ỨNG DỤNG cặp mồi đặc HIỆU để PHÁT HIỆN GENOTYP HPV 16 và HPV 18 BẰNG

1 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG TRẦN THỊ DIỆU NINH ỨNG DỤNG CẶP MỒI ĐẶC HIỆU ĐỂ PHÁT HIỆN GENOTYP HPV 16 VÀ HPV 18 BẰNG KỸ THUẬT PCR LỒNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KỸ THUẬT Y HỌC CHUYÊN NGÀNH XÉT NGHIỆM KHÓA : 2011 – 2015 Hải Phòng – 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG TRẦN THỊ DIỆU NINH ỨNG DỤNG CẶP MỒI ĐẶC HIỆU ĐỂ PHÁT HIỆN GENOTYP HPV 16 VÀ HPV 18 BẰNG KỸ THUẬT PCR LỒNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KỸ THUẬT Y HỌC CHUYÊN NGÀNH XÉT NGHIỆM KHÓA : 2011 – 2015 Người hướng dẫn: T.S Bạch Thị Như Quỳnh Hải Phòng – 2015 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LÂP – TỰ DO – HẠNH PHÚC BẢN CAM ĐOAN Kính gửi: – – Ban giám hiệu Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp khoa Kỹ thuật Y học trường Đại học Y dược Hải Phòng Em xin cam đoan kết quả, số liệu trình bày khóa luận tốt nghiệp hoàn toàn trung thực, khách quan, không chép từ nghiên cứu khác Hải Phòng, ngày 28 tháng năm 2015 Người viết Trần Thị Diệu Ninh Lời cảm ơn Em xin trân trọng cám ơn thầy, cô Ban giám hiệu, Khoa Kỹ thuật Y học Bộ môn trường Đại học Y Dược Hải Phòng dìu dắt, dạy dỗ em năm học qua Để hoàn thành luận văn này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Bạch Thị Như Quỳnh - người hướng dẫn, bảo em tận tình suốt trình thực đề tài Đồng thời, em xin cám ơn tới Th.S Lê Hồng Thu môn Sinh học phân tử khoa Kỹ thuật y học giúp em thực khóa luận Labo Sinh học phân tử trường Đại học Y Dược Hải Phòng Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Hùng Cường nhóm nghiên cứu đề tài cấp nhà nước tạo điều kiện cho em nhiều trình làm khóa luận Em xin gửi tới lời cám ơn sâu sắc tới PGS.TS Đinh Duy Kháng phòng Vi sinh phân tử - Viện công nghệ sinh học - Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam giúp đỡ em trình thực đề tài nghiên cứu Sau em xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình bạn bè bên cạnh động viên em suốt trình học tập Hải Phòng, ngày 28 tháng năm 2015 Sinh viên Trần Thị Diệu Ninh CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic BLAST Basis Local Aligment Search Tool CDC Centers for Disease Control and Prevention ddNTP Dideoxynucleotide dNTP Deoxyribonucleic FDA Food and Drug Administration HPV Human papillomavirus OD Optical density P53 Protein p53 PCR Polymerase chain reaction pRb Protein retinoblasma UTCTC Ung thư cổ tử cung MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm chung Human papillomavirus (HPV) 1.1.1 Hình thái cấu trúc HPV 1.1.2 Chu trình sống HPV 1.1.3 Phân loại HPV 1.1.4 Cơ chế gây bệnh HPV 1.2 Tình hình nhiễm HPV Việt Nam giới 1.2.1 Tình hình nhiễm HPV giới 1.2.2 Tình hình nhiễm HPV Việt Nam 1.3 Các kỹ thuật chẩn đoán nhiễm HPV 1.3.1 Chuỗi phản ứng trùng hợp PCR 1.3.1.1 Nguyên lý chung kỹ thuật PCR 1.3.1.2 Các thành phần phản ứng PCR 1.3.2 Giải trình tự tự động CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, thời gian địa điểm nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 2.1.2.1 Thời gian nghiên cứu 2.1.2.2 Địa điểm nghiên cứu 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 2.2.2 Sinh phẩm, hóa chất vật liệu trang thiết bị 2.2.2.1 Sinh phẩm 2.2.2.2 Hóa chất 2.2.2.3 Vật liệu .14 2.2.2.4 Trang thiết bị 2.3 Sơ đồ nghiên cứu 2.4 Kỹ thuật tiến hành 2.4.1 Tách chiết ADN tổng số 2.4.1.1 Tách chiết ADN tổng số từ chủng HPV chuẩn 2.4.1.2 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu ung thư đúc paraffin 2.4.2 Xác định nồng độ ADN nhờ máy quang phổ tử ngoại 2.4.3 Nested PCR (PCR lồng) 2.4.4 Phương pháp điện di ADN gel agarose CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Tách chiết ADN tổng số 3.1.1 Tách chiết ADN tổng số mẫu chuẩn 3.1.2 Tách chiết ADN tổng số mẫu thử 3.2 Kiểm tra khả phát genotyp HPV 16, 18 cặp mồi đặc hiệu mẫu chuẩn 3.3 Xác định trình tự đoạn gen HPV máy giải trình tự tự động 3.4 Ứng dụng cặp mồi đặc hiệu để phát genotyp HPV 16, 18 mẫu bệnh phẩm CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Kết tách chiết ADN tổng số 4.2 Kết kiểm tra khả phát genotyp HPV cặp mồi đặc hiệu 4.3 Kết xác định trình tự sản phẩm PCR máy giải trình tự 4.4 Ứng dụng cặp mồi đặc hiệu để phát genotyp HPV 16, 18 mẫu bệnh phẩm KẾT LUẬN KHUYẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình thái cấu trúc hệ gen HPV Hình 1.2 Phân loại HPV dựa vào khả gây bệnh Hình 1.3 Phân bố tỷ lệ nhiễm HPV phụ nữ giới năm 2007 Hình 1.4 Quy trình phản ứng PCR Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu Hình 2.2 Sơ đồ phản ứng PCR lồng Hình 3.1 Sản phẩm điện di ADN tổng số từ mẫu chuẩn Hình 3.2 Kết kiểm tra sản phẩm PCR cặp mồi đặc hiệu Hình 3.3 Kết BLAST trình tự đoạn gen PCR với trình tự gen E6 HPV 16 ngân hàng gen quốc tế Hình 3.4 Kết BLAST trình tự đoạn gen PCR với trình tự gen L1 HPV 18 ngân hàng gen quốc tế DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Nồng độ độ tinh hai mẫu chuẩn HPV 16 HPV 18 Bảng 3.2 Nồng độ độ tinh ADN tổng số 50 mẫu thử Bảng 3.3 Trình tự cặp mồi đặc hiệu phát HPV 16 Bảng 3.4 Trình tự cặp mồi đặc hiệu phát HPV 18 Bảng 3.5 Thành phần phản ứng PCR vòng HPV 16 Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR vòng HPV 16 Bảng 3.7 Thành phần phản ứng PCR vòng HPV 18 Bảng 3.8 Thành phần phản ứng PCR vòng HPV 18 Bảng 3.9 Khả phát ADN HPV 16, HPV 18 cặp mồi đặc hiệu Kit LightPowerNA HPV Genotyp RDB Kit (Kit Việt Á) 10 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm chung Human papillomavirus (HPV) 1.1.1 Hình thái cấu trúc HPV HPV virus trần có kích thước nhỏ Hạt virus có đường kính 50-55 nm [2] Vỏ capsid HPV khối đối xứng đa diện 20 mặt, hình thành từ 72 đơn vị hình thái (capsomer) Mỗi capsomer gồm pentamer protein cấu trúc L1 kết hợp với protein L2 (protein thành phần kháng nguyên sử dụng phản ứng miễn dịch đặc hiệu) [26] Cả hai protein cấu trúc virus tự mã hóa: Protein capsid (L1) có kích thước khoảng 55 kDa chiếm khoảng 80% tổng số protein virus Protein capsid phụ (L2) có kích thước khoảng 70 kDa chiếm khoảng 20% tổng số protein virus [10] Hình 1.1 Hình thái cấu trúc hệ gen HPV [29] HPV có vật liệu di truyền phân tử ADN dạng vòng, mạch kép, tồn dạng siêu xoắn Hệ gen virus chiếm khoảng 12% trọng lượng hạt virus, chiều dài khoảng 7900 cặp base (bp) [24] Hệ gen HPV chia làm ba vùng quan trọng [21]: 38 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 050 037 201 040 015 055 077 004 011 010 005 003 130 116 – – + – – – – – + – – – – – – + + + – – – + + + + + + – – + – + – – + – – + – + – – – + – + + – + + + + + + + – – + + + – – – + + + + + + – – + – + + – + + + + + + + – Dựa vào kết xác định genotyp HPV bảng 3.9 thấy khả phát ADN HPV 16, 18 cặp mồi đặc hiệu (HPV 16 78%, HPV 18 74%) tương đương với LightPowerNAHPV Genotyp RDB Kit (HPV 16 76%, HPV 18 74%) công ty Cổ phần công nghệ Việt Á Riêng trường hợp mẫu 117 phát thấy ADN HPV 16 vòng xác định kit Việt Á cho kết âm tính CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Kết tách chiết ADN tổng số Trong kỹ thuật khuếch đại trình tự gen, độ tinh khuôn acid nucleic (ADN/ARN) có ảnh hưởng lớn tới kết phản ứng Theo lý thuyết đa số nhà khoa học đồng thuận, việc xác định sản phẩm acid nucleic tinh thường công nhận tỷ số OD 260nm/OD280nm Nếu tỷ số nằm khoảng 1,8 – 2,0 acid nucleic sau tách chiết lẫn tạp chất (thường protein) [32] Nếu tỷ số vượt khoảng trên, mẫu acid nucleic thu không đảm bảo cho kết phản ứng PCR 39 Với đặc tính base purine pyrimidine cấu trúc, acid nuleic hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại bước sóng 260 nm Mật độ quang bước sóng 260 nm (OD260nm) mẫu cho phép xác định nồng độ acid nucleic mẫu Trong trình tách chiết, mẫu ADN thường lẫn protein Các phân tử hấp thụ ánh sáng tử ngoại mạnh bước sóng 280 nm Ở bước sóng 260 nm protein có khả hấp thụ song không mạnh Tuy nhiên, điều làm sai lệch giá trị thật nồng độ acid nucleic kiểm tra Do đó, kiểm tra độ dung dịch, người ta thường đo thêm giá trị OD 280 nm Sau tính tỷ số OD260nm/OD280nm [32] Tất mẫu tách chiết ADN tổng số từ mẫu chuẩn mẫu thử nghiên cứu nằm khoảng 1,8 – 2,0 Điều cho thấy kỹ thuật tách chiết sử dụng có tính hiệu ổn định Các mẫu ADN tách chiết có chất lượng đảm bảo cho bước nghiên cứu 40 4.2 Kết kiểm tra khả phát genotyp HPV cặp mồi đặc hiệu Để xác định diện HPV mẫu mô xét nghiệm, có nhiều phương pháp chẩn đoán phân tử lựa chọn, đó, kỹ thuật PCR áp dụng phổ biến nhiều phòng thí nghiệm giới độ nhạy, độ xác với thời gian nhanh chóng [7][16][31][38] Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu thường nhắm tới vùng trình tự có tính bảo thủ cao hệ genome virus Thường gặp mồi định vị vùng bảo thủ vùng gene L1 hệ thống mồi MY09/11, GP5+/6+, oli 1b/2l, SPF10,… E1 Cpl/CpII,…[18] Trong cặp mồi MY 09/11 thiết kế từ vị trí 6582-7033 cho phép khuếch đại đoạn trình tự dài 450 bp ưa dùng chẩn đoán HPV Mỹ GP 5+/6+ định vị từ vị trí 6624-6765 cho sản phẩm khuếch đại kích thước xấp xỉ 140 bp chủ yếu sử dụng châu Âu [9] Cả hai cặp mồi cho phép lúc khuếch đại số lượng lớn genotyp HPV phản ứng đơn Sau phản ứng PCR, người ta thường sử dụng kỹ thuật RFLP, lai với đầu dò, giải trình tự trực tiếp…để xác định genotyp Bên cạnh có nghiên cứu thay hướng tới oncogen E6, E7 [27][39] Khi giải trình tự vùng gen cho thấy tính đa hình cao genotyp HPV, mặt khác vùng gen giữ ổn định tế bào nhiễm mà không bị loại bỏ Vì sử dụng cặp mồi cho E6, E7 hạn chế hội bỏ sót trường hợp bị nhiễm đồng thời cho phép xác định phân loại nhóm genotyp HPV Việc biết cụ thể tới typ HPV nhiễm, biết chúng thuộc nhóm “nguy cao” hay “nguy thấp” cho phép chẩn đoán nhanh đưa khuyến cáo kịp thời cho người xét nghiệm 41 Trong nghiên cứu mình, ứng dụng cặp mồi thiết kế sẵn phần mềm PC/GENE dựa vùng trình tự bảo tồn gene E6 cho HPV 16 L1 cho HPV 18 Các cặp mồi lựa chọn mang đầy đủ đặc tính cặp mồi tốt Cụ thể mồi đoạn oligonucleotid ngắn (17-28 base) tổng hợp hóa học nhằm phát tồn trình tự nucleotid Trình tự mồi thiết kế: - Có tính nghĩa đảm bảo vị trí bắt cặp mồi toàn trình tự Cụ thể mồi HPV 16 Mn/Pn Mt/Pt định vị vùng gen E6 HPV 16 Cặp mồi HPV 18 Mn/Pn Mt/Pt định vị vùng gen L1 HPV 18 - Chiều dài 17-28 base - Thành phần G + C 50%-60% để đảm bảo lực liên kết mồi khuôn - Tối ưu hóa bắt cặp kéo dài cách đầu 3’ mồi có độ bền cao bổ sung hoàn toàn với đoạn trình tự bổ sung khuôn, hầu hết đầu 3’của mồi chứa G C - Nhiệt độ nóng chảy (Tm) giới hạn 47˚C-54˚C - Sự khác biệt nhiệt độ nóng chảy mồi xuôi mồi ngược nhỏ 5˚C - Hầu tạo thành cấu trúc kẹp tóc hai mồi, làm giảm hiệu phản ứng PCR [5] cặp mồi thiết kế cho phản ứng Nested PCR (PCR lồng) để phát genotyp HPV 16, 18 HPV 16 Mn/Pn, HPV 16 Mt/Pt, HPV 18 Mn/Pn HPV 18 Mt/Pt Trong cặp mồi HPV 16 Mn/Pn Mt/Pt cặp mồi cho vòng vòng HPV 16 HPV 18 Mn/Pn Mt/Pt cặp mồi tròng vòng HPV 18 Việc sử dụng phản ứng PCR lồng để khuếch đại đoạn trình tự bảo thủ HPV làm tăng độ nhạy phương pháp phát Với đặc điểm trội cặp mồi trên, tiến hành phản ứng Nested PCR (PCR lồng) để xác định diện ADN hai genotyp HPV 16, 18 từ mẫu chuẩn Sản phẩm PCR hai vòng điện di gel agarose 1% Kết ảnh 42 điện di cho thấy sản phẩm vòng xuất băng nhất, sản phẩm phụ, kích thước phù hợp với tính toán Điều chứng tỏ bốn cặp mồi HPV 16 Mn/Pn; Mt/Pt HPV18 Mn/Pn; Mt/Pt đặc hiệu thành phần phản ứng chu trình nhiệt mà tiến hành phù hợp để khuếch đại đoạn trình tự mong muốn 4.3 Kết xác định trình tự sản phẩm PCR máy giải trình tự Sản phẩm PCR ảnh điện di cho thấy kết ban đầu mặt trực quan (kích thước sản phẩm, độ đặc hiệu phản ứng) Tuy nhiên, để khẳng định chắn sản phẩm khuếch đại phản ứng PCR mang trình tự đoạn gen E6 HPV 16 L1 HPV 18, sản phẩm cần xác định trình tự gen Trên gen, nucleotid xếp nối trình tự xác định Kỹ thuật để phát trình tự gọi giải trình tự gen Kết qủa giải trình tự gen biểu diễn chuỗi ký tự A, T, G, C – tên viết tắt nucleotid [29] Hiện nay, trình tự gen đa số chủng HPV (trong có chủng HPV 16 HPV 18) giải mã công bố Ngân hàng gen quốc tế Đây lợi nhóm nghiên cứu Nếu trình tự đoạn gen thu tương đồng với trình tự công bố khẳng định tính đặc hiệu đoạn mồi thử nghiệm Phân tích kết giải trình tự so sánh trình tự gen HPV thu với trình tự công bố Ngân hàng gen quốc tế chương trình BLAST cho thấy sản phẩm PCR vòng HPV 16 có độ tương đồng đạt 99% sản phẩm PCR vòng HPV 18 có độ tương đồng đạt 100% so với trình tự đoạn gen E6 HPV 16 L1 HPV 18 công bố Từ kết cho thấy cặp mồi lựa chọn để thử nghiệm có độ đặc hiệu cao cho HPV 16 HPV 18 Đồng thời kết khẳng định kỹ thuật thực người nghiên cứu, không bị tạp nhiễm 43 trình thao tác, kết dương tính giả Quan trọng sử dụng cặp mồi đặc hiệu để phát đối tượng lây nhiễm người sản phẩm khuếch đại cặp mồi không trùng lặp với trình tự gen mã hoá hệ genome người Như kết luận cặp mồi đủ tiêu chuẩn để tiến hành thử nghiệm mẫu bệnh phẩm 4.4 Ứng dụng cặp mồi đặc hiệu để phát genotyp HPV 16, 18 mẫu bệnh phẩm Để đánh giá khả phát HPV 16 HPV 18 nhờ cặp mồi đặc hiệu tiến hành nghiên cứu thử nghiệm 50 mẫu sinh thiết ung thư cổ tử cung, dương vật, hậu môn đúc paraffin Các mẫu xác định genotyp HPV kit LightPowerNA HPV Genotyp RDB Kit (Kit Việt Á) Dựa vào kết xác định genotyp HPV tóm tắt bảng 3.9 thấy khả phát ADN HPV mồi đặc hiệu cho kết tương đương với kết xác định genotyp kít Việt Á Đối với mẫu bệnh phẩm 152, 158, 246, 231, 187, 201 dương tình với genotyp HPV 16, hoàn toàn âm tính với genotyp HPV 18 Các mẫu bệnh phẩm 239, 068, 021, 055, 116 cho kết âm tính với hai genotyp HPV 16 HPV 18 Phần lớn mẫu bệnh phẩm cho kết đồng nhiễm với hai genotyp HPV 16 HPV 18 Và mẫu âm tính với hai genotyp theo kết xác định kit Việt Á, kết phát với cặp mổi đặc hiệu cho kết tương đồng Tuy nhiên mẫu thử có trường hợp mẫu 117 cho kết dương tính với genotyp HPV 16 vòng mồi đặc hiệu với kit LightPowerNA HPV Genotyp RDB Kit Việt Á lại cho kết âm tính Chúng tiến hành lặp lại thí nghiệm cho kết tương tự Sự sai khác ý nghĩa thống kê, đồng thời Kit lưu hành thị trường có khả cho kết âm tính giả dương tính giả Vì để khẳng 44 định kết phát genotyp HPV 16 mẫu bệnh phẩm 117 cặp mồi đặc hiệu nghiên cứu chúng tôi, cần thực thêm kỹ thuật chuyên sâu Với việc sử dụng kỹ thuật PCR lồng giúp khắc phục yếu điểm trường hợp mẫu thử có nồng độ ADN khuôn thấp Kết bảng 3.9, số mẫu bệnh phẩm như: 179, 173, 192, 108, 059, 034… âm tính với HPV thực phản ứng PCR vòng lại dương tính với HPV thực phản ứng PCR với cặp mồi vòng Vậy phải trường hợp mẫu bệnh phẩm 117 nhờ kỹ thuật PCR lồng nên khuếch đại nguồn ADN khuôn lên, nhờ phát có mặt genotyp HPV 16 ? Bên cạnh đó, sử dụng cặp mồi đặc hiệu để phát genotyp HPV có mặt lợi phát HPV dương tính duơng tính với genotyp mà không cần thực thêm kỹ thuật chuyên sâu khác, nhiên có mặt hạn chế không phát đa phân typ mẫu bệnh phẩm Muốn phát nhiều genotyp khác mẫu bệnh phẩm cần sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu cho genotyp Kết kiểm tra bước đầu khả phát genotyp HPV 16 HPV 18 cặp mồi đặc hiệu có ý nghĩa quan trọng cho nghiên cứu chuyên sâu Kết giúp phần định hướng việc ứng dụng kỹ thuật PCR để tạo sinh phẩm chẩn đoán genotyp HPV 45 KẾT LUẬN Đã kiểm tra khả phát genotyp HPV cặp mồi đặc hiệu genotyp HPV 16 HPV 18 kỹ thuật PCR lồng (Nested PCR) mẫu chuẩn Kết giải trình tự sản phẩm PCR HPV 16 HPV 18 so sánh với trình tự đăng ký Ngân hàng gen quốc tế nhận tương đồng 99% HPV 16 100% với HPV 18 Kiểm tra khả phát genotyp HPV cặp mồi đặc hiệu để phát HPV 16 HPV 18 mẫu bệnh phẩm kỹ thuật PCR lồng đạt kết tốt 46 KHUYẾN NGHỊ Tiếp tục thử nghiệm cặp mồi đặc hiệu để phát genotyp HPV 16 HPV 18 số lượng mẫu thử lớn Thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhằm phát genotyp HPV khác 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Hội thảo khoa học lần thứ ba "Nhiễm HPV phòng ngừa bệnh liên quan" 19/7/2014 Giáo trình Vi sinh vật y học – GS TS Lê Huy Chính – Trang 390 Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, Vol.14 - Supplement of No 1-2010: p 311 – 320 Theo nghiên cứu Vũ Thị Hoàng Lan Bùi Diệu năm 2011 - Đại học Y tế Công cộng Hà Nội Hồ Huỳnh Thùy Dương, Phan Kim Ngọc Sinh học phân tử, Nhà xuất Giáo dục, 1998 TiếngAnh Agoston ES1, Robinson SJ, Mehra KK, Birch CAm J ClinPathol (2010 ): Polymerase chain reaction detection of HPV in squamous carcinoma of the oropharynx;134(1): 36-41 doi: 10.1309/AJCP1AAWXE5JJCLZ Benjamin G E., Ernesto M R., Emilio A F Human papillomavirus genotype in human immunodeficiency virus-positive in patients with anal pathology in Madrid, Spain Diagnostic Pathology 2013, 8: 204-213 Bodaghi S, Wood L.V, Roby G, Ryder C, et al (2005): Could human papillomaviruses be spread through blood? Journal of Clinical Microbiology 43(11):5428-34 Brian J Morris Cervical human papillomavirus screening by PCR: advantages of targeting the E6/E7 region Clin Chem Lab Med 2005;43(11):1171–1177 10 Burd EM (2003): Human papillomavirus and cervical cancer Clinical Microbiology Review.16(1):1-17 48 11 Clifford GM, Rana RK, Franceschi S, et al (2003): Com parion of HPV type distribution in high grade cervical lesions and cervical cancer: a meta analysis, Br J Cancer;89:101-105 12 Comprehensive Cervical Cancer Control, a Guide to Essential Practice WHO 2006 13 De Villiers EM, Fauquet C, Broker TR, et al (2004): Classification of papillomaviruses Virology;324:17–2 14 Division of Virology, National Institute for Medical Research, The Ridgeway, Mill Hill, London, NW7 1AA, United Kingdom 15 E.R Flores, B.L Allen, D Lee, C.A Sattler and P.F Lambert(1999): Establishment of the human papillomavirus type 16 (HPV-16) life cycle in an immortalized human foreskin keratinocyte cell line Virology ;262(2):344-54 16 Frisch M, Fenger C, van den Brule AJ et al Variants of squamous cell carcinoma of the anal canal and perianal skin and their relation to human papillomaviruses Cancer Res, 1999; 59:753–757 17 Genetic Library Construction and Screening: Advanced Techniques and Applications by R Curtis Bird,Bruce Smith, 35 – 37 18 Karlsen F et al., Use of multiple PCR primer sets for optimal detection of human papillomavirus J Clin Microbiol 1996 Sep;34(9):2095–2100 19 Lilit Garibyan, Nidhi Avashia (2013) “Polymerase Chain Reaction” Journal of Investigative Dermatology: 133, J M S Bartlett and D Stirling © Humana Press Inc., Totowa, NJ: Methods in Molecular Biology, Vol 226: PCR Protocols, Second Edition 20 Lont A P, Kroon B K, Horenblas S Galle M P, Berkhof J, Meijer C.J &Snijders P J (2006), “Presence of high-risk human papillomavirus DNA in penile carcinoma predicts favorable outcome in survival”, International Journal of Cancer, 119(5): pp 1078-1081 21 Lowy D.R.,Howley P.M.(2004): Papillomaviruses, Field Virology, 2, pp 2231-2257 49 22 M Thomas, D Pim and L Banks (1999): The role of the E6-p53 interaction in the molecular pathogenesis of HPV, Oncogene, vol 18, no 53, pp 7690–7700 23 M Yoshinouchi, A Hongo, K Nakamura, J Kodoma, S Itoh, H Sakai, et al (1999) Journal of Clinical Microbiology 37, 3514 24 M.Farve Journal of Virology 15, 1239 (1975) 25 Menstrual Disorders by Deborah Ehrenthal,Matthew Hoffman (MD.),Paula Adams Hillard -37 26 Modis,Y.,Trus, B L and Harrison, S C (2002): Atomic model of the papillomavirus capsid EMBO J 21, 4754-4762 27 Molijn A, Kleter B, Quint W, van Doorn LJ Molecular diagnosis of human papillomavirus (HPV) infections J Clin Virol, 2005;32(Suppl 1):S43–S51 28.Pathology and Genetics of Skin Tumoursby Philip E LeBoit - Trang 34 29 Pettersson E, Lundeberg J, Ahmadian A Generations of sequencing technologies Genomics.2009 93 (2): 105–11 30 Pim D, Collins M, Banks L (1992): Human papillomavirus type 16 E5 gene stimulates the transforming activity of the epidermal growth factor receptor Oncogene 7(1):27-32 31 Ramamoorthy S., et al Detection of multiple human papillomavirus genotypes in anal carcinoma Infectious Agents and Cancer 2010, 5:17 32 Sambrook and Russell Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, 200 33 Schiffman M, Castle PE (2003): Human papillomavirus: epidemiology and public health Arch Pathol Lab Med; 127(8):930-4 34 Schiffman M, Castle PE, Jeronimo J, et al (2007): Human papillomavirus and cervical cancer Lancet; 370:890–907 35 Senba M., Kumatori A., Fujita S., Jutavijittum P., Yousukh A., Moriuchi T., Nakamura T., Toriyama K (2006), “The prevalence of Human 50 papillomavirus genotypes in penile cancer from northern Thailand”, Journal of Medical Virology, 78(10): pp 1341-1346 36 Stoler, M H (1996) A brief synopsis of the role of human papillomaviruses in cervical carcinogenesis American Journal of Obstetrics and Gynecology, 175(4), 1091-1098.AndTristram, A, &Fiander, (2007) Human papillomavirus (including vaccines) Obstetrics, Gynaecology& Reproductive Medicine, 17(11), 324-329 37 Tristram, A., &Fiander, A (2007): Human papillomavirus (including vaccines) Obstetrics, Gynaecology& Reproductive Medicine, 17(11), 324-329 38 Venceslau EM., Bezerra MM., Lopes AC., Onofre BM., et al., HPV detection using primers MY09/MY11 and GP5+/GP6+ in patients with cytologic and/or colposcopic changes J Bras Patol Med Lab, 2014.v 50, n 4, p 280-285 39 Venturoli S et al Evaluation of commercial kits for the detection and typing of human papillomavirus in cervical swabs J Virol Methods, 2002;105:49–56 40 WHO (2006), Comprehensive Cervical Cancer Control: A guide to essential practice, p:46-48 Tài liệu từ Internet 41.http://hpvinfo.vn/tieng-viet/hpv-la-gi-/tinh-hinh-nhiem-hpv/ty-le-hienmac-va-phan-bo-kieu-gen-adn-cua-hpv-o-phu-nu-c6871i9142.htm 42.http://hpvinfo.vn/tieng-viet/trang-chu/hoi-thao-khoa-hoc-lan-thu-banhiem-hpv-va-phong-ngua-cac-benh-lien-quan-c6560i13835.htm 43 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3493113/ 44 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3667944/ 45 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC548454/ 51 Khoá luận tốt nghiệp Nghiên cứu chế tạo sinh phẩm phát genotyp HPV 16 HPV 18 52 [...]... của HPV 16 và L1 của HPV 18 đã được công bố trên Ngân hàng gen quốc tế (hình 3.3 và 3.4) 3.4 Ứng dụng cặp mồi đặc hiệu để phát hiện genotyp HPV 16, 18 trên các mẫu bệnh phẩm Để đánh giá khả năng phát hiện HPV 16 và HPV 18 bằng cặp mồi đặc hiệu chúng tôi tiến hành kiểm tra trên 50 mẫu sinh thiết ung thư cổ tử cung, dương vật, hậu môn đúc paraffin đã được xác định genotyp HPV bằng kit LightPowerNA HPV Genotyp. .. genotyp HPV 16 và HPV 18 được thể hiện trong bảng 3.3 và bảng 3.4 Bảng 3.3 Trình tự các cặp mồi đặc hiệu phát hiện HPV 16 HPV1 6 Mn HPV 16 Pn HPV 16 Mt HPV 16 Pt GCAATGTAGGTGTATCTCCAT AACTGCAATGTTTCAGGACCC TGCAACAAGACATACATCGACCG CAGGAGCGACCCAGAAAGTTACC Tm = 500C Tm = 470C Tm = 500C Tm = 540C Bảng 3.4 Trình tự các cặp mồi đặc hiệu phát hiện HPV 18 HPV 18 Mn HPV 18 Pn HPV 18 Mt HPV 18 Pt AAGACGTAGTGGCAGATGGAGC... (Biotech) 2.3 Sơ đồ nghiên cứu Tách chiết ADN tổng số từ mẫu chuẩn Kiểm tra cặp mồi đặc hiệu bằng phản ứng PCR Gửi kết quả PCR đi giải trình tự gen Phân tích kết quả giải trình tự gen Các cặp mỗi đặc hiệu phát hiện genotyp HPV 16, 18 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu thử Phát hiện genotyp HPV 16, 18 bằng phản ứng PCR Điện di sản phẩm PCR Đọc và phân tích kết quả điện di 24 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 2.4 Kỹ thuật... 116 21,5 312,4 51,5 134 128,7 218, 7 48,9 146,1 36,2 92,3 226,4 420,9 2,06 1,96 1,89 1,86 1,98 1,93 1,92 1,92 1,83 1,90 1,94 1,94 Từ kết quả trên cho thấy nồng độ ADN tổng số của các mẫu thử tương đối cao, độ tinh sạch đều nằm trong khoảng 1,7 – 2,0 3.2 Kiểm tra khả năng phát hiện genotyp HPV 16, 18 của các cặp mồi đặc hiệu đối với mẫu chuẩn Trình tự 4 cặp mồi đặc hiệu phát hiện genotyp HPV 16 và HPV. .. AGTGGCAGATGGAGCAGAACG AAAGGCAGGTATGCGTGC Tm = 510C Tm = 490C Để phát hiện genotyp HPV 16, 18 chúng tôi tiến hành phản ứng Nested PCR (PCR lồng) với khuôn là ADN tổng số được tách chiết từ mẫu chuẩn HPV 16 và HPV 18 Dựa vào nhiệt nóng chảy (T m) của từng mồi 32 chúng tôi lựa chọn nhiệt độ gắn mồi phù hợp cho từng cặp mồi trong mỗi vòng phản ứng PCR Thành phần và điều kiện phản ứng được trình bày chi tiết trong bảng 3.5,... thực hiện phản ứng PCR, sản phẩm khuếch đại được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 1% (hình 3.2) Nhận thấy sản phẩm mỗi vòng đều chỉ xuất hiện một băng duy nhất, không có sản phẩm phụ, kích thước phù hợp với tính toán Hình 3.2 Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR bằng các cặp mồi đặc hiệu M: thang chuẩn ADN; V16, V26 và V18, V28 lần lượt là sản phẩm khuếch đại vòng 1, 2 cho HPV 16 và HPV 18 34... nhất chứng tỏ ADN tổng số sau tách chiết còn nguyên vẹn, không bị đứt gãy (hình 3.1) Bằng máy đo quang phổ kế chúng tôi thu được nồng độ ADN khá cao, độ tinh sạch từ 1,8-1,91 như trong bảng 3.1 Bảng 3.1 Nồng độ và độ tinh sạch của hai mẫu chuẩn HPV 16 và HPV 18 STT HPV 16 HPV 18 Nồng độ (ng/µl) 147,3 152,2 Độ tinh sạch 1,8 1,91 3.1.2 Tách chiết ADN tổng số của mẫu thử Để thử nghiệm cặp mồi đặc hiệu chúng... giữa hai mồi hơn kém nhau dưới 50C Vị trí liên kết bổ sung của hai mồi trên khuôn xác định độ dài đoạn ADN được khuếch đại Muốn thiết kế mồi cho phản ứng PCR đòi hỏi phải biết trước trình tự hai đoạn ADN trên khuôn Nồng độ mồi thường sử dụng trong phản ứng PCR từ 0,05-1 μM Nếu nồng độ mồi quá cao sẽ làm tăng sự bắt cặp nhầm giữa mồi và khuôn tạo ra nhiều sản phẩm PCR không đặc hiệu Với những cặp mồi biến... đang phát triển Các số liệu thống kê cũng chỉ ra rằng có tới 99,7% các ca ung thư cổ tử cung phát hiện thấy sự có mặt của virus HPV, đặc biệt tập trung vào hai genotyp HPV 16 và HPV 18 [12] 16 Mặt khác, HPV không chỉ là nguyên nhân gây một số bệnh ung thư ở nữ giới mà còn là một trong những yếu tố nguy cơ quan trọng gây ra một số bệnh ung thư ở nam giới, trong đó có ung thư dương vật Tỷ lệ nhiễm HPV. .. Isopropanol, Ethanol, Tris–HCl, ethidium bromide Các hóa chất sử dụng cho sinh học phân tử đều là sản phẩm của các hãng lớn uy tín như Invitrogen, Fermentas 23 2.2.2.3 Vật liệu Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để phát hiện genotyp HPV 16 và HPV 18 do Bộ môn Sinh học phân tử trường Đại học Y Dược Hải Phòng thiết kế 2.2.2.4 Trang thiết bị Lò vi sóng (Sanyo, Nhật Bản); Máy ly tâm (Microcentrifuge-Sorvall, Mỹ); Tủ lạnh ... khả phát genotyp HPV 16, 18 cặp mồi đặc hiệu mẫu chuẩn Trình tự cặp mồi đặc hiệu phát genotyp HPV 16 HPV 18 thể bảng 3.3 bảng 3.4 Bảng 3.3 Trình tự cặp mồi đặc hiệu phát HPV 16 HPV1 6 Mn HPV 16. .. [5] cặp mồi thiết kế cho phản ứng Nested PCR (PCR lồng) để phát genotyp HPV 16, 18 HPV 16 Mn/Pn, HPV 16 Mt/Pt, HPV 18 Mn/Pn HPV 18 Mt/Pt Trong cặp mồi HPV 16 Mn/Pn Mt/Pt cặp mồi cho vòng vòng HPV. .. Ngân hàng gen quốc tế (hình 3.3 3.4) 3.4 Ứng dụng cặp mồi đặc hiệu để phát genotyp HPV 16, 18 mẫu bệnh phẩm Để đánh giá khả phát HPV 16 HPV 18 cặp mồi đặc hiệu tiến hành kiểm tra 50 mẫu sinh thiết