NUÔI CẤY INVITRO TỪ MÔ SẸO

MỞ ĐẦU……………………………………………………………………….1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………2 1.1 Sơ lược lý thuyết mô sẹo…………………………………………………...2 1.1.1 Khái niệm mô sẹo…………………………………………………...2 1.1.2 Đặc tính của mô sẹo………………………………………………...2 1.1.3 Ứng dụng của mô sẹo……………………………………………...2 1.1.4 Sự tạo chồi từ mô sẹo……………………………………………....3 1.1.5 Cảm ứng tạo mô sẹo………………………………………………..4 1.2 Pháp nuôi cấy mô sẹo………………………………………………………4 1.2.1 Nguyên tắc nuôi cấy mô sẹo………………………………………..4 1.2.2 Đặc điểm của quá trình nuôi cấy mô sẹo…………………………..6 1.2.3 Nhân giống thông qua giai đoạn callus……………………………6 Chương 2: SƠ LƯỢC VỀ LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU TẾ BÀO THỰC VẬT.....................................................................................................................10 Chương 3: QUI TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO BẰNG CÁCH TẠO MÔ SẸO………………………………………………………………………..14 3.1 Sơ đồ ……………………………………………………………………….14 3.2 Thuyết minh……………………………………………………………….15 3.3 Vật liệu và môi trường nuôi cấy………………………………………….17 3.3.1 Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy…………………………………...17 3.3.1.1 Khoáng đa lượng……………………………………………………………17 3.3.1.2 Khoáng vi lượng……………………………………………………………..17 3.3.1.3 Vitamine ……………………………………………………………………..18 3.3.1.4 Các chất điều hòa sinh trưởng…………………………………………….18 3.3.1.5 Các chất hữu cơ khác……………………………………………………….18 3.3.2 Môi trường nuôi cấy………………………………………………...19 3.3.2.1 Đường………………………………………………………………..19 3.3.2.2 Các khoáng đa lượng……………………………………………...20 3.3.2.3 Các khoáng vi lượng……………………………………………….21 3.3.2.4 Các vitamine………………………………………………………..22 3.3.2.5 Các chất điều hòa sinh trưởng……………………………………23 3.3.2.6 Các chất hữu cơ khác……………………………………………...24 3.3.2.7 Chú ý…………………………………………………………………25 Chương 4: CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊNG CỨU…………………………26 4.1 Nghiên cứu sự hình thành mô sẹo và tế bào đơn cây Kiwi……………..26 4.1.1 Phân tích:……………………………………………………………26 4.1.1.1 Vật liệu………………………………………………………………26 4.1.1.2 Môi trường nuôi cấy:………………………………………………26 4.1.1.3 Điều kiện nuôi cấy………………………………………………….26 4.1.2 So sánh:……………………………………………………………...26 4.1.3 Kết luận:……………………………………………………………..28 4.2 Tạo mô sẹo và tái sinh chồi từ mô lá non cây bí Kì Nam……………….28 4.2.1 Phân tích…………………………………………………………….28 4.2.1.1 Vật liệu:……………………………………………………………...28 4.2.1.2 Phương pháp:………………………………………………………28 4.2.1.3 Môi trường nuôi cấy……………………………………………….29 4.2.1.4 Bố trí thí nghiệm……………………………………………………29 4.2.2 So sánh:……………………………………………………………...29 4.2.3 Đánh giá …………………………………………………………….30 4.3 Quá trình phát sinh mô sẹo và chồi của cây Long Não………………...30 4.3.1 Phân tích…………………………………………………………….30 4.3.1.1 Vật liệu………………………………………………………………30 4.3.1.2 Phương pháp………………………………………………………..31 4.3.1.3 Bố trí thí nghiệm …………………………………………………..31 4.3.1.4 Điều kiện nuôi cấy…………………………………………………31 4.3.2 Kết quả và thảo luận……………………………………… ………..32 4.3.3 Đánh giá:…………………………………………………………….34 4.4 Khảo sát khả năng tạo mô sẹo từ cuống lá, phiến lá và nụ hoa phục vụ cho việc vi nhân giống hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii Bolus)………………………………………………………………………..34 4.4.1 Phân tích…………………………………………………………….34 4.4.1.1 Vật liệu:…………………………………………………….............34 4.4.1.2 Phương pháp……………………………………………………….34 4.4.2 So sánh :…………………………………………………………….35 4.4.3 Đánh giá:……………………………………………………………36 KẾT LUẬN……………………………………………………………….........36 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………….37 Ngành CNSH đã và đang ngày càng tỏ ra thực sự có ý nghĩa lớn đối với đời sống con người, hiện đã được Chính phủ ưu tiên đầu tư cho những nghiên cứuvà những kế hoạch mang tính ứng dụng cao. CNSH được xem là cánh tay đắc lực trong lĩnh vực nông nghiệp kỹ thuật cao và các nước phát triển trên thế giới đã và đang ứng dụng hiệu quả như Mỹ, Nhật, Thái Lan,...Ngành này không chỉ bó hẹp ở lĩnh vực nông nghiệp mà còn là ngành học của sức khỏe, khoa học thực phẩm và bảo vệ môi trường. Trong lĩnh vực nông nghiệp, CNSH hiện đại sẽ mang lại những đột phá về nhân giống, lai tạo giống cây trồng, vật nuôi, nuôi cấy mô thực vật và “cao cấp” hơn là sinh vật chuyển gene. Những giống cây trồng cho năng suất cao, kháng sâu bệnh, chịu được thuốc diệt cỏ, chịu được sự khắc nghiệt của môi trường sống, có khả năng loại bỏ chất ô nhiễm là những kết quả mà công nghệ sinh học nông nghiệp mang đến. Với xu thế phát triển nông nghiệp công nghệ cao thì triển vọng của ngành này là rất lớn. Nhờ ứng dụng các thành tựu mới mẻ của công nghệ sinh học như nhân giống in vitro bằng cách tạo mô sẹo ,... người ta có thể tạo ra được những giống cây trồng không những có năng suất cao mà còn chống chịu được với sâu bệnh, thích nghi tốt với thời tiết… Đối với các loại cây quí hiếm, có giá trị thương mại lớn, kĩ thuật nhân giống in vitro bằng cách tạo mô sẹo đã đem lại những hiệu quả kinh tế hết sức rõ rệt.

MỞ ĐẦU

Ngành CNSH ã và ang ngày càng tđ đ ỏ ra thực sự có ý nghĩa lớn đối

với đời sống con người, hiện ã đ được Chính phủ ưu tiên đầu tư cho

những nghiên cứuvà những kế hoạch mang tính ứng dụng cao CNSH

được xem là cánh tay đắc lực trong lĩnh vực nông nghiệp kỹ thuật cao

và các nước phát triển trên thế giới ã và ang đ đ ứng dụng hiệu quả

như Mỹ, Nhật, Thái Lan, Ngành này không chỉ bó hẹp ở lĩnh vực nông nghiệp mà còn là ngành học của sức khỏe, khoa học thực phẩm

Đối với các loại cây quí hiếm, có giá trị thương mại lớn, kĩ thuật nhân giống in vitro bằng cách tạo mô sẹo đã đem lại những hiệu quả kinh tế hết sức rõ rệt.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nuôi cấy tế bào thực vật

1.1.1 Khái niệm mô sẹo

- Khi các phần bị cắt hay bị tổn thương của thân, rễ, lá … được đặt vào môi trường thích hợp sau một thời gian tại đó sẽ xuất hiện những phần mô lồi ra

có màu trắng nhạt hoặc vàng nhạt mô này gọi là mô sẹo hay callus

11.2 Đặc tính của mô sẹo

- Mô sẹo phát triển không theo quy luật nhưng có thể có khả năng biệt hóa thành rễ, chồi và phôi để hình thành cấy hoàn chỉnh

1.1.1 Ứng dụng của mô sẹo

Nuôi cấy mô sẹo là khâu rất quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào Mô sẹo là nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác như: phân hóa mô

và tế bào, chọn dòng tế bào, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi soma, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học…

• Nhân giống in vitro các loài thực vật bằng phương pháp nhân giống đỉnh sinh trưởng ít hiệu quả hay khó thực hiện hơn nuôi cấy mô sẹo

• Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan

• Làm nguồn nguyên liệu để nuôi cấy tế bào đơn cho chọn lọc dòng tế bào

• Thu nhận các sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cao

• Nuôi cấy huyền phù tế bào

Nhân giống invitro bằng cách tạo mô sẹo ứng dụng để nhân nhanh giống cây

có năng xuất cao, chất lượng tốt, thích nghi với điều kiện sống và duy trì ưu thế lai

Khả năng sử dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật vào công tác giống cây trồng với mô sẹo có mục đích tạo phôi vô tính, nuôi cấy tế bào đơn và tách tế bào trần, tạo cây có biến dị soma ( tạo nhiều biến dị nhất trong nuôi cấy mô), tạo lượng chồi rất lớn( lớn hơn phương pháp đỉnh sinh trưởng)

Nhân giống invitro bằng cách tạo mô sẹo còn giúp bảo tồn các giống quý hiếm

1.1.4 Sự tạo chồi từ mô sẹo

Theo Thomas và Davey (1975) sự hình thành chồi từ mô sẹo được kích thích bởi:

- Các chất sinh trưởng

- Các chất được sản sinh trong nuôi cấy mô sẹo

- Các chất chứa sẵn trong mẫu cấy

Khả năng hình thành chồi từ mô sẹo phụ thuộc vào:

- Số lần cấy chuyền ( các chất trong mẫu cấy có khả năng tổng hợp trong thời gian dài)

- Sự hình thành tế bào xốp

1.1.2 Cảm ứng tạo mô sẹo

Sự hình thành mô sẹo có thể chia ra làm 3 thời kỳ:

- Thời kỳ cảm ứng tế bào chuyên hóa của mẫu cấy chuyển ngược trạng thái phát triển, biến đổi hình thái và chức năng theo hướng tế bào phân sinh

- Thời kỳ phân chia tế bào: các tế bào phân hóa của mô sẹo có tần suất phân chia tương đối nhanh

- Thời kỳ phân hóa tế bào: tốc độ phân chia và sinh trưởng giảm đi cho tới khi dừng hẳn, trong mô sẹo xuất hiện cấu trúc mô dẫn

Tác nhân chủ yếu gây cảm ứng mô sẹo là chất điều hòa sinh trưởng Không phải tất cả các thực vật đều cảm ứng tạo mô sẹo bởi các chất sinh trưởng thực vật Tùy thuộc vào chủng loại mẫu cấy mà có sự khác biệt về loại và hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cảm ứng

mô sẹo

Tùy mục đích nghiêng cứu thực nghiệm mà chọn loại và hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật khi cảm ứng mô sẹo

1.2 Pháp nuôi cấy mô sẹo

1.2.1 Nguyên tắc nuôi cấy mô sẹo

Trong đặc tính sinh lý của cơ thể thực vật, khi bị những tổn thương về mặt vật

lý (những vết cắt trên cơ thể, những tổn thương do côn trùng tấn công) thực vật có khả năng hình thành những tế bào mới để hàn kín những chỗ tổn

thương đó Những tế bào mới được hình thành đó là tế bào mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào nhu mô phát triển vô tổ chức, hiện diện trong các giai đoạn hoá lignin khác nhau của thực vật, thường do các tế bào trong vùng tượng tầng (vùng phân sinh) như tượng tầng liber –mộc, tượng tầng vỏ ở gốc của đoạn cắt tạo thành Những tế bào mô sẹo thường có hình cầu, màu trắng hoặc nâu nhạt Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích sinh trưởng tạo mô sẹo

Nuôi cấy tạo mô sẹo được thực hiện đối với các loài thực vật không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Những mô của thực vật

có thể dùng nuôi cấy tạo mô sẹo là: tượng tầng libe mộc, tượng tầng vỏ, phôi nhũ, tế bào diệp lục, lá, trụ bì rễ, tử diệp… Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ Từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cho cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy

Mô sẹo thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là trong sự tạo rễ Do đó, cây non hay những mảnh thân non của cây trưởng thành dễ tạo mô sẹo Ngược lại, những mảnh cơ quan trưởng thành không có khả năng tạo mô sẹo Sự tạo mô sẹo ở thực vật xảy ra khi môi

trường nuôi cấy được bổ sung một lượng auxin (2,4-D) thích hợp

Sự tạo mô sẹo do tác dụng của auxin do 3 quá trình:

- Sự phản phân hoá của tế bào nhu mô: xảy ra ở các tế bào nhu mô mộc

và libe, nhu mô vỏ hay lõi

- Sự phân chia của các tế bào tượng tầng: các tế bào bào tượng tầng của phần lớn cây hai lá mầm dễ dàng phân chia dưới tác động của auxin đỉnh sinh trưởng

- Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ)

Màu sắc của mô sẹo không giống nhau trên các môi trường nuôi cấy khác nhau hay trên các bộ phận khác nhau và chúng thường có màu vàng, trắng, nâu hay trắng xanh…

Nồng độ và loại kích thích tố sử dụng trong môi trường nuôi cấy là những yếu

tố có ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển mô sẹo Thường mô sẹo được hình thành trên môi trường giàu auxin; có thể dùng auxin riêng rẽ hay kết hợp với nhau hoặc có thể kết hợp với cytokinin tùy từng loại cây

Hàm lượng hormon nội sinh và chiều di chuyển của các hormon này trong mẫu cấy có ảnh hưởng đến sự phát sinh mô sẹo Vì vậy nguồn mẫu cấy, việc lấy mẫu cấy, cách đặt mẫu cấy trên môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến sự phát sinh mô sẹo dẫn đến những phản ứng khác nhau của mẫu cấy Với một

số cây thì vấn đề này không quan trọng nhưng cũng có một số cây chịu ảnh hưởng rất lớn

1.2.2 Đặc điểm của quá trình nuôi cấy mô sẹo

Nuôi cấy tế bào thực vật được khởi đầu bằng việc hình thành các tế bào

không phân hóa, được gọi là callus

Nuôi cấy callus đạt được bằng cách nuôi cấy các mẫu mô tách từ thực vật trên môi trường dinh dưỡng cơ bản có chất làm rắn là agar

Môi trường dinh dưỡng cơ bản này chứa các chất dinh dưỡng khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn carbon và nhiều loại chất điều hòa sinh trưởng thực vật.

Đánh giá chính xác các ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng hoặc chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng sinh trưởng của callus là yêu cầu quan trọng để xác định môi trường tối ưu cho nuôi cấy Các thông số phổ biến nhất dùng trong đánh giá sinh trưởng trong nuôi cấy callus bao gồm khối lượng tươi, khối lượng khô và chỉ số sinh trưởng

Trong nuôi cấy callus, các tế bào của callus có thể trải qua biến dị dòng soma trong quá trình cấy chuyển Vì vậy, các dòng tế bào ổn định di truyền nên được lựa chọn để tránh sự sản xuất thất thường các chất trao đổi thứ cấp trong nuôi cấy Thông thường, sau một số lần cấy chuyển, callus có thể được xem là dòng tế bào đồng nhất khi các thông số sinh trưởng của dòng tế bào được lặp lại trong quá trình cấy chuyển trên cùng một loại môi trường nuôi cấy

Bouque và cộng sự (1998) đã nghiên cứu nuôi cấy 217 dòng callus khác nhau

từ các loài của chi Psoralea nhận thấy, sau 16 lần cấy chuyển (48 tuần), có khoảng 90% số dòng callus sinh trưởng ổn định Fett-Neto và cs (1994) nuôi cấy tế bào cây Taxus cuspidate và thu được dòng tế bào ổn định sinh trưởng sau 2 năm cấy chuyển

1.2.3 Nhân giống thông qua giai đoạn callus

Trong nhân giống in vitro nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật nuôi cấy ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà các cây cũng khá đồng nhất về mặt di truyền Tuy nhiên, nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh cây ngay mà phát triển thành khối callus Tế bào callus khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền Để tránh tình trạng đó nhất thiết phải sử dụng loại callus vừa phát sinh, tức là callus sơ cấp để tái sinh cây thì hy vọng sẽ thu được cây tái sinh đồng nhất Thông qua giai đoạn callus còn có thể thu được những cá thể sạch virus như trường hợp của Kehr và Sehaffer (1976) thu được ở tỏi.

Hình 4.2 Nhân giống thông qua giai đoạn tạo mô sẹo

A Mô sẹo cây tỏi sau 2 tuần nuôi cấy

B Mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy

C Tạo chồi từ mô sẹo

D Cây tái sinh từ mô sẹo

E Củ tỏi thu được từ cây con nuôi cấy mô thông qua tạo mô sẹo

Sơ đồ 4.2 Mẫu mô phát sinh callus, callus tạo chồi và phát triển cây hoàn

chỉnh (thông qua phương thức phát sinh chồi bất định).

Sơ đồ 4.3 Mẫu mô phát sinh callus, callus phát sinh phôi soma (hoặc nuôi cấy dịch huyền phù tế bào phát sinh phôi soma) và từ phôi thu được cây hoàn

chỉnh.

Chương 2 : SƠ LƯỢC VỀ LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU TẾ BÀO THỰC VẬT

- Năm 1938-1939 học thuyết hiện đại về tế bào học được công bố do hai nhà khoa học M.J.Scleiden( nhà nghiên cứu thực vật) và T.Schwann( nhà

nghiên cứu động vật) đề xuất Học thuyết này khẳng định: “ mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ là các tế bào hợp thành Các tế bào đã phân hóa đều mang các thông tin có trong tế bào đầu tiên và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể.”

- Năm 1902 nhà khoa học Haberlandt lần đầu tiên đưa các giả thuyết của Scleiden và Schwann vào thực nghiệm Haberlandt cho rằng: có thể tạo cá thể hoàn chỉnh từ việc nuôi cấy tế bào Tuy nhiên, Haberland đã không thành công trong việc nuôi cấy tế bào thực vật những hạn chế về phương tiện kỹ thuật, kiến thức khoa học thời bấy giờ đã không đưa ông đến thành công như mong đợi.

- Năm 1922, Kotte nhà khoa học Mỹ lặp lại thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ loại cây họ hòa thảo Trong môi trường lỏng có chứa dinh dưỡng khoáng và đường glucose, đầu rễ sinh trưởng rất mạnh tạo thánh một hệ rễ bao gồm cả rễ phụ Tuy vậy, sinh trưởng của mẫu tồn tại một thời gian, sau đó chậm dần và ngừng lại, mặc dù tác giả đã chuyển qua môi trường mới

- 1924 Hình thành callus từ rễ cà rốt trong môi trường có acid lactic

Blumenthal F and Meyer P Z Krebsforsch

- Năm 1934, giai đoạn thứ hai trong lịch sử nuôi cấy mô thực vật White- nhà khoa học Mỹ, nuôi cấy thành công tên cây cà chua với môi trường lỏng chứa dinh dưỡng khoáng, đường và các dịch nấm men Sau đó White chứng minh có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp ba loại vitamin nhóm B: Thiamine (B1), pyridoxine (B6) và nicotinic acid Từ đây, việc nuôi đã được tiến hành ở nhiều cây khác nhau Đồng thời,

Gautheret tiến hành các nghiên cứu và thành công nuôi cấy mô phân sinh(tượng tầng) một số cây thân gỗ Went & Thimann phát hiện chất điều hòa sinh trưởng (homon) đầu tiên- acid B- indolacetic (IAA) Gautheret

xác nhận tác dụng của chất kích thích sinh trưởng trên mô sẹo của IAA và

3 nhóm vitamin do White khởi xướng Cùng với Nobercourrt (1939) Gautheret thành công trong việc duy trì sinh trưởng của mô sẹo cà rốt trên môi trường rắn có chứa thạch agar

- Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng

(cambium) ở cà rốt và thuốc lá, mô sẹo có khả năng sinh trưởng liên tục

- Năm 1941, nhà khoa học Overbeck chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi từ mẫu cây họ cà

- Năm 1948, Steward xác nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo cà rốt Sau đó nhiều chất kích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp thành công Hợp chất NAA và chất 2,4-(Dichloro pheloxy acetic acid) được bắt đầu sử dụng ở nồng độ cao để trừ

cỏ trong sản xuất nông nghiệp

- Nhiều báo cáo cho thấy cùng với nước dừa 2,4D và NAA giúp cho quá trình hình thành mô sẹo, tăng khả năng phân chia thế bào trong quá trình tạo cây hoàn chỉnh trng nuôi cấy invitro

- 1954 Muir và cộng sự lần đầu tiên tạo được mô sẹo từ mô nuôi dưỡng (nurse culture)

- Năm 1955, nhà khoa học Hoch Skoog phát hiện thấy vai trò của một hợp chất có tác dụng kích thích phân bào, và đặt tên là Kinetin

- Sau này, các nhà khoa học nghiên cứu tỷ mỷ hơn vai trò của Kinetin và xếp vào nhóm cytokinin

- Việc phát hiện và xác định được vai trò của IAA, 2,4D, kinetin cùng xác định được vai trò của các vitamine, nước dừa được coi là bước tiến quan trọng trong gia đoạn thứ hai của lịch sử nuôi cấy mô thực vật, đây là

những tiền đề kỹ thuật cho xác lập môi trường nuôi cấy cho nhiều loài thực vật

- Năm 1957, Skoog và Miller công bố kết quả nghiêng cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ kinetin/auxin đối với sự hình thành mô sẹo cây thuốc lá Khi giảm thấp tỷ lệ kinetin/auxin, mô sẹo có xu hướng tạo rễ, ngược lại nếu tỷ

lệ kinetin/auxin tăng lên, mô sẽ phát sinh chồi hiện tượng này xác nhận có kết quả giống nhau trên nhiều laoij cây trồng Kết quả nghiêng cứu gps phần quan trọng trong việc sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy invitro

- Năm 1958, Kerint và Sterwward tạo được phôi và cây hoàng chỉnh từ tế bào thượng tâng cây cà rốt

- 1960 Morelddax thành công trong nhân giống invitro lòa lan Cymbidium

từ mẫu nuôi cấy là đỉnh sinh trưởng Nuôi cấy các đỉnh sinh trưởng hình thành dạng cụm chồi gọi là các protocom Khi tách các protocom tiếp tục nuôi cấy trên môi trường phù hợp, mẫu sẽ hình thành các protocom mới Điều chỉnh môi trường phù hợp, mâu nuôi cấy có thể phát triển thành cây hoàn chỉnh

- Năm 1960, nhà khoa học Cooking lần đầu tiên dùng enyme phân hủy thành tế bào và tạo ra số lượng lớn tế bào trần trên nhiều loại cấy trồng khác nhau

- 1962 Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật- môi trường MS

- Năm 1966, Guha và cộng sự thành công trong nuôi cấy tạo cây đơn bội ở

cà độc dược từ bao phấn

- Năm 1967-1968 lần lượt Nichko Nakaro và cộng sự tạo được cấy đơn bội

từ bao phấn thuốc lá

- Năm 1971, takebe tái sinh thành công cây thuốc lá từ tế bào trần

- Năm 1972, Carlson và cộng sự lần đầu tiên thực hiện lai tế bào soma hai loài khác nhau, tạo được cây từ dung hợp tế bào trần của hai loài thuốc la Nicoriana glauca và N langsdorfi

- 1975 Gengenbach và Green chọn lọc dòng tế bào kháng bệnh nấm

Helminthosporium maydis trong nuôi cấy mô sẹo ngô

- Năm 1980-1992 nhiều thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gen thực vật

Hiện nay, nuôi cấy mô tế bào thực vật đang ở giai đoạn thứ 4, nuôi cấy mô được ứng dụng khá phổ biến trong nhân giống cây trồng, chọn tạo giống, tạo đột biến, tạo sinh khối, sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học… các ứng dụng về nuôi cấy mô tế bào thực vật nói riêng và công nghệ tế bào thực vật nói chung đang trở thành công cụ có hiệu quả trong việc tạo ra sản phẩm đặc thù phục vụ con người

Chương 3: QUI TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO BẰNG CÁCH TẠO

MÔ SẸO 3.1 Sơ đồ

3.2 Thuyết minh

Cách tiến hành:

Bước 1: Chuẩn bị cây mẹ, lựa chọn mẫu cấy

- Cây mẹ phải sạch bệnh và đang ở trong giai đoạn tăng trưởng mạnh nhất

- Khi lựa chọn mô cấy như tế bào soma ( chồi, rễ, thân, lá) cần lưu ý đến tuổi sinh lí của cơ quan đó, vụ mùa lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu

đó

Bước 2: Khử trùng mẫu cấy:

- Mẫu cấy sau khi được chọn lựa được rửa sạch bằng xà phòng và khử trùng bề mặt bằng các chất khử trùng hóa học như calcium hypochloride , clorua thủy ngân, …

- Khử trùng mẫu cấy bên ngoài tủ cấy vô trùng

- Khử trùng mẫu cấy bên trong tủ cấy vô trùng

Bước 3: Tạo thể nhân giống in vitro và tăng sinh mô

- Tạo thể nhân giống:

+ Mẫu được nuôi cấy trên môi trường nhân tạo để tạo mô sẹo, , sau đó biệt hóa thành các mô khác nhau để tạo thể nhân giống in vitro

- Các phương pháp tăng sinh mô

+ Tạo phôi soma

+ Tăng cường sự phát triển chồi bên

+ Sự phát triển chồi bất định

- Nhân giống in vitro:

+ Vật liêu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chồi Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn nhanh Cây nhân giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa

và được duy trì trong thời gian dài

Bước 4: Ra rễ in vitro và tái sinh cây hoàn chỉnh:

- Ra rễ in vitro và điều kiên ra rễ

+ Sau khi nhân giống đủ số lượng chồi cần thiết điều quan trọng là cần chuyển chồi sang môi trường ra rễ để tái sinh cây hoàn chỉnh Cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, khoáng đa lượng, vi

lượng, vitamin, chất làm đặc môi trường, ngoài ra còn bổ sung thêm

các chất hữu cơ, nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ, ánh sáng thích hợp, các chồi sẽ ra rễ để tạo cây con hoàn chỉnh.

- Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh

+ Là giai đoạn cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân , lá , rễ để chuẩn bị chuyển ra vườn ươm Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trường bình thường

Bước 5: Chuyển cây con ra vườn ươm:

- Cây con được chuyển ra vườn ươm, được lấy khỏi ống nghiệm, bình nuôi cấy,… rửa sạch thạch, môi trường dinh dưỡng bám vào cây và được đặt trong rổ có lót giấy báo, phun thuốc diệt nấm, sau đó đặt nơi

có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp,…

- Trong 1 số trường hợp cây con dễ dàng ra rễ thì chuyển cây ra ngoài và tiến hành ra rễ ex vitro

3.3 Vật liệu và môi trường nuôi cấy

3.3.1 Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy

3.3.1.1 Khoáng đa lượng

- Nitrat canxi Ca(OH)2.4H2O

- Nitrat kali KNO3

- Nitrat natric NaNO3

- Nitrat amon NH4NO3

- Sunphat amon (NH4)2SO4

- Phot phat natri monobasic NaH3PO4.8H2O

- Phot phat kali monobasic KH2PO4

- Clorua kali KCl

- Clorua canxi CaCl2.4H2O

- Sunphat magie MgSO4.7H2O

- Ethylendiamintetra acetatdinatri (ETDA)

- Magie sunphat MgSO4.7H2O

- Molydat amon (NH4)6Mo7O24.4H2O

- Molydat Natri NaMoO4

- Clorua coban CoCl2.6H2O

- Iodua kali KI

3.3.1.3 Vitamine

3.3.1.4 Các chất điều hòa sinh trưởng

- Acid 2,4 dichloro phenol acetic (2,4D)

Thành phần nuôi cấy mô thực vật thay đổi tùy theo loài, bộ phận và mục đích nuôi cấy vì vậy thành phần môi trường là khác nhau Thành phần môi trường còn thay đổi theo các giai đoạn phát triển, phân hóa khác nhau của mẫu cấy

và mục đích nuôi cấy như: duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hoặc tái sinh cây hoàn chỉnh

Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy gồm:

- Đường làm nguồn cung cấp cacbon

- Khoáng đa lượng

- Khoáng vi lượng

- Các vitamine

- Chất điều hòa sinh trưởng

- Ngoài ra, tùy thuộc vào mục đích cấy có thể thêm một vài chất hữu cơ có thành phần xác định ( acid amin) hoặc không xác định ( nước dừa, dịch chiết nấm men) hoặc chất độn như thạch

3.3.2.1 Đường

- Trong môi trường nuôi cấy nhân tạo, đường cung cấp nguồn cacbon để tế bào thực vật tổng hợp nên chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối khi tế bào chưa có khả năng quang hợp hoăc chưa đảm nhận hoàn toàn chức năng quang hợp hai dạng đường hay sử dụng nhất là sucrose và glucose, nhưng hiện nay đường sucrose được sử dụng phổ biến hơn Tùy