Điều chế 3 chất đối chiếu acid ursolic, emodin, resveratrol

Tại Việt Nam, thuốc từ dược liệu đang được sử dụng rộng rãi trên thị trường và chiếm một vị trí rất quan trọng trong việc phòng và chữa bệnh của nhân dân. Việc phát triển và nâng cao chất lượng thuốc từ dược liệu là một việc làm hết sức cần thiết. Để đảm bảo được chất lượng thuốc phục vụ nhu cầu chữa bệnh của nhân dân, vấn đề tăng cường công tác quản lý chất lượng được đặt ra một cách cấp thiết. Tuy nhiên, hiện nay hầu hết các chất chuẩn dùng trong kiểm nghiệm chất lượng thuốc từ dược liệu còn phụ thuộc nguồn nhập ngoại. Đây là vấn đề đặt ra cho các nhà nghiên cứu dược liệu trong nước phải làm thế nào để có thể chiết tách và tinh chế được đủ lượng chất chuẩn cần thiết phục vụ cho công tác kiểm nghiệm thuốc. Hiện nay, trong Dược điển Việt nam IV 3 có 76 chất đối chiếu (chỉ điểm), Dược điển Trung Quốc 2005 18 cũng có qui định 271 chất chuẩn và chất đối chiếu được dùng để định tính và định lượng cho các chuyên luận về dược liệu, chủ yếu dùng cho định lượng. Viện Dược liệu có nhiệm vụ kiểm tra chất lượng một số dược liệu trên thị trường, vì vậy luôn có nhu cầu nhiều về chất đối chiếu. Trước tình hình đó, chúng tôi đề xuất chiết tách một số hoạt chất có trong nhiều dược liệu hoặc có tần suất sử dụng lớn làm chất đối chiếu trong tiêu chuẩn hóa và kiểm tra chất lượng dược liệu (có trong danh mục chất đối chiếu Dược điển Việt nam IV hoặc Dược điển Trung Quốc 2005). Ba chất gồm có: Acid ursolic từ dược liệu lá hồng (Diospyros kaki, Ebenaceae), Emodin từ Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora, Polygonaceae), Resveratrol từ vỏ quả nho (Vitis spp., Vitaceae).

Điều chế chất đối chiếu Acid ursolic, Emodin, Resveratrol ĐẶT VẤN ĐỀ Tại Việt Nam, thuốc từ dược liệu sử dụng rộng rãi thị trường chiếm vị trí quan trọng việc phòng chữa bệnh nhân dân Việc phát triển nâng cao chất lượng thuốc từ dược liệu việc làm cần thiết Để đảm bảo chất lượng thuốc phục vụ nhu cầu chữa bệnh nhân dân, vấn đề tăng cường công tác quản lý chất lượng đặt cách cấp thiết Tuy nhiên, hầu hết chất chuẩn dùng kiểm nghiệm chất lượng thuốc từ dược liệu phụ thuộc nguồn nhập ngoại Đây vấn đề đặt cho nhà nghiên cứu dược liệu nước phải làm để chiết tách tinh chế đủ lượng chất chuẩn cần thiết phục vụ cho công tác kiểm nghiệm thuốc Hiện nay, Dược điển Việt nam IV [3] có 76 chất đối chiếu (chỉ điểm), Dược điển Trung Quốc 2005 [18] có qui định 271 chất chuẩn chất đối chiếu dùng để định tính định lượng cho chuyên luận dược liệu, chủ yếu dùng cho định lượng Viện Dược liệu có nhiệm vụ kiểm tra chất lượng số dược liệu thị trường, có nhu cầu nhiều chất đối chiếu Trước tình hình đó, đề xuất chiết tách số hoạt chất có nhiều dược liệu có tần suất sử dụng lớn làm chất đối chiếu tiêu chuẩn hóa kiểm tra chất lượng dược liệu (có danh mục chất đối chiếu Dược điển Việt nam IV Dược điển Trung Quốc 2005) Ba chất gồm có: - Acid ursolic từ dược liệu hồng (Diospyros kaki, Ebenaceae), - Emodin từ Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora, Polygonaceae), - Resveratrol từ vỏ nho (Vitis spp., Vitaceae) Mục tiêu đề tài: Điều chế chất đối chiếu từ dược liệu có độ tinh khiết >90%: Acid ursolic, Emodin, Resveratrol; chất 100mg Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu quy trình chiết xuất, phân lập chất - Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập - Xây dựng liệu phổ xác định cấu trúc chất phân lập Chuyên đề 1: Phân lập acid ursolic từ hồng I Tổng quan 1.1 Đặc điểm thực vật hồng (Diospyros kaki L.f.) Cây hồng (Diospyros kaki L.f.) thuộc họ Thị (Ebenaceae) loại ăn lâu năm Cây to, mọc so le, hình trứng hay trái xoan, gốc thuôn, đầu tù nhọn, mặt màu lục sẫm, mặt nhạt có lông tơ Cụm hoa mọc kẽ lá; hoa đơn tính gốc, màu vàng nhạt; hoa đực tụ họp thành xim hoa, nhị 16, có hơn; hoa mọc đơn độc, đài có răng, bầu ô, thường có vách giả Quả mọng, hình cầu hình trứng, nhẵn, phẳng có sống dọc, mang đài tồn cong lên, chín màu vàng đỏ; hạt dẹt, màu nâu vàng nâu đen Mùa hoa: tháng 3-7, mùa quả: tháng 8-10.[1][,2] Cây có nguồn gốc nhiệt đới trồng lâu đời Việt Nam nhiều nước giới Ở nước ta hồng trồng nhiều phía Bắc từ Hà Tĩnh trở ra, phía Nam hồng trồng vùng Đà Lạt- Lâm Đồng nơi có độ cao từ 1000 - 1500 m so với mặt nước biển [2] 1.2.Thành phần hóa học hồng Lá hồng chứa flavonoid ( α-amyrin, uvaol, acid ursolic, 19 α-hydroxy ursolic acid, acid 19 α,24-dihydroxy ursolic….) [ 4],[8] 1.3 Tác dụng sinh học Tác dụng chống viêm: Tai hồng khô dạng bột tán có tác dụng chống viêm rõ Tác dụng ức chế men chuyển angiotensin: Flavonoid từ hồng có tác dụng ức chế theo cách phụ thuộc vào liều, dùng làm thuốc chữa cao huyết áp [1] 1.4 Acid ursolic Về hóa học: - Công thức phân tử: C30H48O3 ; KLPT: 456.68 g/mol; bột kết tinh màu trắng, nhiệt độ nóng chảy từ 260-262 0C - Acid ursolic phân lập từ loài Eriobotrya japonica Thunb (Tỳ bà diệp); Ligustrum lucidum Ait (Nữ trinh tử), Zyzyphus spp (vỏ táo) bán dạng hàng hoá lớn dùng để sản xuất [5] Về tác dụng sinh học:[4],[7], [8], [11] - Tác dụng chống viêm - Ức chế phát triển tế bào ung thư - Chống tăng đường huyết (đái tháo đường) - Chống tăng mỡ máu - Chống béo phì Ngoài ra, acid ursolic dùng nhiều mỹ phẩm với tác dụng bảo vệ da chống ung thư từ tia cực tím Ursolic acid độc quyền sử dụng kem đại lý dược phẩm, mỹ phẩm chế phẩm thực phẩm Ở Việt Nam: Acid ursolic có nhiều loài thực vật nhiều dược liệu bạc hà, lăng nước, chè đắng, mã đề, hạ khô thảo, hồng, râu mèo, sơn thù, táo Trong danh mục chất đối chiếu Dược điển Việt Nam IV (2009) Dược điển Trung Quốc 2005, acid ursolic có mặt [3],[18] II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, dung môi hóa chất thiết bị * Nguyên liệu dùng để nghiên cứu: Lá hồng (Diospyros kaki L.f.) *Dung môi, hoá chất: Các dung môi công nghiệp n-hexan, dicloromethan, cloroform, ethyl acetat, aceton, methanol, ethanol cất lại trước dùng * Thiết bị sử dụng: - Máy sắc ký lỏng hiệu cao phân tích Shimadzu LC10 ATvp, detector diod array SPD-M10Avp Cột RP C18 (150mm x 4,6mm ID, 5µm) - Máy đo phổ IR : 670-FTIR NICOLET- NEXUS (Viện hóa học) - Máy đo phổ khối ESI-MS: AGILENT 1100 LC-MSD (Viện Hóa học) - Máy cộng hưởng từ Bruker Avance AM500 FT-NMR (Viện Hóa học) - Cân phân tích - Máy đo điểm chảy - Máy cất quay Buchi - Tủ sấy chân không Binder 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp chiết phân tách hợp chất từ nguyên liệu thực vật a Phương pháp chiết dung môi Nguyên liệu mẫu thực vật chiết với dung môi nhiệt độ phòng b Phương pháp chiết hai pha lỏng Phần chiết tổng phân bố H 2O dung môi hữu khác nhằm làm giàu lớp chất theo độ phân cực tăng dần 2.2.2 Các phương pháp phân tích, phân tách phân lập sắc ký a Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng thực mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F 254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck) Phát chất đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm 366 nm dùng thuốc thử dung dịch H2SO4 10% phun lên mỏng, sấy khô hơ nóng từ từ bếp điện đến màu b Sắc ký cột Sắc ký cột tiến hành với chất hấp phụ silica gel pha thường cỡ hạt 0,040-0,063 mm Silica gel pha đảo ODS YMC (30-50µm, FuJisilisa Chemical Ltd.) c Phương pháp kết tinh lại Các chất phân lập tinh chế phương pháp kết tinh lại dựa khác độ tan hợp chất mục tiêu tạp chất dung môi hệ dung môi chọn 2.2.3 Phương pháp xác định độ tinh khiết nhận dạng cấu trúc Phương pháp xác định độ tinh khiết: dựa vào kết định lượng, dựa vào điểm chảy kết đo phổ NMR, IR, MS Nhận dạng cấu trúc phổ NMR, MS, UV, IR 2.2.4 Phương pháp định lượng HPLC Acid ursolic Chuẩn bị mẫu thử : Cân xác lượng chế phẩm acid ursolic, khoảng 5mg vào bình định mức 10ml Thêm methanol lắc siêu âm 15 phút Để nguội thêm methanol đến vạch Lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 0,45 µm Chương trình sắc ký: Cột: ODS-hypersil C18 Pha động: ACN – đệm phosphat 0,05M (70-30), đẳng dòng Tốc độ dòng: 0,8 ml/ phút Thể tích tiêm: 10 µl Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng Detector: UV 210 nm Tiến hành: Tiêm 10µl mẫu ghi sắc ký đồ Độ tinh acid ursolic tỉ lệ với phần trăm diện tích pic sắc ký đồ III THỰC NGHIỆM 3.1 ĐIỀU CHẾ PHẦN CHIẾT Lá hồng (2kg) vò nhỏ sấy nhiệt độ 50ºC Sau ngâm chiết với metanol (MeOH) nhiệt độ phòng lần, lần lít Sau lọc tách nguyên liệu rắn dịch lọc MeOH gộp lại cất loại MeOH áp suất giảm cặn chiết tổng MeOH Cặn chiết MeOH hòa nước cất sau chiết với dicloromethan Dịch chiết dicloromethan gom lại cô loại dung môi áp suất giảm thu cặn chiết đicloromethan (80g) dùng để điều chế acid ursolic 3.2 PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 3.2.1 Phân tích sắc ký xác định điều kiện tiến hành sắc ký cột Phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC) thực mỏng tráng sẵn silica gel Merck pha thường pha đảo có chiều dày 0,2 mm nhôm Thuốc thử màu dung dịch vanilin/H2SO4 đặc 1% Phân tích xác định acid ursolic phần chiết dicloromethan từ hồng Hệ dung môi phù hợp để triển khai sắc ký lớp mỏng phần chiết dicloromethan methanol-nước = 10:1, sử dụng mỏng tráng sẵn silica gel pha đảo 3.2.2 Phân lập hợp chất Các chất phân lập phương pháp sắc ký cột thường chất hấp phụ silica gel Hệ dung môi rửa giải gradient hỗn hợp dung môi methanol-nước tỷ lệ 20/1, 10/1, 5/1, 1/1 (mỗi tỷ lệ lít) Các dung dịch chạy cột thu vào bình hứng thu phân đoạn I, II, III IV Từ phân đoạn III, tiến hành sắc ký cột silica gel pha đảo với tỷ lệ methanol – nước 9/1, 5/1, 1/1 ba phân đoạn III-1, III-2, III-3 tương ứng Phân đoạn III-2 phân tách tiếp cột silicagel pha đảo với tỷ lệ methanol – nước 4/1, hứng dung dịch rửa giải vào ống nghiệm Kiểm tra ống nghiệm sắc ký lớp mỏng thấy ống từ 3-15 có Rf Dồn ống đến 15, cho bay dung môi thu chất kết tinh có màu trắng với khối lượng 125 mg Sơ đồ quy trình chiết xuất phân lập acid ursolic thể qua sơ đồ Lá hồng (2 kg) + MeOH (7 lít x lần) Dịch chiết MeOH -MeOH Cao MeOH (170g) + 1,5 lít nước Dịch nước + Diclorometan (2 lít x lần) Cắn diclorometan (80g) Dịch chiết H2O Sắc ký cột pha đảo, methanol-nước 20/1 Phân đoạn I 10/1 1/1 5/1 Phân đoạn II Phân đoạn IV Phân đoạn III (8,5g) Sắc ký cột pha đảo, methanol-nước 9/1 Phân đoạn III-1 5/1 Phân đoạn III-2 1/1 Phân đoạn III-3 Sắc ký cột pha đảo, methanol-nước (4:1) Chất AU 125mg Sơ đồ1 Quy trình chiết xuất, phân lập acid ursolic III XÂY DỰNG BỘ CƠ SỞ DỮ LIỆU, XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT VÀ THẨM ĐỊNH CÔNG THỨC CỦA ACID URSOLIC Nhiệt độ nóng chảy Acid ursolic tinh chế làm khô bình hút ẩm có silica gel 24 h, nghiền mịn đem xác định nhiệt độ nóng chảy Kết điểm chảy đo là: 262266 0C Sắc ký đồ sắc ký lỏng hiệu cao Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với điều kiện sắc ký ghi mục 2.2.4 Kết định lượng acid ursolic sản phẩm tinh chế cho thấy acid ursolic đạt độ tinh 90% thể hình : 1: 210 nm, nm LH Ursolic acid C1 (0.53mg.ml) -20092011 - 10uL - 002.dat Area 80 80 60 60 40 40 118454 20 20 173980 510270 mAU 100 mAU 100 3962395 0 10 15 20 Minutes 25 30 35 40 Spectrum at time 19.20 19.20 Lambda max : 195 250 289 306 295 Lambda : 248 296 287 283 299 200 220 240 260 280 300 320 340 360 nm Hình 1,2 Sắc ký đồ HPLC phổ UV acid ursolic Phổ UV (trong MeOH) λmax: 195, 250, 289, 295, 306 nm Phổ hồng ngoại (viên nén KBr): có vân hấp thụ đặc trưng nhóm chức phù hợp với cấu trúc hóa học acid ursolic, νmax (cm-1): 3424 (nhóm OH); 2926 (C-H nhóm CH3); 1690 (nhóm C=O) Phổ ESI-MS: m/z 455 [M-H]+ (negative) tương ứng với khối lượng phân tử M = 456, hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử acid ursolic C30H48O3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Trên phổ 1H-NMR: Cho tín hiệu proton olefin δH 5,14 (1H, m, H-12), tín hiệu nhóm methyl (-CH3) đính vào vòng có độ dịch chuyển từ 1,01- 0,68 ppm, có nhóm cho tín hiệu đơn nhóm cho tín hiệu kép Trên phổ xuất tín hiệu δH 3,07 (1H, dd, J=4,5;11Hz) gần liên kết OH Ngoài ra, có 18 proton có độ dịch chuyển từ 1,84-1,18 ppm (18H, m) Trên phổ 13C-NMR cho biết có tổng cộng 30 tín hiệu cacbon Có tín hiệu có δC 181,4 ppm carbon nhóm carboxylic (-COOH), tín hiệu CH olefin δC 139,19 ppm (C-13) Có cặp tín hiệu trùng δC 24,08 ppm (C-11, C-27) Carbon nhóm methyl (-CH3) dịch chuyển vùng trường thấp δC từ 21,5-15,9 ppm Các liệu phổ 1H NMR, 13C NMR hoàn toàn phù hợp với số liệu công bố acid ursolic Kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo [11] cho phép khẳng định hợp chất phân lập acid ursolic Bảng 1: Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR chất AU acid ursolic Chất AU Acid ursolic [11]\ Vị trí δH (Giá trị J MeOD&CDCl3 Hz) δC δH (Giá trị J DMSO-d6 Hz) δC 2H, m 2H, m 39,5 27,6 1,56 (2H, m) 1,43 (2H, m) 38,2 26,8 3,07 (1H, dd, 4,5;11 Hz) - 79,4 39,7 3,01(1H, dd, 5,2; 9,5 Hz) - 76,8 38,4 0,65 (1H, d, 11 Hz) 2H, m 56,4 19,2 54,8 17,9 2H, m 31,5 0,66 (1H, s) 1,47 (1H, m, H-6a) 1,29 (1H, m, H6b) 1,27 (2H, m) 1H, m 40,4 48,5 1,58 (1H, s) 39,1 47,0 10 11 1,84 (2H, m) 37,7 24,1 1,92 (2H, dd, 13,7; 3,5 Hz) 36,5 23,8 12 13 5,14 (1H, t) - 126,5 139,2 5,14 (1H, dd, 13,7;3,5Hz) - 124,5 138,2 14 15 2H, m 42,9 33,9 1,01(2H, m) 41,6 32,7 16 17 2H, m - 25,1 48,5 1,53 (2H, m) - 22,8 46,8 18 19 2,11 (1H, d; 11,5Hz) 1H, m 53,9 39,9 2,12 (1H, d; 11,1Hz) 1,31 (1H, m) 52,4 38,4 20 21 1H, m 2H, m 40,1 28,6 1,52 (1H, m) 1,29 (2H, m) 38,5 27,5 22 23(CH3) 2H, m 0,87 (3H, s) 37,8 28,9 1,54 (2H, m) 0,90 (3H, s) 36,3 28,2 24(CH3) 25(CH3) 0,68 (3H, s) 0,86 (3H, s) 17,5 16,2 0,68 (3H, s) 0,84 (3H, s) 16,9 16,0 26(CH3) 27(CH3) 0,75 (3H, s) 1,01 (3H, s) 15,9 24,1 0,69 (3H, s) 1,05 (3H, s) 15,2 23,2 28 (COOH) 29 (CH3) 0,79 (3H, d, 6,5Hz) 181,4 17,6 0,82 (3H, d, 5,9 Hz) 178,2 16,9 30 (CH3) 0,89 (3H, d, 5,5Hz) 21,5 0,92 (3H, d, 6,8 Hz) 21,1 30,8 Hình 3: Cấu trúc hóa học acid ursolic V KẾT LUẬN - Đã xây dựng quy trình chiết xuất phân lập acid ursolic từ củ hà thủ ô - Đã điều chế acid ursolic (125mg) có độ tinh khiết > 90% - Đã có liệu phổ acid ursolic Chuyên đề 2: Phân lập emodin từ Hà thủ ô I Tổng quan 1 Đặc điểm thực vật Hà thủ ô (Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (Thunb.) thuộc họ Rau răm (Polygonaceae) Dây leo thân quấn, sống lâu năm Thân mềm nhẵn, mọc xoắn vào Rễ phình thành củ, màu nâu đỏ, củ nguyên có hình giống khoai lang Lá mọc so le, hình mũi tên, gốc hình timm, đầu thuôn nhọn, dài 5-8cm, rộng 3-4cm, 3-5 gân xuất phát từ gốc lá, hai mặt nhẵn, mặt sẫm bóng; cuống dài khoảng 2cm, phủ lông tơ, bẹ chìa mỏng, ngắn, có lông dài Cụm hoa mọc kẽ đầu cành thành chùy phân nhánh, dài lá; bắc ngắn; hoa nhỏ nhiều, củ con, với đoạn rễ sót lại khai thác, có khả mọc thành [1],[2] Trên giới, hà thủ ô đỏ có Trung Quốc, Bắc Lào, Nhật Bản, Ấn Độ Ở Việt Nam, hà thủ ô đỏ có số tỉnh vùng núi cao (trên 1000m) phía bắc Cây mọc nhiều Hà Giang, Lai Châu, Lào Cai, Sơn La Các tỉnh khác gặp Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Lạng Sơn, Cao Bằng, Yên Bái…[1] Thành phần hóa học [1],[2] + EtOAc (2 lít x lần) Dịch chiết H2O Dịch chiết EtOAc Cắn EtOAc (50g) Sắc ký cột Silica gel n-hexan-ethyl acetat 20/1 Phân đoạn I 15/1 10/1 Phân đoạn II Phân đoạn III 9/1 Phân đoạn IV-1 4/1 Phân đoạn 2/1 Phân đoạn V IV (5g) Sắc ký cột Silica gel n-hexan-ethyl acetat 4/1 Phân đoạn IV-2 0/1 1/1 Phân đoạn VI 2/1 Phân đoạn IV-3 (Chất Phân đoạn VII 1/1 Phân đoạn IV-4 ED-102mg) Sơ đồ Quy trình chiết xuất, phân lập Emodin IV XÂY DỰNG BỘ CƠ SỞ DỮ LIỆU, XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT VÀ THẨM ĐỊNH CÔNG THỨC CỦA EMODIN Nhiệt độ nóng chảy Emodin tinh chế làm khô bình hút ẩm có silica gel 24 h, nghiền mịn đem xác định nhiệt độ nóng chảy Kết điểm chảy đo là: 253256 oC Sắc ký đồ sắc ký lỏng hiệu cao Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với điều kiện sắc ký ghi mục 2.2.4 Kết định lượng emodin sản phẩm tinh chế cho thấy emodin đạt độ tinh 90% thể hình: Spectrum at time 6.51 6.51 Lambda max : 222 192 288 266 253 Lambda : 206 273 258 236 329 200 220 240 260 280 300 320 340 360 nm Hình 4,5 : Sắc ký đồ HPLC phổ UV emodin Phổ UV (trong MeOH) λmax: 192, 222, 253, 266, 288 nm phù hợp với liệu phổ emodin công bố tài liệu [14] Phổ hồng ngoại (viên nén KBr): có vân hấp thụ đặc trưng nhóm chức phù hợp với cấu trúc hóa học Emodin, νmax (cm-1): 3368 (nhóm OH); 2923 (C-H nhóm CH3); 1629 (nhóm C=O); 1591, 1558, 1479, 1459 (liên kết đôi C=C) Phổ ESI-MS: m/z 269,77 [M-H]+ (negative) tương ứng với khối lượng phân tử M = 270, hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử Emodin C15H10O5 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Trên phổ 1H-NMR: Cho biết có bốn proton gắn vào vòng thơm, proton xuất dạng pic kép có độ dịch chuyển 7,51 (1H, d, J=1 Hz); 7,15 (1H, d, J=2,5Hz); 7,00 (1H, d, J=1Hz); 6,55 (1H, d, J=2,5Hz) Ngoài có tín hiệu nhóm –CH3 gắn vào vòng thơm 2,38 ppm Số liệu phổ 1H-NMR khẳng định có vòng thơm cấu trúc Trên phổ 13C-NMR cho biết có tổng cộng 15 tín hiệu cacbon Có 14 tín hiệu có độ dịch chuyển từ 190,35 đến 108,43 nằm vùng vòng thơm hay liên kết đôi C=C, có cặp tín hiệu trùng δC 108,43 (C-10,C-12) Có tín hiệu nhóm methyl (-CH3) gắn vào vòng thơm 21,88 ppm Kết hợp với phổ DEPT nhận thấy hợp chất phân lập có 10 carbon bậc 4, nhóm CH vòng thơm, nhóm -CH3 gắn vào vòng thơm Các liệu phổ 1H NMR, 13C NMR hoàn toàn phù hợp với số liệu công bố emodin Kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo [13] cho phép khẳng định hợp chất phân lập Emodin Bảng : Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR chất HTO.E Emodin Chất HTO.E Vị trí δH (Giá trị J MeOD&CDCl3 Hz) Emodin [13] δC 7,00 (1H, d, Hz) 164,94 121,02 7,51 (1H, d, Hz) 148,04 124,31 δH (Giá trị J DMSO-d6 Hz) δC 7,15 (1H, d, 1,2 Hz) 164,1 120,2 7,48 (1H, d, 1,2 Hz) 148,0 123,9 133,10 182,58 132,6 181,0 7,15 (1H, d, 2,5 Hz) 135,23 109,36 7,11 (1H, d, 2,0 Hz) 134,9 108,7 6,55 (1H, d, 2,5 Hz) 161,99 108,43 6,59 (1H, d, 2,0 Hz) 161,1 107,7 10 11 12 165,34 108,43 165,2 108,5 13 14 190,35 113,60 189,4 113,1 CH3 2,38 (3H, s) 21,88 2,38 (3H, s) 21,4 Hình : Cấu trúc hóa học Emodin V KẾT LUẬN - Đã xây dựng quy trình chiết xuất phân lập emodin từ củ hà thủ ô - Đã điều chế emodin (102 mg) có độ tinh khiết > 90% (98,38% tính theo phần trăm diện tích pic) - Đã có phổ emodin Chuyên đề 3: Phân lập resveratrol từ vỏ nho I Tổng quan 1.1 Đặc điểm thực vật nho (Vitis spp.) [1],[2] Cây nho (Vitis spp.) thuộc họ Nho (Vitaceae) Dạng leo, sống lâu năm, dài hàng mét Thân cành mảnh, có vỏ màu lục sau chuyển sang màu nâu, thương bong mảng nhỏ Lá mọc so le, hình chân vịt, chia 5-7 thùy nông, gốc hình tim, mép khía không đều, hai mặt gần màu; cuống dài; kèm sớm rụng; tua đối diện với lá, chia nhánh Cụm hoa mọc thành chùm xim hai ngả; hoa đều, màu lục nhạt; cụm hoa tạp tính khác gốc, có gốc mang hoa đực hoa lưỡng tính, số khác mang hoa hoa lưỡng tính; đài hình chén, có nhỏ; tràng cánh rời gốc, liền đầu; nhị 5, xếp trước cánh hoa; bầu thượng, ô.Quả mọng, hình trứng hình cầu, vỏ mỏng, chứa hạt hình lê Mùa hoa quả: tháng 5-7 Cây đa dạng, chọn lọc lai tạo để có nhiều giống tốt Cây nho có nguồn gốc hoang dại khu vực từ Đông Bắc Afghanistan đến biên giới phía nam giáp biển Đen Cây trồng cách khoảng 4000-5000 năm Về sau phát triển rộng vùng Địa Trung Hải, Tây Âu, Ấn Độ, Trung Quốc Nhật Bản Tại Việt Nam, trồng rải rác địa phương, từ vùng đồng ven biển có khí hậu nhiệt đới điển hình (ở miền Nam) đến vùng có khí hậu nhiệt đới núi cao 1500m (ở Sapa-Lài Cai, Đồng Văn, Phó Bảng – Hà Giang) 1.2 Thành phần hóa học [1] * Vitamin: - Quả nho chứa nhiều loại vitamin: vitamin B, caroten, riboflavin, niacin vitamin C - Lá chứa vitamin B, niacin, biotin, tocopherol, nhiều vitamin C carotenoid quả, cao vào lúc Lá non chứa nhiều vitamin C già * Enzym: - Quả chứa invertase, nhiều chưa chín, 75% enzym toàn phần có chín dạng hòa tan Trong trình phát triển, hàm lượng đường tăng lên - Lá chứa pectin esterase chất ức chế pectin esterase, tanin ngưng tụ - Quả chứa catalase, acid ascorbic, oxidase, peroxidase polyphenol oxidase * Carbohydrat: đa phần đường glucose fructose * Các hợp chất nitơ: Quả chứa nhiều acis amin, alanin, acid glutamic, prolin, serin… Hạt chứa arginin, leucin, cystin, valin * Acid hữu cơ: Quả có nhiều acid tartric acid malic, acid citric * Hợp chất phenol: Các hợp chất phenol gồm chủ yếu sắc tố tanin - Các sắc tố mono glucosid delphinidin, malvidin, anthocyanidin - Hạt có chứa catechin, epicatechin epicatechin galat - Lá, rễ chứa catechin Vỏ chứa quercitin, kaemferol, myricetin, resveratrol… - Thân có tương đối nhiều hợp chất phenol * Sáp: Các alcol, acid tự do, ester aldehyd * Lipid: Hạt chứa dầu béo, lipid dạng tự dạng kết hợp 1.3 Tác dụng sinh học - Các flavonoid chứa nho có tác dụng làm giảm tính thấm mao mạch điều kiện viêm mạch máu, chống viêm, làm giảm phù caragenin chân chuột cống trắng, làm giảm mức độ tăng tính thấm da gây cloroform thỏ Tác dụng mạnh gấp lần so với rutin [1] - Lá nho đỏ dạng bào chế khác nhau, có tác dụng chống siêu vi khuẩn bệnh ecpet HSV-1 in vitro.[1] - Tác dụng chống oxi hóa thay đổi chức miễn dịch flavonoid chứa thịt vỏ nho [5] 1.4 Resveratrol Về hóa học: - Công thức phân tử: C14H12O3, Khối lượng phân tử: 228,24 g mol−1 Dạng bột kết tinh màu trắng Nhiệt độ nóng chảy: 261-263 oC [22] - Resveratrol có Polygonum multiflorum Thunb (Hà thủ ô đỏ), đặc biệt có nhiều Vitis spp (vỏ nho) [1],[2],[22] Về tác dụng sinh học: [22] - Tăng cường miễn dịch - Chống lão hóa - Chống viêm - Chống ung thư - Chống giảm đường huyết - Tác dụng tốt tim mạch II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, dung môi hóa chất thiết bị * Nguyên liệu: Vỏ nho *Dung môi, hoá chất: Các dung môi công nghiệp n-hexan, dicloromethan, cloroform, ethyl acetat, aceton, methanol, ethanol cất lại trước dùng * Thiết bị sử dụng:phần 2.1 chuyên đề 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp chiết phân tách hợp chất từ nguyên liệu thực vật (tương tự chuyên đề 1) 2.2.2 Các phương pháp phân tích, phân tách phân lập sắc ký (tương tự chuyên đề 1) 2.2.3 Phương pháp xác định độ tinh khiết nhận dạng cấu trúc Phương pháp xác định độ tinh khiết: dựa vào kết định lượng, dựa vào điểm chảy kết đo phổ NMR, IR, MS Nhận dạng cấu trúc phổ NMR, MS, UV, IR 2.2.4 Phương pháp định lượng HPLC Resveratrol Chuẩn bị mẫu thử : Cân xác lượng chế phẩm resveratrol, khoảng 5mg vào bình định mức 10ml Thêm methanol lắc siêu âm 15 phút Để nguội thêm methanol đến vạch Lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 0,45 µm Chương trình sắc ký: Cột: ODS-hypersil C18 Pha động: ACN – đệm phosphat 0,05M (40-60), đẳng dòng Tốc độ dòng: 0,5 ml/ phút Thể tích tiêm: 10 µl Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng Detector: UV 310 nm Tiến hành: Tiêm 10µl mẫu ghi sắc ký đồ Độ tinh resveratrol tỉ lệ với phần trăm diện tích pic sắc ký đồ III THỰC NGHIỆM 3.1 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT 3.1.1 Điều chế cặn chiết vỏ nho Vỏ nho (1,5kg) sấy nhiệt độ 50 ºC Sau ngâm chiết với metanol (MeOH) nhiệt độ phòng lần, lần lít Sau lọc tách nguyên liệu rắn dịch lọc MeOH gộp lại cất loại MeOH áp suất giảm cặn chiết tổng MeOH Cặn chiết MeOH hòa nước cất sau chiết với dicloromethan Dịch chiết dicloromethan gom lại cô loại dung môi áp suất giảm thu cặn chiết đicloromethan (70g) dùng để điều chế resveratrol PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 3.2.1 Phân tích sắc ký xác định điều kiện tiến hành sắc ký cột Phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC) thực mỏng tráng sẵn silica gel Merck pha thường pha đảo có chiều dày 0,2 mm nhôm Thuốc thử màu dung dịch vanilin/H2SO4 đặc 1% Phân tích xác định acid ursolic phần chiết ethyl acetat từ củ hà thủ ô Hệ dung môi phù hợp để triển khai sắc ký lớp mỏng phần chiết đicloromethan methanol-nước=2:1, sử dụng mỏng tráng sẵn silica gel pha đảo 3.2.3 Phân lập hợp chất Các chất phân lập phương pháp sắc ký cột thường chất hấp phụ silica gel Hệ dung môi rửa giải gradient hỗn hợp dung môi methanol-nước tỷ lệ 9/1, 4/1, 2/1, 1/1 (mỗi tỷ lệ lít) Các dung dịch chạy cột thu vào bình hứng thu phân đoạn I, II, III IV Từ phân đoạn III, tiến hành sắc ký cột silica gel pha đảo với tỷ lệ methanol – nước 3/1, 2/1, 1/1 ba phân đoạn III-1, III-2, III-3 tương ứng Phân đoạn III-2 phân tách tiếp cột silicagel pha đảo với tỷ lệ methanol – nước 1/1, hứng dung dịch rửa giải vào ống nghiệm Kiểm tra ống nghiệm sắc ký lớp mỏng thấy ống từ 9-35 có Rf Dồn ống đến 35, cho bay dung môi thu chất kết tinh có màu trắng với khối lượng 190 mg Sơ đồ quy trình chiết xuất phân lập resveratrol thể qua sơ đồ Vỏ nho (1,5kg) + MeOH (5 lít x lần) Dịch chiết MeOH -MeOH Cao MeOH (140g) + lít nước Dịch nước + Diclorometan (1 lít x lần) Cắn diclorometan (70g) Dịch chiết H2O Sắc ký cột pha đảo, methanol-nước 9/1 Phân đoạn I 4/1 1/1 2/1 Phân đoạn IV III (6,13g) Sắc ký cột pha đảo, methanol-nước Phân đoạn II Phân đoạn 3/1 Phân đoạn III-1 2/1 Phân đoạn III-2 1/1 Phân đoạn III-3 (Chất RE 190 mg) Sơ đồ Sơ đồ quy trình chiết xuất, phân lập resveratrol IV XÂY DỰNG BỘ CƠ SỞ DỮ LIỆU, XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT VÀ THẨM ĐỊNH CÔNG THỨC CỦA RESVERATROL Nhiệt độ nóng chảy Resveratrol tinh chế làm khô bình hút ẩm có silica gel 24 h, nghiền mịn đem xác định nhiệt độ nóng chảy Kết điểm chảy đo là: 263266 oC Sắc ký đồ sắc ký lỏng hiệu cao Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với điều kiện sắc ký ghi mục 2.2.4 Kết định lượng resveratrol sản phẩm tinh chế cho thấy resveratrol đạt độ tinh 90% thể hình: Spectrum at time 5.40 5.40 6,4 Lambda max : 305 317 217 192 Lambda : 316 202 255 200 225 250 275 300 325 350 nm Hình 7,8 : Sắc ký đồ HPLC phổ UV sản phẩm resveratrol Phổ UV (trong MeOH) λmax: 192, 217, 305, 317 nm phù hợp với liệu phổ resveratrol công bố tài liệu [6],[14] Phổ hồng ngoại (viên nén KBr): có vân hấp thụ đặc trưng nhóm chức phù hợp với cấu trúc hóa học resveratrol, νmax (cm-1): 3292 (nhóm OH); 3019 (=C-H liên kết đôi vòng); 1606, 1587, 1512, 1463 (liên kết đôi C=C vòng benzen), phù hợp với liệu phổ resveratrol công bố tài liệu [10] Phổ ESI-MS: m/z 227 [M-H]+ (negative) tương ứng với khối lượng phân tử M = 228, hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử resveratrol C14H12O3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Trên phổ 1H-NMR: Cho biết có bảy proton gắn vào vòng thơm Đó tín hiệu proton hai vòng thơm δH 7,37 (2H, d, J= 8,5Hz, H-2’,H-6’), 6,78 (2H, d, J=7,0Hz, H-3’, H-5’), 6,46 (2H, d, J= 2Hz H-2, H-6) Tín hiệu proton olefin δH 6,98 (1H, d, J=16,5Hz, H-b), 6,82 (1H, d, J=16,5Hz, H-a) Trên phổ 13C-NMR cho biết có tổng cộng 14 tín hiệu cacbon, có độ dịch chuyển từ 159,65 đến 102,66 ppm nằm vùng vòng thơm hay liên kết đôi C=C, có cặp tín hiệu trùng δC 159,65 (C-3,C-5); δC 128,8 (C2’,C-6’); δC 116,48 (C-3’,C-5’); δC 105,78 (C-2,C-6) Như vậy, phổ 13C-NMR khẳng định hợp chất có vòng thơm phân tử Các liệu phổ 1H NMR, 13C NMR hoàn toàn phù hợp với số liệu công bố Resveratrol Kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo [5] cho phép khẳng định hợp chất phân lập trans-Resveratrol Bảng : Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR chất ViII2 Resveratrol Chất ViII2 Vị trí Resveratrol [5] δH (Giá trị J MeOD, Hz) - δC 141,3 δH (Giá trị J CD3COCD3, Hz) - δC 140,6 6,46 (1H, d, Hz) - 105,8 159,7 6,52 (1H) - 105,5 159,3 6,17 (1H, t) - 102,7 159,7 6,24 (1H, t, 2,1 Hz) 102,5 159,3 1’ 6,46 (1H, d, Hz) - 105,8 130,4 6,52 (1H) - 105,5 129,8 2’ 3’ 7,37 (1H, d, 8,5 Hz) 6,78 (1H, d) 128,8 116,5 7,39 (1H, d, 8,1 Hz) 6,82(1H, d, 8,1 Hz) 128,5 116,2 4’ 5’ 6,78 (1H, d) 158,4 116,5 6,82(1H, d, 8,1 Hz) 158,1 116,2 6’ a 7,37 (1H, d, 8,5 Hz) 6,82(1H, d, 16,5 Hz) 128,8 127,0 7,39 (1H, d, 8,1 Hz) 6,87(1H,d, Jtrans=16,2 Hz) 128,5 126,6 b 6,98 (1H, d, 16,5 Hz) 129,4 6,98(1H,d, Jtrans=16,2 Hz) 128,9 Hình : Cấu trúc hóa học trans-resveratrol V KẾT LUẬN - Đã xây dựng quy trình chiết xuất phân lập trans-resveratrol từ vỏ nho - Đã điều chế trans-resveratrol (190mg) có độ tinh khiết > 90% (99,84% tính theo phần trăm diện tích pic) - Đã có phổ liệu resveratrol TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Huy Bích cộng (2003), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập I, II NXB KHKT, Hà Nội Đỗ Tất Lợi (2006), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội Dược điển Việt Nam IV (2009), NXB Y học, Hà Nội Chen G, Lu H, Wang C, Yamashita K, Manabe M, Xu S, Kodama H (2002), “Effect of five triterpenoid compounds isolated from leaves of Diospyros kaki on stimulus-induced superoxide generation and tyrosyl phosphorylation in human polymorphonuclear leukocytes”, Clinica Chimica Acta, 320 (1–2): 11–16 Chu X, Sun A, Liu R (2005), “Preparative isolation and purification of five compounds from the Chinese medicinal herb Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc by high-speed counter-current chromatography” Journal of Chromatography A, 1097: 33–39 Craig Z and Anna P (2011), “The photostability and photostabilizationof transresveratrol”, Cosmetics & Toiletries magazine Vol 126, No Edgardo G, Saer D, Stefania N, Massimo D (2011), “Selected primary and secondary metabolites in fresh persimmon (Diospyros kaki Thunb.): A review of analytical methods and current knowledge of fruitcomposition and health benefits”, Food Research International 44: 1752–1767 Fan J, He C (2006), “Simultaneous quantification of three major bioactive triterpene acids in the leaves of Diospyros kaki by high-performance liquid chromatography method”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 41: 950–956 Feng Y et al (2010), “Emodin, a Natural Product, Selectively Inhibits 11βHydroxysteroid Dehydrogenase Type and Ameliorates Metabolic Disorder in Diet-Induced Obese Mice", British Journal of Pharmacology 161 (1): 113–126 10 Ferenc B et al (2007), “Vibrational spectroscopy of resveratrol”, Spectrochimica Acta Part A 68: 669–679 11 Goretti S et al (2008), “Variation of ursolic acid content in eight ocimum species from Northeastern Brazil”, Molecules 13, 2482-2487 12 Gu J, Hasuo W, Takeya H, Akasu M (2005), “Effects of emodin on synaptic transmission in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons in vitro”, Neuropharmacology 49 (1): 103–111 13 Guo S , Feng B, Zhu R, Ma J and Wang W (2011), “Preparative isolation of three anthraquinones from Rumex japonicus by high-speed counter-current chromatography”, Molecules, 16, 1201-1210 14 Koyama J, Takeuchi A, Morita I, Nishino Y, Shimizu M, Inoue M, Kobayashi N (2009), “Characterization of emodin metabolites in Raji cells by LC–APCIMS/MS”, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 17:7493–7499 15 Lee BH, Huang YY, Duh PD, Wu SC (2012), “Hepatoprotection of emodin and Polygonum multiflorum against CCl(4)-induced liver injury”, Pharm Biol 50(3): 351-9 16 Lin S et al (2011), “Antiproliferative and antimetastatic effects of emodin on human pancreatic cancer”, Oncology Reports 26 (1): 81–89 17 Mukherjee S, Das SK, Vasudevan DM (2012), “Dietary grapes (Vitis vinifera) feeding attenuates ethanol-induced oxidative stress in blood and modulates immune functions in mice”, Indian J Biochem Biophys 49(5):379-85 18 Pharmacopoeia of The People’s Republic of China (2010) 19 Sun Y et al (2008), “Chemosensitization by emodin, a plant-derived anti-cancer agent: mechanism of action”, Cancer Biology & Therapy (3): 476–478 20 Yamaguchi H et al (2008), “Isolated of acid ursolic from apple peels and its specific efficacy as potent antitumor agent”, Journal of health Science, 54(6): 654- 660 21 http://en.wikipedia.org/wiki/Emodin 22 http://en.wikipedia.org/wiki/Resveratrol [...]... MeOD&CDCl3 Hz) Emodin [ 13] δC 7,00 (1H, d, 1 Hz) 164,94 121,02 7,51 (1H, d, 1 Hz) 148,04 124 ,31 δH (Giá trị J trong DMSO-d6 Hz) δC 7,15 (1H, d, 1,2 Hz) 164,1 120,2 7,48 (1H, d, 1,2 Hz) 148,0 1 23, 9 5 6 133 ,10 182,58 132 ,6 181,0 7 8 7,15 (1H, d, 2,5 Hz) 135 , 23 109 ,36 7,11 (1H, d, 2,0 Hz) 134 ,9 108,7 6,55 (1H, d, 2,5 Hz) 161,99 108, 43 6,59 (1H, d, 2,0 Hz) 161,1 107,7 9 10 11 12 165 ,34 108, 43 165,2 108,5 13 14... 165 ,34 108, 43 165,2 108,5 13 14 190 ,35 1 13, 60 189,4 1 13, 1 CH3 2 ,38 (3H, s) 21,88 2 ,38 (3H, s) 21,4 Hình 6 : Cấu trúc hóa học của Emodin V KẾT LUẬN - Đã xây dựng được quy trình chiết xuất và phân lập emodin từ củ hà thủ ô - Đã điều chế emodin (102 mg) có độ tinh khiết > 90% (98 ,38 % tính theo phần trăm diện tích pic) - Đã có được bộ phổ của emodin Chuyên đề 3: Phân lập resveratrol từ vỏ quả nho I Tổng... quả định lượng resveratrol trong sản phẩm tinh chế cho thấy resveratrol đạt độ tinh sạch trên 90% được thể hiện trong hình: Spectrum at time 5.40 min 5.40 min 6,4 min Lambda max : 30 5 31 7 217 192 Lambda min : 31 6 202 255 200 225 250 275 30 0 32 5 35 0 nm Hình 7,8 : Sắc ký đồ HPLC và phổ UV của sản phẩm resveratrol Phổ UV (trong MeOH) λmax: 192, 217, 30 5, 31 7 nm phù hợp với dữ liệu phổ của resveratrol được... crysophanol, emodin, rhein, 1,1% protid, 42,2% tinh bột, 3, 1% lipid, 4,5% chất vô cơ, 26,4% chất tan trong nước… Thành phần hóa học của hà thủ ô đỏ thay đổi theo quá trình chế biến Theo y học cổ truyền, hà thủ ô đỏ sống chứa 7,68% tanin, 0,259% dẫn chất antraquinon tự do, 0,805% dẫn chất antraquinon toàn phần Sau khi chế biến, dược liệu chứa 3, 82% tanin, 0,1 13% dầu chất antraquinon tự do, 0,25% dẫn chất antraquinon... 116,48 (C -3 ,C-5’); δC 105,78 (C-2,C-6) Như vậy, phổ 13C-NMR khẳng định hợp chất này có vòng thơm trong phân tử Các dữ liệu phổ 1H NMR, 13C NMR hoàn toàn phù hợp với các số liệu đã được công bố của Resveratrol Kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo [5] cho phép khẳng định hợp chất được phân lập chính là trans -Resveratrol Bảng 3 : Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất ViII2 và Resveratrol Chất ViII2... năng cao với điều kiện sắc ký đã ghi trong mục 2.2.4 Kết quả định lượng emodin trong sản phẩm tinh chế cho thấy emodin đạt độ tinh sạch trên 90% được thể hiện trong hình: Spectrum at time 6.51 min 6.51 min Lambda max : 222 192 288 266 2 53 Lambda min : 206 2 73 258 236 32 9 200 220 240 260 280 30 0 32 0 34 0 36 0 nm Hình 4,5 : Sắc ký đồ HPLC và phổ UV của emodin Phổ UV (trong MeOH) λmax: 192, 222, 2 53, 266, 288... Resveratrol Chất ViII2 Vị trí Resveratrol [5] 1 δH (Giá trị J trong MeOD, Hz) - δC 141 ,3 δH (Giá trị J trong CD3COCD3, Hz) - δC 140,6 2 3 6,46 (1H, d, 2 Hz) - 105,8 159,7 6,52 (1H) - 105,5 159 ,3 4 5 6,17 (1H, t) - 102,7 159,7 6,24 (1H, t, 2,1 Hz) 102,5 159 ,3 6 1’ 6,46 (1H, d, 2 Hz) - 105,8 130 ,4 6,52 (1H) - 105,5 129,8 2’ 3 7 ,37 (1H, d, 8,5 Hz) 6,78 (1H, d) 128,8 116,5 7 ,39 (1H, d, 8,1 Hz) 6,82(1H,... một chất ức chế pectin esterase, đó là một tanin ngưng tụ - Quả và lá chứa catalase, acid ascorbic, oxidase, peroxidase và polyphenol oxidase * Carbohydrat: đa phần là đường glucose và fructose * Các hợp chất nitơ: Quả chứa nhiều acis amin, alanin, acid glutamic, prolin, serin… Hạt chứa arginin, leucin, cystin, valin * Acid hữu cơ: Quả có nhiều acid tartric và acid malic, ít acid citric * Hợp chất. .. nhận thấy hợp chất được phân lập có 10 carbon bậc 4, 4 nhóm CH trong vòng thơm, 1 nhóm -CH3 gắn vào vòng thơm Các dữ liệu phổ 1H NMR, 13C NMR hoàn toàn phù hợp với các số liệu đã được công bố của emodin Kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo [ 13] cho phép khẳng định hợp chất được phân lập chính là Emodin Bảng 2 : Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất HTO.E và Emodin Chất HTO.E Vị trí 1 2 3 4 δH (Giá... nghiên cứu, hà thủ ô đỏ chứa emodin, physcion, emodin 1,6 dimethyl ether, questin, citreorosein, questinol, 2 acetyl emodin, 2 methoxy-6-acetyl7-methyl julone, tricin, 2 ,3, 5,4 tetrahydroxytibene -2-O-b-D-glucosid…Ngoài ra còn có acid gallic, daucosterol, (+) catechin, (+) epicatechin Chất phospholipid có 3, 49% trong dược liệu thô và 1,82% trong dược liệu đã chế biến, hợp chất 2 -3- 54’tetrahydroxy stilbene-2-0-β-D-glucosid ... m 0,87 (3H, s) 37 ,8 28,9 1,54 (2H, m) 0,90 (3H, s) 36 ,3 28,2 24(CH3) 25(CH3) 0,68 (3H, s) 0,86 (3H, s) 17,5 16,2 0,68 (3H, s) 0,84 (3H, s) 16,9 16,0 26(CH3) 27(CH3) 0,75 (3H, s) 1,01 (3H, s) 15,9... s) 39 ,1 47,0 10 11 1,84 (2H, m) 37 ,7 24,1 1,92 (2H, dd, 13, 7; 3, 5 Hz) 36 ,5 23, 8 12 13 5,14 (1H, t) - 126,5 139 ,2 5,14 (1H, dd, 13, 7 ;3, 5Hz) - 124,5 138 ,2 14 15 2H, m 42,9 33 ,9 1,01(2H, m) 41,6 32 ,7... 0,69 (3H, s) 1,05 (3H, s) 15,2 23, 2 28 (COOH) 29 (CH3) 0,79 (3H, d, 6,5Hz) 181,4 17,6 0,82 (3H, d, 5,9 Hz) 178,2 16,9 30 (CH3) 0,89 (3H, d, 5,5Hz) 21,5 0,92 (3H, d, 6,8 Hz) 21,1 30 ,8 Hình 3: Cấu