó, ta tách hỗn hợp protein Khi SDS, điện di phân tách loại protein lúc có yếu tố khác loại protein trọng lượng phân tử, tổng điện tích điểm đẳng điện Hình 5: Gel polyacrylamide Chuẩn bị gel phân tách mẫu: Gel polyacrylamide 10% tạo cách trùng hợp polyme hóa 33,5% acrymide (CH 2=CH-CH2)và 0.3% N,N’methylendiacrylamide [CH2(NHCOCH=CH2)2] với có mặt chất xúc tác thích hợp Chất xúc tác hỗn hợp amonium persufat 0.10.3% (khối lượng) N,N,N’,N’- tetramethylen ethylen diamin (TMED) Thành phần gel phân tích bao gồm: 12ml dung dịch acrylamide/ bisacrylamide, 15.2ml dung dịch đệm Tris HCl 1M (pH=9.0), 0.4ml dung dịch SDS 10%, 11.2 ml nước cất, 1ml ammonium persulfate 3% 20ml TMED Ngoài ta chuẩn bị gel phân tích gồm: 1.3ml dung dịch acrylamide 4% (30% acrylamide 0.44% N,N’methylendiacrylamide), 2.5 ml dung dịch đệm Tris HCl 1M (pH= 6.8), 0.1 ml dung dịch SDS 10%, 6.1 ml nước cất, 0.1ml ammonium persulfate 3% 20µL TMED Dung dịch đệm điện di bao gồm: 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS (pH=8.3) Mẫu phối trộn với lần thể tích dung môi đệm (0.25 M dung dịch Tris-HCl (pH=6.8), 10% β-mercaptoethanol, 4% SDS, 20% glycerol 0.004% bromophenol blue, dung môi bảo quản nhiệt độ -70ºC trước sử dụng) đun nóng phút trước chạy điện di gel Cách thực hiện: Tạo khuôn gel: gel polyacrylamide thường đặt đứng, để chế gel cần sử dụng thủy tinh có kết cấu chuyên dụng để làm khuôn Rửa thủy tinh nước sạch, để khô lau lại ethanol Ráp thủy tinh theo hướng dẫn hãng sản xuất cho tạo khoảng hở hai thủy tinh bịt kín để không làm chảy nguyên liệu tạo gel rót vào Tiến hành bơm gel polyacrylamide vào khuôn thủy tinh Sau 15-30 phút, gel gần cứng tiến hành bơm dung dịch điện di vào hai buồng điện di, bơm 5-15 µm mẫu vào giếng theo thứ tự, đậy hộp điện di, đóng điện tiến hành chạy điện ổn định dòng mA/ giếng Khoảng 1h sau vạch màu thị xuống gần đáy gel, tách điện lấy gel nhuộm Sau điện di xong, lấy gel khỏi kính Ngâm gel dung dịch đĩa petri có thuốc nhuộm protein (coomassie brilliant blue, methanol, acid acetic, nước cất), lay động nhẹ thuốc nhuộm thấm vào gel, thời gian ngâm từ 1-4 Chuyển gel sang dung dịch rửa màu (methanol 400ml, acid acetic 70ml, nước cất vừa đủ lít), thay dung dịch rửa vài lần gel có màu suốt, lúc xuất vạch lơ xanh gel, chụp ảnh gel lưu lại Dựa vào mẫu nhận xét 2.8 Sắc kí mỏng Nhóm Trang Bài báo biến tính tinh bột cyclomaltodextrinase GVHD: Nguyễn Minh Hải Sắc ký mỏng kỹ thuật tách chất tiến hành cho pha động di chuyển qua pha tĩnh đặt hỗn hợp chất cần tách Pha tĩnh chất hấp phụ chọn phù hợp theo yêu cầu phân tích, trải thành mỏng đồng cố định phiến kính phiến kim loại Pha động hệ dung môi đơn đa thành phần trộn với theo tỷ lệ quy định chuyên luận Trong trình di chuyển qua lớp hấp phụ, cấu tử hỗn hợp mẫu thử di chuyển mỏng, theo hướng pha động, với tốc độ khác Kết quả, ta thu sắc ký đồ mỏng Cơ chế chia tách chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay phối hợp đồng thời nhiều chế tùy thuộc vào tính chất chất làm pha tĩnh dung môi làm pha động [5] Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển chất phân tích hệ số di chuyển Rf tính tỷ lệ khoảng dịch chuyển chất thử khoảng dịch chuyển dung môi: Trong đó: ♣ a khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết mẫu thử, tính cm ♣ b khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo đường vết, tính cm ♣ Rf: Chỉ có giá trị từ đến l Cách tiến hành Dụng cụ: ♣ Bình triển khai, thường thuỷ tinh suốt có kích thước phù hợp với phiến kính cần dùng có nắp đậy kín ♣ Ðèn tử ngoại, phát xạ có bước sóng ngắn 254 nm bước sóng dài 365 nm ♣ Dụng cụ để phun thuốc thử ♣ Tủ sấy điều nhiệt để hoạt hóa sấy mỏng sắc ký đồ, để sấy nóng số phản ứng phát ♣ Tủ hút độc ♣ Máy sấy dùng để sấy khô sắc ký đồ cho phép chấm nhanh nhiều lần dung dịch pha loãng chất cần phân tích ♣ Một máy ảnh thích hợp (với ống kính Macro) chụp lưu giữ sắc ký đồ ánh sáng ban ngày với khoảng cách 30-50 cm ♣ Tủ lạnh để bảo quản thuốc thử dễ hỏng ♣ Micropipet nhiều cỡ từ l, 2, 5, 10 đến 20 ml, ống mao quản dụng cụ thích hợp ♣ Bản mỏng tráng sẵn chất hấp phụ có chất phát quang thích hợp ♣ Trường hợp phòng thí nghiệm điều kiện trang bị loại mỏng tráng sẵn tự chuẩn bị lấy mỏng với dụng cụ sau đây: ♣ Các kính phẳng có kích thước phù hợp xử lý trước hóa chất rửa nước sấy khô ♣ Thiết bị trải chất hấp phụ lên kính thành mỏng đồng đều, có chiều dày thích hợp ♣ Giá để xếp kính trải Chuẩn bị mỏng Bản mỏng chứa chất hấp phụ dạng bột mịn, phủ thành mỏng gắn mỏng dùng làm giá mang kính, nhôm plastic Sắp xếp mỏng chuẩn bị thiết bị: Các phiến kính phải lau chùi cẩn thận tẩy hoàn toàn chất béo cách ngâm dung dịch sulfocromic Sau đó, cọ kỹ bàn chải tia nước máy tráng nước cất sấy khô giá nhiệt độ thường hay tủ sấy Nhóm Trang Bài báo biến tính tinh bột cyclomaltodextrinase GVHD: Nguyễn Minh Hải Ðiều chế chất hấp phụ: Chất hấp phụ chọn lọc cho phù hợp với yêu cầu phân tích như: Silicagel G, kieselguhr, cellulose, nhôm oxyd, số silicagel G dùng thông dụng Trộn 25g silicagel G với 50 ml nước cất nhào cối lắc mạnh bình nón có dung tích 200 - 250 ml, nút kín, 30 - 45 giây Dịch treo tạo dạng lỏng đồng nhất, se lại vài phút sau đó, có bột bó Rót vào thiết bị trải điều chỉnh độ dày cho mỏng khoảng 0,25 mm Ðể nguyên phiến kính chỗ khoảng 10 phút tới mặt hết bóng, để khô tự nhiên qua đêm nhiệt độ phòng Hoạt hóa: Cho mỏng khô mặt vào tủ sấy sấy 105 - 110 oC 30 phút Ðể nguội bảo quản bình hút ẩm Khi dùng, cần hoạt hóa lại cách sấy 105-1100C cạo bỏ dải mỏng chất hấp phụ dọc hai bên cạnh kính Dung dịch phân tích: hòa tan hỗn hợp chất dung môi thích hợp (thường dung môi phân cực) để dung dịch có nồng độ 1% Lượng chất hỗn hợp chất đưa lên mỏng có ý nghĩa quan trọng hiệu tách sắc ký, đặc bịệt ảnh hưởng lớn đến trị số Rf Lượng chất lớn làm cho vết sắc ký lớn kéo dài, đó, vết chất có trị số Rf gần bị chồng lấp Lượng chất nhỏ không phát độ nhạy thuốc thử không đủ (thông thường độ nhạy thuốc thử 0,005 mg) Lượng mẫu thông thường cần đưa lên mỏng 0,1 - 50 mg dạng dung dịch ether, c1oroform, nước hay dung môi thích hợp khác Thể tích dung dịch từ 0,001 ml đến 0,005 ml trường hợp đưa mẫu lên mỏng dạng điểm từ 0,l - 0,2 ml đưa mẫu lên mỏng dạng vạch trường hợp sắc ký điều chế Ðối với sắc ký điều chế lượng chất lên tới 10 - 50 mg Ðối với dung dịch có nồng độ loãng làm giàu trực tiếp mỏng cách chấm nhiều lần vị trí sấy khô sau lần chấm Dùng ống mao quản nhỏ hút dung dịch mẫu chấm lên tuyến xuất phát cho vệt cách khoảng 1.5-2.0 cm cách mép bên khoảng 1.5-2.0 cm, đường kính vệt khoảng 2-3mm Các vết bìa phải cách bờ bên mỏng cm để tránh hiệu ứng bờ Khi làm sắc ký mỏng bán định lượng, độ xác kết phân tích phụ thuộc nhiều vào độ xác lượng chất thử đưa lên mỏng, tức thể tích dung dịch chấm lên mỏng Do đó, với trường hợp phân tích bán định lượng phải dùng mao quản định mức xác Khi không cần định lượng dùng micropipet ống mảo quản thường Quá trình triển khai sắc kí tiến hành bình kín chứa dung môi làm pha động (dung môi pha động gồm: n-butanol/acid acetic/ nước: 5:3:1) nhiệt độ phòng Các bình khai triển thường bình thủy tinh, hình hộp hay hình trụ, có nắp đậy kín, kích thước thay đổi tùy theo yêu cầu mỏng sử dụng Bão hòa dung môi bình cách lót giấy lọc xung quanh thành bình, rót lượng vừa đủ dung môi vào bình, lắc để giấy lọc thấm dung môi Lượng dung môi sử dụng cho sau thấm giấy lọc lại lớp dày khoảng mm đến 10 mm đáy bình Ðậy kín nắp bình để yên nhiệt độ 20 - 25oC Triển khai sắc ký: Ðặt mỏng gần thẳng đứng với bình triển khai, vết chấm phải bề mặt lớp dung môi khai triển Ðậy kín bình để yên nhiệt độ không đổi Sau triển khai sắc kí, mỏng sấy khô nhúng nhanh vào dung dịch thuốc màu (3g N-(1-naphthy)-ethylenediamine 50ml H2SO4 chứa 1% methanol) Sau sấy khô 110ºC 10 phút Đánh giá: Quan sát vết xuất hiện, tính giá trị Rf Rr tiến hành định tính, phát tạp chất định lượng quy định Việc sắc ký mỏng tiến hành điều kiện chuẩn hoá cho kết có độ tin cậy cao Hiện người ta thường tiến hành sắc ký với giúp đỡ hệ thống sắc ký mỏng hiệu cao (Planar chromatography - HPTLC) Hình 6: Máy sắc kí mỏng 2.9 Sắc kí thẩm thấu gel (sắc kí lọc gel) Nhóm Trang Bài báo biến tính tinh bột cyclomaltodextrinase GVHD: Nguyễn Minh Hải Nguyên lý: Phương pháp sắc kí lọc gel ứng dụng để tách hỗn hợp chất dựa vào khác kích thước, hình dạng, cấu trúc không gian, phân tử lượng [6] Quá trình triển khai sắc kí thực thông qua tương tác pha: Pha tĩnh: hạt gel có cấu trúc mở, chứa liên kết ngang tạo thành mạng lưới không gian ba chiều nhồi cố định cột Bên bên hạt chứa mao quản có kích thước nhỏ Cả cột gel giữ cân bằng cách rửa qua dung dịch đệm Pha động: hỗn hợp gồm dịch enzyme hợp chất hòa tan khác có kích thước phân tử khác pha dung dịch đệm Dung dịch mẫu chứa enzyme cấu tử hòa tan (pha động) có kích thước khác chạy qua cột Những phân tử có kích thước lớn lỗ mao quản gel vào bên hạt gel, chúng di chuyển vào khoảng không gian hạt Những phân tử có kích thước nhỏ có khả khuếch tán vào bên hạt gel Tốc độ di chuyển phân tử có liên quan đến kích thước, cấu trúc không gian phân tử Các hạt có kích thước trung gian di chuyển qua cột với vận tốc trung bình so với phân tử có kích thước lớn nhỏ Chất rửa giải thường dung dịch đệm, dung dịch thường giúp cho cấu tử ổn định không bị biến tính Hình 7: Sắc ký thấm gel Sự biến đổi phân tử amylose amylopectin phân tích kĩ thuật sắc kí thấm gel Kĩ thuật sử dụng cột superdex 200 (10×300mm), superdex 30 (10×300mm) Quá trình rửa giải thực nhiệt độ phòng với dung dịch NaCl 100mM với tốc độ rửa giải 0.7mL/phút Những carbonhydrate rửa giải nhận biết đầu dò đo số khúc xạ 2.10 HPAEC (kĩ thuật phân tích sắc kí trao đổi ion hiệu cao) Sản phẩm trình thủy phân tinh bột gạo tinh bột sáp phân tích việc sử dụng kĩ thuật HPAEC (high-performance anion exchange chromatography) Kĩ thuật có đầu dò điện loại cột nhồi để tiến hành phân tích HPAEC phân tách monosaccharides oligosaccharide Mẫu phân tích sau lọc rửa giải dung môi có chứa sodium acetate 600mM 150 mM NaOH Sự phát dựa tính chất điện hóa hợp chất rửa giải detector xung ampe (PAD), định lượng việc so sánh với diện tích pic dung dịch chuẩn Thuốc thử: sử dụng thuốc thử đạt chất lượng tinh khiết phân tích, trừ có quy định khác sử dụng nước cất nước loại ion nước tinh khiết tương đương (NaOH, HCl, nước khử khoáng) NaOH: 50% (m/m) dung dịch nước, thuốc thử chứa lượng tối thiểu natri cacbonat thủy ngân Không lắc khuấy dung dịch trước sử dụng HCl: dung dịch tiêu chuẩn thể tích nồng độ 1mol/l Chất rửa giải: sử dụng nước khử khoáng 18MΩ.cm Lọc nước khử khoáng qua màng lọc 0.2µm Khử khí cách sục khí Heli khoảng 20-30 phút Dùng pipet lấy 15.6 ml dung dịch NaOH cho vào 985 ml nước khử khí Nhóm Trang Bài báo biến tính tinh bột cyclomaltodextrinase GVHD: Nguyễn Minh Hải Lưu ý: Việc loại bỏ dioxit cacbon hòa tan từ chất rửa giải trước dùng quan trọng Cacbonat hoạt động sức đẩy mạnh cột, kết làm giảm hẳn phân giải hiệu phân tách Chuấn bị dung dịch ngày trước phân tích Dung dịch tiêu chuẩn: Chuẩn bị dung dịch: arabinoza, fructoza, galactoza, glucoza, Cân cacbonhydrat khoảng 100mg, xác đến 0.1mg, cho vào bình định mức dung tích 100ml riêng rẽ pha loãng nước đến vạch Khi biết thời gian lưu cacbonhydrate điều kiện sắc kí thông thường, chuẩn bị dung dịch tiêu chuẩn hỗn hợp từ dung dịch tiêu chuẩn gốc riêng biệt Tiếp tục pha loãng dung dịch tiêu chuẩn để đạt nồng độ carbohydrat giống với nồng độ mẫu Hình 8: Thiết bị HPAEC 2.11 Phân tích chiều dài mạch nhánh phân tử amylopectin Để tiến hành phân tích người ta chuẩn bị hỗn hợp phản ứng gồm 0.5% amylopectin CDase I-5 (1U/mg chất) Hỗn hợp ủ 3h nhiệt độ 50ºC sau chiều dài mạch phân tích Mẫu CDase-amylopectin xử lý tách lại với pullulanase 60ºC 12 Các sản phẩn phân tích HPAEC với cột CarboPac PA1 đầu dò điện Quá trình rửa giải thực 600mM dung dịch sodium acetate 0-70% 150mM NaOH Tốc độ rửa giải 1ml/phút 2.12 Quét vi sai nhiệt lượng (DSC) Differential scanning calorimetry (DSC) một kỹ thuật phân tích nhiệt dựa sự khác biệt nhiệt lượng cung cấp vào mẫu và được khảo sát một hàm của nhiệt độ Các mẫu khảo sát đều đặt gần ở cùng nhiệt độ suốt quá trình khảo sát [7] Kỹ thuật phát triển ES Watson MJ O'Neill vào năm 1960 giới thiệu thương mại Pittsburgh năm 1963 Hội nghị phân tích Hóa học ứng dụng phổ Ứng dụng chủ yếu của DSC là nghiên cứu về trạng thái chuyển tiếp pha như: nhiệt độ chảy, nhiệt độ thuỷ tinh hoá, nhiệt độ phân huỷ Những trạng thái chuyển tiếp pha này liên quan đến sự thay đổi lượng hay khả hấp thu nhiệt, điều này có thể được kiểm tra của bộ phận dò nhiệt thiết bị DSC Sự thoái hóa mẫu gạo nấu chín xác định phương pháp quét vi sai nhiệt lượng sau lưu giữ mẫu vòng ngày 4ºC Thiết bị DSC hiệu chuẩn indium (156.6ºC, 28591j/g) Sn (232.2ºC, 60.62 j/g) Nước cất sử dụng chất tham khảo Cân lượng tinh bột cho vào nồi, sau gia nhiệt từ 20-120ºC (5ºC/ phút) Sự thoái hóa thể việc tính toán giá trị enthalpy vùng thu nhiệt, đỉnh 40 80ºC Nhóm Trang 10 Bài báo biến tính tinh bột cyclomaltodextrinase GVHD: Nguyễn Minh Hải Hình 9: Thiết bị DSC 3.1 Kết thảo luận Sự tinh protein cyclomaltodextrinase (CDase I-5) Khối lượng phân tử CDase I-5 tinh khoảng 64kDa xác định SDS-PAGE (Hình 1).Trọng lượng phân tử giống với trọng lượng phân tử enzyme maltogenic amylase (maltogenase) Hình 10: Phương pháp SDS—PAGE 3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ pH hoạt tính CDase I-5 Phản ứng enzyme thực dung dịch đệm sodium phosphate có pH = Nhiệt độ phản ứng tối ưu CDase I-5 50ºC với chất β-CD (Hình 11) Nhiệt độ tối ưu maltogenic amylase khác sau: BLMA 50ºC, BBMA 45ºC, BSMA 55ºC, Npase 55ºC từ vi khuẩn Bacillus stearothermophillus IMA6503, BTMA 70ºC, ThMA 60ºC EFMA 45ºC Hoạt động CDase I-5 pH khác xác định dung dịch đệm sodium phosphate (pH 6—8) hoạt tính enzyme cao pH 7.5 β-CD (Hình 11) Dung dịch đệm sodium phosphate (50mM, pH 7.5) chọn cho mô tả rõ enzyme Nhóm Trang 11 Bài báo biến tính tinh bột cyclomaltodextrinase GVHD: Nguyễn Minh Hải Hình 11: Ảnh hưởng nhiệt độ pH hoạt động enzyme 3.3 Nghiên cứu động học thủy phân nhiều chất khác Tốc độ thủy phân CDase I-5 β-CD, amylose amylopectin xác định tổng kết bảng sau Bảng 2: Thông số động học CDase I-5 chất khác Nhóm Trang 12 Bài báo biến tính tinh bột cyclomaltodextrinase GVHD: Nguyễn Minh Hải Amylose cho thấy giá trị kcat/Km cao gấp 16 lần so với amylopectin Đặc điểm bắt nguồn từ cấu trúc bậc khác thường nó, sản phẩm thủy phân giải phóng từ trung tâm hoạt động phận chấp nhận nhanh chóng vào trung tâm hoạt động khác nhóm Qua xếp không gian trung tâm hoạt động phận siêu phân tử, CDase I-5 dạng dodecameric thuận lợi để phân biệt phân tử giới hạn kích thước Vì vậy, hình dạng đường thẳng phân tử amylose dễ dàng vào trung tâm hoạt động CDase I-5 amylopectin, gây tính đặc hiệu cao CDase I-5 3.4 Phân tích phương pháp sắc kí mỏng sắc kí thẩm thấu gel Amylose amylopectin thương mại sử dụng chất để nghiên cứu hoạt động CDase I-5 thành phần tinh bột Phản ứng enzyme bắt đầu cho 1U/mg chất CDase I-5 vào 0.25% (w/v) amylose 0.25% amylopectin 50 mM dung dịch đệm sodium phosphate (pH 7.5) Sự phân tán amylose amylopectin khoai tây (mỗi loại khoảng 2%, w/v) 90% DMSO chuẩn bị chưng cất nước tách ion, sau sử dụng để xử lý enzyme Sau ủ nhiệt độ 50 0C thời gian 0.5, 1, 24h, phần hỗn hợp phản ứng lấy ra, phản ứng ngừng lại bị đun sôi phút Sản phẩm thủy phân amylose amylopectin enzyme CDase I-5 mô tả phân tích TCL Maltose glucose sản phẩm thủy phân chủ yếu amylose sử dụng enzyme CDase I-5 khoảng thời gian phản ứng 24h Tuy nhiên, sản phẩm bị biến đổi phát từ việc thủy phân amylopectin Những kết nghiên cứu cho thấy CDase I-5 có xu hướng làm biến đổi amylose amylopectin, điều làm cho CDase I-5 khác biệt so với loại enzyme thủy phân amylose khác Sự thay đổi phân bố khối lượng phân tử amylose/amylopectin gây phản ứng CDase I-5 phân tích sắc kí thẩm thấu gel Mẫu lấy thời gian ủ khác (0.5, 1, 5, 24h) cho vào cột Superdex 200 (10×300 mm) Trong 0.5h đầu tiên, amylose bị thoái nhanh chóng điểm cực đại amylose thay đổi phân tích thời gian dài Khi thời gian phản ứng đạt 1h, hầu hết cấu tử amylose bị biến Tuy nhiên, phương pháp sử dụng CDase I-5, điểm cực đại amylopectin không bị ảnh hưởng, chí trì thời gian phản ứng đến 25h Sự thay đổi phân bố khối lượng phân tử phản ứng enzyme gây chứng tỏ CDase I-5 có khả gây biến đổi có chọn lọc amylose amylopectin Hiện tượng tương tự tinh bột gạo sáp (tinh bột chứa amylopectin), điều cho thấy tính đặc thù cao enzyme CDase amylose chí có mặt amylopectin Những kết nghiên cứu cho thấy enzyme CDase I-5 ứng cử viên tiềm sử dụng để sản sinh tinh bột hàm lượng amylose thấp việc loại bỏ làm giảm lượng amylose tinh bột Nhóm Trang 13 Bài báo biến tính tinh bột cyclomaltodextrinase GVHD: Nguyễn Minh Hải Hình 12: Phân tích sản phẩm thủy phân từ amylose amylopectin với CDase I-5 phương pháp sắc kí mỏng (TLC) sắc kí thẩm thấu gel (GPC) A: Phân tích hỗn hợp phản ứng có 0.25% amylopectin TLC B: Phân tích hỗn hợp phản ứng có 0.25% amylose TLC C: Phân tích hỗn hợp phản ứng có 0.25% amylopectin GPC D: Phân tích hỗn hợp phản ứng có 0.25% amylose GPC 3.5 Xác định hàm lượng thành phần tinh bột Từ kết đề cập trước, ta kết luận amylose thủy phân có chọn lọc CDase 1-5, có mặt amylopectin Những biến đổi thành phần có tinh bột phản ứng 1-5 CDase tóm tắt bảng sau Bảng 3: Xác định thành phần tinh bột suốt trình diễn phản ứng CDase I-5 (hỗn hợp phản ứng bao gồm tinh bột gạo 0,5% CDase 1-5 (1 U/mg chất) 50 mM dung dịch đệm Na3PO4) Nhóm Trang 14 Bài báo biến tính tinh bột cyclomaltodextrinase GVHD: Nguyễn Minh Hải Khi thời gian phản ứng diễn ra, phần amylose giảm dần tác dụng enzyme phần lượng đường khử tăng lên tương ứng với lượng amylose bị giảm Cả lượng amylose bị giảm lượng đường khử tăng lên đo tương ứng với nhau, điều cho thấy lượng đường khử sinh chủ yếu amylose phần amylopectin không bị ảnh hưởng suốt giai đoạn phản ứng 3.6 Ảnh hưởng CDase I-5 chuỗi amylopectin Sự thay đổi chiều dài chuỗi amylopectin nghiên cứu cách sử dụng HPAEC sau xử lý với pullulanase, tỷ lệ phần trăm diện tích đỉnh từ DP đến DP 30 tính khoảng thời gian phản ứng (hình 13) Có khác biệt xếp chiều dài chuỗi amylopectin kiểm soát amylopectin xử lý CDase 1-5, điều cho thấy enzyme ảnh hưởng đến độ dài chuỗi amylopectin Ta thấy tăng nhẹ tỷ lệ tương đối chuỗi ngắn (ít DP 13) trình xử lý CDase I-5 Hình 13: Khoảng phần trăm chuỗi AP từ DP2-DP30 3.7 Hiệu việc xử lý CDase I-5 thoái hóa tinh bột gạo o Trong biểu đồ nhiệt DCS, đỉnh thu nhiệt tinh bột hồ hóa lưu trữ vào khoảng 40-60 C, gọi thu nhiệt cũ, bắt nguồn từ tan chảy amylopectin tái kết tinh Thành phần amylose tinh bột bị thoái hóa nhanh, tái kết tinh chậm thành phần amylopectin theo thời gian Amylose chịu trách nhiệm thoái hóa ngắn hạn tham gia vào việc kết hợp xoắn kép chuỗi amylose amylopectin giai đoạn sau, góp phần điều phối thoái hóa Do đó, amylose đóng góp cách sâu sắc đến thoái hóa tinh bột tốc độ thoái hóa phụ thuộc nhiều vào hàm lượng amylose amylopectin Nhóm Trang 15 Bài báo biến tính tinh bột cyclomaltodextrinase GVHD: Nguyễn Minh Hải Hình 14: Biểu đồ nhiệt DSC gạo nấu chín sau ngày lưu trữ 4oC Đỉnh thu nhiệt đại diện cho thoái hóa tinh bột entanpy tính vùng đỉnh Khi kiểm tra tinh bột hồ hóa sau ngày lưu trữ 4oC, tinh bột gạo cho thấy đỉnh thu nhiệt 1,83 mJ/mg, mẫu tinh bột xử lý CDase I-5 0,83 mJ/mg, 45.4% tinh bột gạo (Hình 14) Vì vậy, việc xử lý CDase I-5 làm chậm đáng kể thoái hóa gạo nấu chín, lượng đáng kể amylose bị biến đổi phản ứng enzyme Hàm lượng amylose bị giảm thay đổi xếp bên amylose amylopectin, kết làm giảm thoái hóa tinh bột Kết luận Enzyme CDase I-5 có xu hướng làm biến đổi amylose amylopectin, cụ thể làm giảm hàm lượng amylose Do ta ứng dụng đặc điểm để sản xuất loại tinh bột có hàm lượng amylose thấp Tinh bột xử lý CDase I-5 có khả bị thoái hóa chậm tinh bột bình thường giúp cải thiện ổn định gel, cảm quan, dáng vẻ, cấu trúc cho tinh bột Tài liệu tham khảo: [1] Lê Ngọc Tú cộng sự, Hóa sinh công nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật, 2005 [2] http://www.arac-xyls.org/3d-arac.html [3], [6] Ngô Lâm Tuấn Anh, Bài giảng môn Phân tích thực phẩm, 2009 [4] Tài liệu thí nghiệm Phân tích thực phẩm [5] http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Tools/Phuongphap/SKLM.htm [7] http://inside-science.com/thong-tin-moi/170-quet-nhit-vi-sai.html Nhóm Trang 16 Bài báo biến tính tinh bột cyclomaltodextrinase Mục lục Nhóm Trang 17 GVHD: Nguyễn Minh Hải [...]... khi có mặt amylopectin Những biến đổi của các thành phần có trong tinh bột do phản ứng 1-5 CDase được tóm tắt trong bảng sau Bảng 3: Xác định các thành phần tinh bột trong suốt quá trình diễn ra phản ứng CDase I-5 (hỗn hợp phản ứng bao gồm tinh bột gạo 0,5% và CDase 1-5 (1 U/mg cơ chất) trong 50 mM dung dịch đệm Na3PO4) Nhóm 6 Trang 14 Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase GVHD: Nguyễn... đến sự thoái hóa tinh bột và tốc độ thoái hóa phụ thuộc rất nhiều vào hàm lượng amylose cũng như amylopectin Nhóm 6 Trang 15 Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase GVHD: Nguyễn Minh Hải Hình 14: Biểu đồ nhiệt DSC của gạo đã nấu chín sau 7 ngày lưu trữ ở 4oC Đỉnh thu nhiệt đại diện cho sự thoái hóa của tinh bột và entanpy có thể được tính tại vùng đỉnh Khi kiểm tra tinh bột hồ hóa sau... amylopectin), điều này cho thấy tính đặc thù cao của enzyme CDase đối với amylose thậm chí khi có mặt amylopectin Những kết quả của các cuộc nghiên cứu cho thấy enzyme CDase I-5 là ứng cử viên tiềm năng được sử dụng để sản sinh tinh bột hàm lượng amylose thấp bằng việc loại bỏ hoặc làm giảm lượng amylose trong tinh bột Nhóm 6 Trang 13 Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase GVHD: Nguyễn.. .Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase GVHD: Nguyễn Minh Hải Hình 9: Thiết bị DSC 3 3.1 Kết quả và thảo luận Sự tinh sạch protein cyclomaltodextrinase (CDase I-5) Khối lượng phân tử của CDase I-5 tinh sạch khoảng 64kDa như được xác định bởi SDS-PAGE (Hình 1).Trọng lượng phân tử giống với trọng... động của CDase I-5 ở các pH khác nhau được xác định trong dung dịch đệm sodium phosphate (pH 6—8) và hoạt tính enzyme cao nhất ở pH 7.5 trên β-CD (Hình 11) Dung dịch đệm sodium phosphate (50mM, pH 7.5) cũng được chọn cho sự mô tả rõ hơn về enzyme Nhóm 6 Trang 11 Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase GVHD: Nguyễn Minh Hải Hình 11: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đối với hoạt động của enzyme... thoái hóa của tinh bột 4 Kết luận Enzyme CDase I-5 có xu hướng làm biến đổi amylose hơn là amylopectin, cụ thể là làm giảm hàm lượng amylose Do đó ta có thể ứng dụng đặc điểm này để sản xuất các loại tinh bột có hàm lượng amylose thấp Tinh bột được xử lý CDase I-5 có khả năng bị thoái hóa chậm hơn tinh bột bình thường do đó giúp cải thiện sự ổn định gel, cảm quan, dáng vẻ, cấu trúc cho tinh bột Tài liệu... [2] http://www.arac-xyls.org/3d-arac.html [3], [6] Ngô Lâm Tuấn Anh, Bài giảng môn Phân tích thực phẩm, 2009 [4] Tài liệu thí nghiệm Phân tích thực phẩm [5] http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Tools/Phuongphap/SKLM.htm [7] http://inside-science.com/thong-tin-moi/170-quet-nhit-vi-sai.html Nhóm 6 Trang 16 Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase Mục lục Nhóm 6 Trang 17 GVHD: Nguyễn Minh Hải ... I-5 trên sự thoái hóa của tinh bột gạo o Trong biểu đồ nhiệt DCS, đỉnh thu nhiệt đầu tiên của tinh bột hồ hóa và được lưu trữ vào khoảng 40-60 C, gọi là sự thu nhiệt cũ, bắt nguồn từ sự tan chảy của amylopectin tái kết tinh Thành phần amylose trong tinh bột bị thoái hóa nhanh, tiếp theo là sự tái kết tinh chậm của thành phần amylopectin theo thời gian Amylose chịu trách nhiệm về sự thoái hóa ngắn hạn... thủy phân của CDase I-5 đối với β-CD, amylose và amylopectin được xác định và tổng kết trong bảng sau Bảng 2: Thông số động học của CDase I-5 trên những cơ chất khác nhau Nhóm 6 Trang 12 Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase GVHD: Nguyễn Minh Hải Amylose cho thấy giá trị kcat/Km cao gấp 16 lần so với amylopectin Đặc điểm này bắt nguồn từ cấu trúc bậc 4 khác thường của nó, trong đó sản... tại vùng đỉnh Khi kiểm tra tinh bột hồ hóa sau 7 ngày lưu trữ ở 4oC, tinh bột gạo cho thấy đỉnh thu nhiệt là 1,83 mJ/mg, trong khi mẫu tinh bột xử lý CDase I-5 là 0,83 mJ/mg, bằng 45.4% của tinh bột gạo (Hình 14) Vì vậy, việc xử lý CDase I-5 làm chậm đáng kể sự thoái hóa của gạo nấu chín, có thể do một lượng đáng kể amylose đã bị biến đổi bởi phản ứng enzyme Hàm lượng amylose bị giảm có thể thay đổi ... ứng cử viên tiềm sử dụng để sản sinh tinh bột hàm lượng amylose thấp việc loại bỏ làm giảm lượng amylose tinh bột Nhóm Trang 13 Bài báo biến tính tinh bột cyclomaltodextrinase GVHD: Nguyễn Minh... phần tinh bột suốt trình diễn phản ứng CDase I-5 (hỗn hợp phản ứng bao gồm tinh bột gạo 0,5% CDase 1-5 (1 U/mg chất) 50 mM dung dịch đệm Na3PO4) Nhóm Trang 14 Bài báo biến tính tinh bột cyclomaltodextrinase. .. hóa tinh bột entanpy tính vùng đỉnh Khi kiểm tra tinh bột hồ hóa sau ngày lưu trữ 4oC, tinh bột gạo cho thấy đỉnh thu nhiệt 1,83 mJ/mg, mẫu tinh bột xử lý CDase I-5 0,83 mJ/mg, 45.4% tinh bột