KHOA CÔNG NGHỆ SINH BỘ MÔN SHPT & CNSH ỨNG DỤNG THỰC HÀNH SINH HỌC PHÂN TỬ Bài Nghiên cứu tương tác DNA protein (DNA and Protein interaction) Mục đích: - Sinh viên tìm hiểu mối tương tác ý nghĩa DNA protein thể sống - Sinh viên tiến hành thí nghiệm chứng minh mối tương tác DNA protein Nội dung: Vật liệu, hoá chất, dụng cụ: - Mẫu DNA, mẫu protein (T7 RNA Polymerase recombinant) - DNA Loading dye - Dung dịch đệm chạy TAE 1X - Agarose - Dung dịch nhuộm Ethidiumbromide - Bộ chạy điện di gel agarose, máy chụp ảnh UV Cơ sở khoa học - DNA luôn có tương tác chặt chẽ với protein, hình thành cấu trúc nucleosome, đóng gói DNA tế bào sinh vật Cụ thể, 1.75 vòng DNA, khoảng 145 Nu bọc quanh protein histone để đảm bảo trung hoà điện (Hình 1) Hình DNA cuộn xoắn với protein histone hình thành cấu trúc nucleosome - Tương tác DNA protein đóng vai trò quan trọng nhiều trình sinh học tế bào Cụ thể, tương tác enzyme RNA polymerase phải bám vào vị trí vùng promoter, để đảm bảo cho trình phiên mã diễn (Hình 2) Hình 2: RNA polymerase bám vào vùng promoter DNA - Protein tương tác với DNA thông qua: (i) tương tác tĩnh điện (electrostatic interactions) cách hình thành cầu nối muối (salt bridges); (ii) tương tác lưỡng cực (dipolar interactions) thông qua cầu hối hydro (hydrogen bonding, H-bonds); (iii) tương tác lượng entropy (entropic effects) thông qua tương tác kỵ nước (hydrophobic interactions) (iv) lực phân tán (dispersion forces) - Hiện có nhiều phương pháp để xác định tương tác DNA protein dựa kiểu tương tác chúng Ví dụ như: Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assays; DNA Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA); DNA Pull-down Assay, Microplate Capture and Detection Assay; Reporter Assays - Một phương pháp đơn giản để nhận biết tương tác DNA protein sử dụng phương pháp chạy điện di, dựa thay đổi kích thước độ tích điện phân tử DNA protein Sự thay đổi ảnh hưởng đến tốc độ di chuyển DNA tác dụng dòng điện chiều Đây phương pháp kiểm tra thay đổi tính di động DNA điện di (EMSA) Hình Mô phương pháp EMSA Nội dung thực hành Thí nghiệm chứng minh tương tác DNA protein phương pháp điện di gel agarose 1% -B1: Chuẩn bị ống eppendorf chứa: Ống Đệm TE khử trùng Ống Ống DNA đệm TE DNA + Protein (T7 RNA polymerase) - B2: Tiến hành đổ gel agarose 1%: cân gram agarose, hoà tan 100ml dung dịch TAE 1X (lưu ý cần pha loãng TAE1X từ dung dịch gốc có nồng độ 50X), gia nhiệt cách cho lò vi song, quan sát agarose tan vào vào TAE1X - B3: Tạo gel agarose: dung dịch agarose hạ nhiệt khoảng 50oC, tiến hành đổ gel, cài lược Lưu ý, đổ gel không tạo bọt khí Đợi 15 – 20 phút gel khô cứng, tháo lược để có giếng điện di - B4: Tiến hành tra mẫu: trộn 5µl mẫu ống (chứa nước cất) + 1µl loading dye; ống (chứa DNA) + 1µl loading dye; ống (chứa DNA protein) + 1µl loading dye, tra mẫu vào giếng điện di Lưu ý: tra mẫu không làm thủng, làm rách giếng điện di - B5: Chạy phản ứng điện di hiệu điện 80V, quan sát thấy vạch màu loading dye chạy 2/3 độ dài gel dừng lại - B6: tiến hành nhuộm gel với Ethidiumbromide vòng 15 phút, tráng qua nước cất sạch, tiến hành soi gel máy chụp ảnh UV - B7: đọc kết phân tích mẫu ống thí nghiệm cho vạch băng chạy xa giếng điện di Giải thích kết thí nghiệm A: tạo giếng điện di B: tạo gel C: tra mẫu E: lắp ráp điện di F: kết chạy điện di Yêu cầu: sinh viên tiến hành thí nghiệm giải thích kết thí nghiệm cách nộp báo cáo thực hành