ghiên cứu khả năng điều hòa đáp ứng viêm của Wedelolaction từ cây nhọ nồi trong điều trị bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng thông qua thụ thể Dectin 1

ghiên cứu khả điều hòa đáp ứng viêm Wedelolaction từ nhọ nồi điều trị bệnh nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng thông qua thụ thể Dectin - : Luận văn ThS Sinh học: 60 42 30 / Thân Văn Minh ; ghd : TS Trịnh Tất Cường Nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng hội chứng lâm sàng đặc trưng viêm hệ thống nhiễm trùng Ngay điều trị tối ưu, tỉ lệ tử vong nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng gần 40% Tần suất nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng gia tăng 15 năm gần Tại Mỹ: 750.000 ca/năm; 10 nguyên nhân tử vong thường gặp Mặc dù, nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng phát từ 30 năm trước, bệnh nhân mắc bệnh có khả tử vong cao Do vậy, việc tìm kiếm phương pháp tá dược chữa bệnh vấn đề cần thiết cấp bách để điều trị hiệu trình viêm hệ thống, hỗ trợ cải thiện khả điều trị bệnh nhân bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng Cây nhọ nồi (có tên khoa học Eclipta prostrata Eclipta alba) thực vật thuộc họ cúc (Asteraceae) mọc vùng Nm loại cỏ khắp giới Cây nhọ nồi mọc nhiều Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Việt N am [2] Các hoạt tính dược học Wedelolactone từ nhọ nồi chứng minh in vitro in vivo [31] Cho đến nay, nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng nguyên nhân ca tử vong bệnh nhân cần chăm sóc đặc biệt (ICU) Các trường hợp tiếp tục gia tăng rộng khắp giới Tại Việt N am, nghiên cứu chiết xuất tinh chế xác định hoạt tính sinh học Wedelolactone từ nhọ nồi Việt N am tiến hành Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà N ội Bước đầu cho thấy tác dụng chất trình chống viêm Với hoạt tính phòng chống viêm đầy tiêm Wedelolactone, muốn nghiên cứu sâu đặc tính, chế chống viêm khả điều trị bệnh nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng mức độ in vitro in vivo tạo sở cho nghiên cứu khoa học thử nghiệm tiền lâm sàng lâm sàng sau này, nhằm đến đích cuối làm thuốc phòng ngừa chữa trị bệnh viêm nhiễm đặc biệt bệnh nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng góp phần vào việc chăm sóc bảo vệ sức khỏe cho cộng đồng Xuất phát từ sơ khoa học thực tiễn tiến hành đề tài: “ ghiên cứu khả điều hòa đáp ứng viêm Wedelolacton từ nhọ nồi điều trị bệnh nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng thông qua thụ thể Dectin – 1” Chương 1: TỔ G QUA TÀI LIỆU VAI TRÒ CỦA HỆ THỐ G MIỄ DNCH ĐỐI VỚI BẢO VỆ CƠ THỂ Miễn dịch bNm sinh miễn dịch đáp ứng hai loại đáp ứng miễn dịch bảo vệ quan trọng động vật có xương sống Miễn dịch đáp ứng bNm sinh có vai trò hàng rào bảo vệ lại khả nhận dạng lập lại mầm bệnh trợ giúp đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Miễn dịch đáp ứng nhận dạng mầm bệnh dựa vào chọn lọc vùng cụ thể nhờ vô số tế bào lymphocyte mang nhiều thụ thể đặc hiệu kháng nguyên mà cho phép hệ thống miễn dịch nhận dạng kháng nguyên bên xâm nhập vào thể Hệ thống miễn dịch bNm sinh sử dụng vô số thụ thể để nhận dạng đáp ứng tới mầm bệnh giai đoạn ban đầu thể Quá trình nhận dạng mầm bệnh thụ thể có vai trò vô quan trọng trình truyền tín hiệu tới đáp ứng viêm, sản xuất tế bào hiệu tham gia vào trình viêm cục bắt đầu đáp ứng trình miễn dịch đáp ứng Vô số thụ thể nhận dạng mầm bệnh mẫu (PRR) bao gồm thụ thể Toll-like (TLR), lectin, Dectin-1 thụ thể scavenger định tới khả sống xót vật chủ trình nhận dạng mẫu phân tử mầm bệnh vi khuNn, virut, nấm có cấu trúc giống thụ thể riêng biệt gọi PAMP (pathogenic associated molecules pattern) Quá trình nhận dạng mầm bệnh trình thực bào kích thích thực bào hóa, sinh cytokine, chemokine tiền viêm, trí kích thích trình ban đầu miễn dịch đáp ứng KHÁI IỆM VIÊM Viêm (inflammation) phần đáp ứng sinh học phức tạp mao mạch với vị trí bị tổn thương thể bị kích thích mầm bệnh tế bào bị hỏng Quá trình nhằm bảo vệ quan, loại bỏ hay sửa chữa vị trí kích thích bị thương bị lỗi Khi phản ứng viêm xảy ra, nhiều loại tế bào hoạt hóa tập trung đến ổ viêm loại tế bào di chuyển (migrating cells) gồm: bạch cầu đơn nhân, đa nhân, tế bào lympho, tiểu cầu, tế bào nội mạc… Các tế bào giải phóng hàng loạt chất trung gian, phần lớn chất prostaglandins (PG), leukotrienes (LT), histamine, bradykinin, nhân tố hoạt hóa tiểu cầu interleukin-1 Các chất lại tiếp tục hoạt hóa tế bào khác làm giải phóng hàng loạt enzyme “dọn dẹp” chủ yếu phân giải protein proteinase, interleukin, yếu tố ngoại tử khối u (TN F-α), superoxide, H+, hydroperoxide gây tổn thương mô, qua khép kín trình viêm mạn tính Quá trình tiết chất trung gian làm tăng dòng chảy máu tới vùng bị xâm nhập dẫn tới tượng bị đỏ, nóng Một vài chất tiết làm hẹp dòng chảy máu dẫn tới bị sưng Khi trình viêm kéo dài dẫn tới hiệu tích lũy trạng thái cân trình viêm chiếm ưu trình kháng viêm trình đông tụ chiếm ưu trình phân giải tơ huyết (fibrin) Quá trình nghẽn mạch, thiếu máu cục bộ, mô bị tổn thương hậu tiếp sau dẫn tới viêm nặng choáng viêm, chức đa quan tử vong [23] HIỄM TRÙ G Ặ G VÀ CHOÁ G HIỄM TRÙ G N hiễm trùng định nghĩa phổ điều kiện lâm sàng gây đáp ứng miễn dịch bệnh nhân tới trình nhiễm trùng mà đặc trưng viêm hệ thống trình đông tụ [6,7,8] Các bệnh nhân mắc nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng trải qua hai giai đoạn đáp ứng miễn dịch [7] Thời kỳ đầu biểu đáp ứng viêm ạt tới trình nhiễm trùng Hầu hết, cytokine tiền viêm TN F, interleukine (IL)-1, IL-6, IL-12, interferon gamma (IFN gamma) Sau đó, thể điều hòa đáp ứng sản xuất cytokine kháng viêm (IL-10), chất ức chế thụ thể TN F, thụ thể IL-1 loại II, IL-1RA (một dạng bất hoạt IL-1) [12] Các lớp đáp ứng viêm hệ thống vật chủ bắt đầu số sản phNm vi khuNn N hững sản phNm vi khuNn (vi khuNn gram âm bao gồm nội độc tố: lipopolysaccharide (LPS), formyl peptides, ngoại độc tố proteases; vi khuNn gram dương ngoại độc tố, siêu kháng nguyên, ngoại độc tố A streptococcal pyrogenic (SpeA), peptidoglycan, axít lipotechoic) số chất vỏ tế bào nấm (zymosan phân tách từ Saccharomyces cerevisiae) liên kết thụ thể macrophage vật chủ kích hoạt protein điều hòa (yếu tố nhân Kappa B (N FқB)) [12] Chẳng hạn, thụ thể Toll like (TLR4) nhận dạng LPS, thụ thể Dectin-1 nhận dạng zymosan [8,15] Sau đó, thụ thể chuyển tín hiệu vào tế bào Hiệu tích lũy lớp viêm hệ thống dẫn tới trạng thái cân bằng, với trình viêm chiếm ưu trình kháng viêm trình đông tụ chiếm ưu trình phân giải tơ huyết (fibrin) Quá trình nghẽn mạch, thiếu máu cục bộ, mô bị tổn thương hậu tiếp sau dẫn tới nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng, chức đa quan tử vong [23] MIỄ DNCH BẨM SI H CỦA VẬT CHỦ ĐÁP Ứ G QUÁ TRÌ H HIỄM VI KHUẨ Hệ thống miễn dịch bNm sinh bao gồm vô số thành phần khác để chống lại trình xâm nhập vi sinh vật Thứ nhất, chức hàng rào biểu bì thể cản trở trình gây viêm nhiễm mầm bệnh Thứ hai, tế bào phân tử kiểm soát phá hủy mầm bệnh mà trốn thoát khỏi lớp hàng rào bảo vệ biểu bì để xâm nhập tiếp vào bên Thứ ba hàng rào quan trọng hệ thống bảo vệ miễn dịch bNm sinh mô tế bào macrophage truyền tin hiệu bảo vệ tế bào vùng ngoại biên hệ thống bổ thể protein truyền tín hiệu hệ thống miễn dịch bNm sinh dạng dịch nằm khoảng không mô máu Quá trình nhận dạng hệ thống miễn dịch loại bỏ mầm bệnh xâm nhập thông qua vô số chế hiệu khác Hệ thống miễn dịch bNm sinh xem có vai trò quan trọng trình viêm nhiễm 4.1 Các thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRRs) Thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRR, pathogen recognition receptor) chia làm ba nhóm bắt nguồn từ vị trí tế bào là: thụ thể huyết phần dịch mô; màng tế bào hay cytoplasm; hay nằm màng dịch tế bào xem thụ thể nhận dạng mầm bệnh [19] Mỗi nhóm thụ thể PRR có phối tử đặc hiệu để nhận dạng loại vi sinh vật định [19] Các thụ thể nhận dạng mầm bệnh cách trực tiếp (không thông qua opsonin) gián tiếp (thông qua oposonin) [19] Đối với In vivo, nhiều thụ thể tham gia để nhận dạng vi khuNn thông qua đa phản ứng đa vị trí Các phần có nguồn gốc từ nấm hay mấm lớn nhận PRR giống thụ thể TLR, thụ thể mannose, bổ thể (CR3), dectin-1 [20] Quá trình nhận dạng mầm bệnh PRR kích thích trình sản xuất cytokine chemokine dẫn tới trình hoạt động sinh tế bào khác tham gia tới vị trí trình bị viêm nhiễm Từ đây, dẫn tới phản ứng miễn dịch đáp ứng [12] Fungi Fungi TLR2 TLR6 Fungi Mannose receptor Dectin-1 CR3 CD11b CD18 Hình 1: Các thụ thể RRP nấm nhận dạng phần cacsbon Thụ thể Mannose nhận dạng thành phần mannan; TLR2 TLR6, CR3, dectin-1 nhận dạng β-glucans 4.2 Thụ thể Toll- like (TLR) Thụ thể Toll- like (TLR) protein màng mà nhận dạng phân tử có sẵn mầm bệnh (PAMP) [20] Trong động vật có vú, họ thụ thể TLR bào gồm 10 loại khác Chúng có vai trò tới nhận dạng phối tử có nguồn gốc từ mầm bệnh [20] TLR2 nhận dạng lipoproteins gốc đường có gắn lipid-(lipoarabinomannan) từ thành tế bào vi khuNn nấm [13] TLR4 nhận dạng lipopolysaccharide (LPS) từ thành tế bào vi khuNn gram âm [15] TLR9 nhận dạng deoxycytidylate-phosphate-deoxyguanylate (CpG) có deoxyribonucleic acid (DN A) vi khuNn [13] Một vi sinh vật nhận nhiều TLR Thực tế, tổ hợp TLR tham gia vào đáp ứng viêm macrophage tế bào dendritic sinh trình thể bị nhiễm mầm bệnh [20] TLR bao gồm đoạn nằm bên tế bào gọi thụ thể Toll/IL-1 (TIR) Đoạn tường với đoạn TIR khác N hững đoạn TIR có chứa phân tử tiếp nối giống giống yếu tố phân chia tế bào 88 (MyD88), protein nối tiếp có đoạn TIR (TIRAP), mộ đoạn TIR có chứa phần interferon-β (TRIF), phân tử tiếp nối với TRIF (TRAM) [20] Quá trình nhận dạng mầm bệnh TLR2 kích thích trình hoạt động yếu tố hoạt động nhân tế bào N F-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), sản xuất cytokine tiền viêm tumor necrosis factor, TN F-α thông qua đoạn TIRAP đoạn MyD88, trình nhận dạng TLR4 lại kích thích hoạt động N F-κB thông qua TIRAP, MyD88 kích thích hoạt động đoạn phiễn mã interferon (IFN ) giống trình sản xuất IFN kiểu [27] 4.3.Thụ thể Dectin- Quá trình nhiễm nấm kích hoạt trình hoạt động ban đầu đáp ứng miễn dịch bNm sinh động vật có vú thông qua quan cảm ứng trình nhiễm trùng [16] Chất β-glucan thành phần quan trọng vỏ tế bào nấm Tế bào nhận thành phần xâm nhập nhờ vao hoạt động thụ thể Dectin-1 Thụ thể nằm màng tế bào có đoạn kiểu C lectin gắn với loại màng kiểu II có đoạn bên cytoplasma tế bào với phần hoạt động dựa vào thụ thể miễn dịch tyrosine [8] Dectin-1 biểu dòng tế bào myeloid, monocyte, đại thực bào, tế bào trung tính tế bào tua [16] Cho đến thụ thể Dectin-1 hiểu rõ thụ thể biểu mạnh đại thực bào trình thực bào nấm Đặc biệt thụ thể nhận dạng đặc hiệu β-glucan zymosan (một chất có chứa hàm lượng lớn β-glucan tách chiết từ Sacchomyces) Các đáp ứng thực bào trình nhận dạng vi sinh vật sản xuất cytokine, chemokine, trình thực bào hóa, giết mầm bệnh sản xuất peptide kháng vi sinh vật, phản ứng oxy hóa (ROS) RN S [16] 4.4 Thụ thể Dectin-1 hoạt động với TLR2 để nhận dạng phối tử có nguồn gốc từ vi sinh vật Zymosan hợp chất mà lượng β-glucan thành tế bào Saccharomyces cerevisiae chiếm phần [8,16] Thành phần zymosan có β-glucan, mannan, chitin Thành phần nhận dạng số thụ thể chẳng hạn TLR2, TLR6, Dectin-1, thụ thể mannose, CR3 [16] Chất chứng minh kích thích trình đại thực bào trình viêm in vivo in vitro [16] Dectin-1 hoạt động với số TLR để nhận dạng nấm [16] Thụ thể với TLR2, Dectin-1 nhận dạng zymosan nấm Candida albicans truyền tín hiệu điều hòa hoạt động yếu tố nhân kích hoạt tế bào T (N FAT) trình sản xuất interleukin (IL)-2, IL-10, IL-12 p70 tế bào dendritic [16, 26] Dectin-1 tham gia vào trình thực bào, hoạt động yếu tố tự phân bào (ERK)1/2 (extracellular signal-regulated kinase), trình sản xuất cytokine tiền viêm với TLR2 để nhận dạng Mycobacterium abscessus [16] Hơn nữa, Dectin-1 tham gia với TLR2 TLR4 đáp ứng miễn dịch bNm sinh tới nhận Mycobacterium ulcerans để kích thích sinh gốc oxy hóa (ROS) sản xuất chemokines IL-37 kerainocyte người Do vậy, Dectin-1 thực vai trò hoạt động giống thụ thể nhận dạng trình nhiễm nấm mycobacterium [16] Hình 2: Tín hiệu Dectin-1 hợp tác TLR để nhận dạng nấm Dectin-1 nhận dạng nấm để sinh trình enzyme kinsase tyrosine lách (Syk) đoạn protein caspase (CARD)9 CARD9 tác động với B-cell lymphoma-10 (Bcl-10) vùng phiên mã gen lympho (MALT1) để kích thích tạo ROS trình hoạt động F-κB Quá trình biểu Dectin-1 expression tăng cường trình sản xuất cytokine có mặt TLR2 TLR6 4.5 Glucocorticoid Glucocorticoid sử dụng chất chống viêm với nhiều chế trình hoạt động [17] Rất nhiều nghiên cứu chứng minh glucocorticoid điều hòa chức tế bào viêm, đặc biệt trình phiên mã gen sinh cytokine [11] Hơn nữa, glucocorticoid ức chế trình sản xuất cytokine tiền viêm TN F-α, IL-6, IL-1, làm giảm trình tiết gốc nito trình hoạt hóa yếu tố mô tế bào macrophage [22] Do vậy, glucocorticoid sử dụng điều trị số bệnh viêm nhiễm bệnh mẫn cảm miễn dịch N hưng nữa, chúng có tiềm vô to lớn hoạt động kháng viêm giảm trình miễn dịch lợi cho thể [9,17, 21] N hìn chung, trình viêm hệ thống kiểm soát xem đặc trưng nhiễm trùng, triệu chứng viêm cấp tính đường hô hấp Một chất biết Hydrocortisone, glucocorticoid, làm giảm đáng kể mức plasma protein C, phospholipase A2, loại bỏ bớt tế bào neutrophil bệnh nhân bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng [22] N hững nghiên cứu gần chất điều hòa hầu hết cytokine tiền viêm [11], bao gồm ức chế cytokine có vai trò quan trọng miễn dịch bNm sinh nhiễm trùng [22] Hiệu glucocorticoid chứng minh bệnh nhiễm trùng nặng nhiễm vi khuNn meningitis, pneumocystis pneumonia, typhoid fever, trường hợp nhiễm H5N [11] 4.6 ROS p47phox 4.6.1.Gốc oxy hóa ROS Dược liệu Trung ương, trường Đại học Dược, trường Đại học Y Hà N ội Học viện Quân y 103 Các nghiên cứu sở dừng mức tạo mô hình gây viêm thực nghiệm in vivo cổ điển trình bày Cụ thể thí nghiệm thực chuột thông qua sử dụng chất gây viêm carrageenan để tạo mô hình viêm cấp hình thức gây phù bàn chân chuột gây viêm màng bụng chuột sau tiêm chất gây viêm Việc gây viêm mãn tính sử dụng chất amiant để tạo u hạt thể chuột Việc đánh giá tác dụng kháng viêm thực cách đo thể tích bàn chân, đo thể tích dịch viêm ổ bụng, đo trọng lượng khối u hạt tách ra, đếm số lượng bạch cầu so với mẫu đối chứng, từ đánh giá tác dụng kháng viêm chất nghiên cứu N goài ra, việc đánh giá tác dụng kháng viêm chủ yếu thực với cao chiết thô thực vật Điển nghiên cứu Đặng Diễm Hồng cộng với dịch chiết rong tảo biển Việt N am[1] N hóm nghiên cứu phát thấy dịch chiết methanol hai loài tảo biển Sargassum swartzii Ulva reticulata thể hoạt tính kháng viêm cao mà không gây độc với động vật thử nghiệm [1] Hàng loạt nghiên cứu khác thời gian gần sử dụng mô hình nghiên cứu để đánh giá tác dụng kháng viêm dịch chiết thực vật nghiên cứu Ví dụ Hà Vân Oanh cộng (2010) cao lỏng rễ bạch đồng nữ (Clerodendrum chinense) [4], Đỗ Thị Oanh cộng (2010) cao sói rừng (Sapium sebiferum) [3] hay N guyễn Thị Bích Hằng (2009) cao lỏng vọng cách (Premna corymbosa) [5] N hư nói rằng, mô hình nghiên cứu viêm đánh giá tác dụng kháng viêm Việt N am đơn giản, cổ điển, tốn nhiều thời gian thiếu tin cậy N hư vậy, thiếu nghiên cứu đại với mô hình gây viêm đạt chuNn quốc tế hay nghiên cứu chế kháng viêm thông qua đánh giá ảnh hưởng chất nghiên cứu lên thụ thể TLR, GC, mức độ giải phóng chất trung gian tiết trình tiền viêm viêm, tín hiệu gây viêm đặc hiệu Đặc biệt, chưa có mô hình sàng lọc in vitro cho phép sàng lọc nhanh, xác hiệu chất kháng viêm từ nguồn nguyên liệu khác CÂY HỌ ỒI VÀ VAI TRÒ CỦA WEDELOLACTO E TRO G QUÁ TRÌ H CHỐ G VIÊM 7.1 Cây nhọ nồi Thực vật nguồn vô giá sản phNm dược học Trên giới, thực vật có tính dược học sử dụng truyền thống sản xuất loạt hợp chất có nhiều tiềm chữa bệnh Việt N am, lĩnh vực dược học sản xuất nhiều sản phNm có nguồn gốc từ thực vật mang dược tính Thực vật làm thuốc góp phần quan trọng điều trị số bệnh thông qua dược tính quí giá [2] Cây nhọ nồi cỏ mực, hàn liên thảo (danh pháp khoa học: Eclipta alba Hassk, Eclipta prostrata L.) loài thuộc Họ Cúc Cây nhọ nồi cỏ, sống hay nhiều năm, mọc đứng hay mọc bò, cao 3040cm Thân màu lục đỏ tía, phình lên mấu, có lông cứng Lá mọc đối, gần không cuống, mép khía nhỏ; hai mặt có lông Hoa hình đầu, màu trắng, mọc kẽ thân, gồm hoa hoa lưỡng tính Quả bế dài 3mm, có 2-3 vảy nhỏ, có cạnh, dẹt Hình 5: Cây nhọ nồi Theo đông y nhọ nồi chữa can, thận âm hư, chứng huyết nhiệt, chứng ho máu, nôn máu, đại tiện tiểu tiện máu, chảy máu cam, chảy máu da, băng huyết rong huyết, râu tóc sớm bạc, lợi sưng đau 7.2 Wedelolactone Cây nhọ nồi bao gồm nhiều hợp chất hữu giống wedelolactone (I) demethylwedelolactone (II), polypeptide, polyacetylene, dẫn suất thiophene, steroid, triterpene and flavonoid [30] Đặc biệt, Wedelolactone biết có loạt hoạt tính sinh học sử dụng điều trị bệnh viêm gan, xơ gan, kháng vi khuNn [30] N goài ra, Kobori cộng chứng minh vai trò Wedelolactone chất ức chế IKK, kinase đóng vai trò quan trọng hoạt động yếu tố N F-κB, cách tác động đến đường photphoryl hóa IκBα [30] Bên cạnh đó, hợp chất hữu tự nhiên bao gồm Wedelolactone số chất từ Wedelia canlendulacea sử dụng y học N am Mỹ giống thuốc kháng lại nọc độc rắn [32] Trong y học truyền thống Trung Quốc, Wedelolactone sử dụng điều trị bệnh gan, bệnh viêm nhiễm virut [30] Hơn nữa, Wedelolactone có khả giảm phát triển ung thư Gần đây, số nghiên cứu công bố Wedelolactone có khả ức chế phát triển dòng tế bào ung thư tiền liệt tuyến, tuyến yên, hiệu dòng tế bào MDA-MB-23 (tế bào ung thư vú) [30] N goài ra, đây, hoạt tính Wedelolactone tách chiết từ nhọ nồi tiến hành Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym Protein- Đại học Khoa học Tự nhiên Hà N ội bước đầu có kết đáng quan tâm khả chống viêm Đây sở để tiếp tục nghiên cứu sâu khả phòng chữa bệnh nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng hoạt chất tiềm mô hình viêm in vitro thông qua thụ thể Dectin-1 in vivo chuột bị choáng nhiễm khuNn tiêm zymosan cấu tử đặc hiệu thụ thể Dectin-1, góp phần làm sáng tỏ vai trò hoạt chất Wedelolactone vai trò điều trị chống viêm Hình 6: Cấu trúc hóa học Wedelolactone Chương 2: ĐỐI TƯỢ G VÀ PHƯƠ G PHÁP GHIÊ CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢ G GHIÊ CỨU 2.1.1.Động vật thí nghiệm Chuột Swiss mua từ Viện vệ sinh dịch tế trung ương Trọng lượng chuột từ 18-20gram 2.1.2 Hóa chất Wedelolactone cung cấp từ Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym Protein Cấu tử đặc hiệu Dectin-1: zymosan (sigma, Mỹ), ELISA kit IL-6, IL-10, TN F, IL12p40 (BD Bioscience, Mỹ) Kit đếm tế bào sống chết (CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Mỹ) Laminarin (chất ức chế Dectin-1), Galactan (chất đối chứng dương, Sigma), hóa chất mua hãng Sigma Thuốc chống viêm Desamethasone (một loại thuốc sử dụng chống nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng, Sigma, Mỹ) 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu Tủ ấm CO2, Tủ cấy vô trùng N aure, Máy đọc ELISA(bio-rad, Mỹ), Tủ lạnh: Kính hiển vi soi ngược (Olympus, N hật), Máy khuấy từ nhiệt (Đức), kính hiển vi laze hội tụ (LSM 510)… dụng cụ thí nghiệm thông thường khác như: đĩa nuôi cấy 24, 48, 96 giếng (Corning, Mỹ), kim uống, kim tiêm, dao, kéo 2.2 PHƯƠ G PHÁP GHIÊ CỨU 2.2.1.Tách chiết macrophage từ tủy xương chuột 2.2.2.Đánh giá hoạt tính độc tố Wedelolactone tới khả sống BMDM kít đếm tế bào sống chết 2.2.3 Đánh giá khả sản xuất cytokine ELISA Kit 2.2.4 Phân tích ức chế Wedelolactone trình tạo phản ứng oxy hóa 2.2.5 Gây nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng chuột tiêm zymosan 2.2.6 Đánh giá hiệu sống xót chuột bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng chuột Wedelolactone 2.2.7 Đánh giá hiệu ức chế trình sinh cytokine huyết Chuột bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng tiêm Wedelolactone 2.2.8 Đánh giá hiệu Wedelolactone Dexamethason điều trị chuột bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng 2.2.9.Phân tích thống kê Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬ Khả sống tế bào không bị ảnh hưởng Wedelolactone Để khẳng định Wedelolactone có gây độc tố tế bào BMDM hay không, BMDM chia vào giếng khác đĩa nuôi tế bào 96 giếng với mật độ 1x 105 Các BMDM sử lý với Wedelolactone nồng độ khác hình Sau đó, BMDM ủ với 10 µl kit đếm tế bào Kết Hình 1, tỉ lệ phần trăm BMDMs khác biệt BMDMs sử lý với nồng độ khác Wedelolactone sau 48 Kết này, cho thấy Wedelolactone khả gây độc với BMDM TỶ LỆ TẾ BÀO SỐ G (%) 100 75 50 25 ĐC 10 20 30 (µg/ml ) Hình 8: Wedelolactone không gây độc tế bào BMDM BMDMs nuôi với mật độ 1×105 tế bào/ giếng Sau 3-4 ngày, tế bào sử lý với Wedelolactone nồng độ 10, 20, 30 µg/ml Các tế bào sống đo kit đếm tế bào Dữ liệu sai số ba thí nghiệm độc lập Đánh giá khả zymosan kích thích tế bào BMDM sinh cytokine Để xác định việc kích thích trình sinh cytokine tiền viêm kháng viêm BMDM zymosan, BMDM sau nuôi đĩa 48 giếng với mật độ 1x105 ủ với zymosan (100 µg/ml) thời gian khác hình N hư vậy, zymosan (100µg/ml) kích thích BMDM, sinh cytokine TN Fα , IL 6, IL 12p40, IL-10 tăng dần từ mốc 0h , 4h ,8h , 18h sau bắt đầu giảm Từ kết này, thời gian ủ Zymosan để sinh Cytokine nhiều sau 18 nồng độ cytokine (pg/ml) 15000 nồng độ cytokine (pg/ml) 15000 IL-6 TNF-α 10000 10000 5000 5000 12000 18 48 (h) 10000 IL12p40 18 48 (h) IL-10 8000 8000 4000 4000 2000 18 48 (h) 0 18 48 (h) Hình 9: Zymosan kích thích tế bào BMDM sản xuất cytokine tiền viêm kháng viêm BMDMs từ chuột ủ với zymosan 100 (µg/ml) Dịch tế bào ủ với zymosan thời gian khác 0, 4, 8, 18, 48 đánh giá trình sản xuất cytokine ELISA Các kết biểu sai số ý nghĩa thí nghiệm độc lập Wedelolactone ức chế trình sinh cytokine tiền viêm BMDM kích thích zymosan Wedelolactone có khả làm giảm sốt, chống ung thư () Tuy nhiên, vai trò trình truyền tín hiệu viêm gây zymosan chưa chứng minh Để đánh giá hiệu Wedelolactone trình này, BMDM ủ với nồng độ khác Wedelolactone 45 phút Sau đó, BMDM ủ tiếp với zymosan sau 18 Từ hình 10 cho thấy Wedelolactone ức chế trình sản xuất cytokine tiền viêm TN F, IL-6, IL12p40 Trái lại, protein kháng viêm IL-10 Wedelolactone lại khả ức chế Từ kết cho thấy với nồng độ nồng độ cytokine (pg/ml) nồng độ cytokine (pg/ml) 15000 IL-6 12000 TNF-α 10000 8000 5000 4000 Hình 10: Wedelolactone ức chế trình sinh cytokine tiền viêm DM 2.5 10 20 µg/ml DM 2.5 BMDM kích thích zymosan W 10 20 µg/ml W zymosan zymosan Wedelolactone điều hòa trình sinh12000 cytokine tiền viêm thông qua thụ IL-10 12000 IL-12p40 thể Dectin-1 8000 Thụ 8000 thể Dectin-1 tham gia trình nhận dạng miễn dịch ban 4000đó, Wedelolactone điều đầu nấm thông qua liên kết glucan [59] Do 4000 tra xem có khả ức chế trình sản xuất cytokine zymosan kích thích Đối với mục đích DM DM 2.5 10 20 µg/ml này, ủ với số nồng Wđộ tăng dần 2.5 BMDMs 10 20 µg/ml W zymosan zymosan laminarin, chất có khả ức chế trình hoạt động thụ thể Dectin-1 [27], polysaccharide galactan nồng độ giống laminarin sau 45 phút Tiếp theo, tế bàozymosan ủ với Wedelolactone (hình 11A), Dex (hình 11B) trước ủ với zymosan Tế bào ủ với Laminarin xuất trình sinh cytokine ngược lại với tế bào không sử lý với Laminarin hình 11A Các cytokine TN F-α, and IL-6 in BMDMs tăng dần theo nồng độ Laminarin Trái lại, tế bào sử lý với polysaccharide galactan cho kết giống tế bào sử lý với Wedelolactone Giống kết Hinh 11A, kết hình 4B cho kết tương tự N hững kết gợi ý thụ thể Dectin-1 có vai trò trình Wedelolactone Dex truyền trình ức chế zymosan kích thích sinh cytokine tiền viêm BMDMs A B 4800 4800 3600 3600 2400 2400 TNF-α α IL-6 IL-6 6000 4000 IL-12p40 M ĐC ĐC lam gal W Dexa Hình 11: Wedolactone Dex điều hòa trình đáp ứng viêm kích thích zymosan thông qua thụ thể dectin-1 Wedelolactone điều khiển trình sinh ROS zymosan kích thích thông qua thụ thể Dectin-1 Zymosan kích thích trình sản xuất ROS đại thực bào [16] Tuy nhiên, vai trò Wedelolactone trình sinh ROS zymonsan kích thích BMDB chưa rõ Để điều tra trình này, BMDMs ủ với Laminarin Galactan 60 phút trước ủ với Wedelolactone (20g/ml) Dex (100nM) Sau đó, tế bào ủ tiếp với zymosan 30 phút Các tế bào tiếp tục ủ với DHE theo phần phương pháp N hư Hình 12A, zymosan kích thích tạo ROS, nhiên trình sản xuất ROS bị ức chế tế bào ủ với Wedelolactone trình bị đảo ngược tế bào ủ với Laminarin Tuy nhiên, điều không xảy với tế bào ủ với galactan Trên hình 12B, kết tương tự hình 12A thay Wedelolactone Dex N hững kết Wedelolactone điều hòa trình sinh ROS zymosan kích thích BMDM thông qua thụ thể Dectin-1 A B Zym Zym Quá trình sản xuất ROS(O2-) Quá trình sản xuất ROS(O2) W Dexa *** lam+ gal+ lam+ gal+ W W Dexa Dexa Hình 12: Wedelolactone Dex ức chế trình sản sinh ROS kích thích zymosan thông qua Dectin-1 Wedelolactone bảo vệ chuột bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng gây zymosan Zymosan kích thích trình viêm cấp tính làm hỏng đa quan mô hình động vật bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng [23,24] Để đánh giá hiệu điều trị Wedelolactone chuột bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng, chuột chia thành nhóm khác (mỗi nhớm 10 con) tiêm với Wedelolactone 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg trọng lượng thể nhóm đối chứng không tiêm Wedelolactone Sau 24 giờ, nhóm chuột tiêm zymosan (2 mg/g trọng lượng thể) Khả chuột sống xót tính sau ngày tiêm với zymosan Trên hình cho thấy chuột sau ngày không nhận Wedelolactone chết 100% Tuy nhiên, chuột nhận Wedelolactone nồng độ khác khả sống xót tăng dần Ở nồng độ Wedelolactone 20 mg/ml tỉ lệ sống xót gần 40% gần giống tỉ lệ chuột sống xót với Wedelolactone 30 mg/ml Từ kết này, cho ĐC (n=10) Khả 100 sống 80 xót 60 (%) W= 10 mg/kg (n= 10) 40 P=0.0123* 20 0 20 40 60 80 100 (h) Khả 100 sống 80 xót (%) ĐC (n=10) W= 20 mg/ kg (n=10) Khả 100 sống 80 xót(%) 60 60 40 40 20 ĐC (n=10) W= 30 mg/ kg (n=10) 20 0 20 40 60 80 100 (h) 20 40 60 80 100 (h) thấy Wedelolactone cải thiện trình điều trị chuột bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm khuNn nồng độ 20 mg/ml Wedelolactone làm giảm khả sản xuất cytokine chuột bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng cytokine 1500 (pg/ml) cytokine 3000 (pg/ml) 2000 1000 1000 500 IL-6 Nồng độ 2000 TNF-α α Nồng độ4000 ĐC ĐC W ĐC ĐC W Zym Zym Hình 14: Wedelolactone ức chế trình sinh cytokine tiền viêm chuột bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng Hiệu Wedelolactone Dexamethasone chuột bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng A Khả sống xót 100 (%) ĐC W(20mg/kg) Dex (1mg/kg) 80 60 40 20 0 20 40 B Nồng độ 60 80 100 (h) Nồng độ Cytokine 4000 TNF-α α cytokine (pg/ml)2000 (pg/ml) 3000 1500 2000 1000 1000 IL-6 500 ĐC ĐC Dex W Zym ĐCĐC Dex W Zym Hình 15: Hiệu điều trị Wedelolactone cao so với Dexamethasone KẾT LUẬ VÀ KIẾ GHN KÊT LUẬ N ghiên cứu chứng minh vai trò Wedelolactone với nồng độ 20µg/ml trình kháng viêm thông qua thụ thể Dectin-1: - Ức chế trình sinh cytokine tiền viêm TN F, IL-6, IL12p40 - Ức chế trình sinh gốc oxy hóa Quan trọng hơn, Wedelolactone với nồng độ 20mg/kg trọng lượng thể cải thiện sống chuột bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng KIẾ GHN Tiếp tục nghiên cứu sâu chế chống viêm thử đối tượng khác chuột Xác định thêm Wedelolactone có phải cấu tử thụ thể Glucocorticoid hay không LỜI CẢM Ơ Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Trịnh Tất Cường người thầy tận tâm, truyền cho lòng say mê khoa học, nhiệt tình bảo cho nhiều kiến thức mẻ trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Xin cảm ơn quý thầy cô Tổ Hoá Sinh, Phòng Thí nghiệm Trọng điểm, quý thầy cô Khoa Sinh học - Trường ĐHKHT - Đại học Quốc Gia Hà ội tận tình giảng dạy, truyền thụ kiến thức cho suốt năm học tập trường Tôi xin cảm ơn Phòng Sau đại học, BGH Trường ĐHKHT - Đại học Quốc Gia Hà ội tạo điều kiện thuận lợi cho trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Xin gửi lời tri ân đến gia đình, tất bạn bè, đồng nghiệp, người thân yêu bên quan tâm, chia sẻ, động viên giúp đỡ suốt thời gian qua Đề tài hoàn thành với tài trợ kinh phí từ quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia cho đề tài mã số: 106.99-2010.23 Hà ội, ngày 20 tháng 12 năm 2011 Học viên Thân Văn Minh BẢ G CHỮ CÁI VIẾT TẮT AP -1 Activation Protein- BMDM Bone Marrow-Derived Macrophage DHE Fluorescent Dyes (dihydroethidium) ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay GR Glucocorticoid receptor IL Interleukin LPS Lipopolysaccharides LT Leukotrienes N SAID/ N SAIDs N onsteroidal anti-inflammatory drugs N uclear factor kappa-light-chain-enhancer of 10 N F-КB 11 ICU Intensive-care unit 12 PG Prostaglandins 13 ROS Reactive oxygen species 14 TLR Toll-like receptor activated B cells 15 TN F Tumor necrosis factor 16 PRR Pattern recognition receptor 17 PAMP Pathogenic associated molecules pattern 18 N icotinamide adenine dinucleotide phosphate N ADPH 19 ERK Extracellular signal-regulated kinase 20 B-cell lymphoma-10 Bcl-10 21 OD Optical density 22 RN S Reactive nitrogen species 23 TX Thromboxane [...]... được kích thích bởi zymosan thông qua Dectin- 1 6 Wedelolactone bảo vệ chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng gây ra bởi zymosan Zymosan kích thích quá trình viêm cấp tính và làm hỏng đa cơ quan trong các mô hình động vật bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng [23,24] Để đánh giá hiệu quả điều trị của Wedelolactone trong chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng, chuột đã được chia thành... nặng và choáng nhiễm trùng trong chuột bằng Wedelolactone 2.2.7 Đánh giá hiệu quả ức chế quá trình sinh cytokine trong huyết thanh của Chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng bằng tiêm Wedelolactone 2.2.8 Đánh giá hiệu quả Wedelolactone và Dexamethason trong điều trị chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng 2.2.9.Phân tích thống kê Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬ 1 Khả năng sống của tế... Enzym và Protein- Đại học Khoa học Tự nhiên Hà N ội bước đầu đã có những kết quả đáng quan tâm về khả năng chống viêm Đây là cơ sở để chúng tôi tiếp tục nghiên cứu sâu hơn nữa về khả năng phòng và chữa bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng của hoạt chất tiềm năng trên mô hình viêm in vitro thông qua thụ thể Dectin- 1 và in vivo trên chuột bị choáng nhiễm khuNn do tiêm zymosan một cấu tử đặc hiệu của. .. Hình 14 : Wedelolactone đã ức chế quá trình sinh cytokine tiền viêm trong chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng 8 Hiệu quả của Wedelolactone và Dexamethasone trong chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng A Khả năng sống xót 10 0 (%) ĐC W(20mg/kg) Dex (1mg/kg) 80 60 40 20 0 0 20 40 B Nồng độ 60 80 10 0 (h) Nồng độ Cytokine 4000 TNF-α α cytokine (pg/ml)2000 (pg/ml) 3000 15 00 2000 10 00 10 00... IL -12 p40 M ĐC ĐC lam gal W Dexa Hình 11 : Wedolactone hoặc Dex điều hòa quá trình đáp ứng viêm kích thích bằng zymosan thông qua thụ thể dectin- 1 5 Wedelolactone điều khiển quá trình sinh ROS do zymosan kích thích thông qua thụ thể Dectin- 1 Zymosan có thể kích thích quá trình sản xuất ROS trong đại thực bào [16 ] Tuy nhiên, vai trò của Wedelolactone trong quá trình sinh ROS do zymonsan kích thích trong. .. 0 ĐC (n =10 ) W= 30 mg/ kg (n =10 ) 20 0 0 20 40 60 80 10 0 (h) 0 20 40 60 80 10 0 (h) thấy Wedelolactone có thể cải thiện được quá trình điều trị chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm khuNn tại nồng độ 20 mg/ml 7 Wedelolactone đã làm giảm khả năng sản xuất cytokine trong chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng cytokine 15 00 (pg/ml) cytokine 3000 (pg/ml) 2000 10 00 10 00 500 0 IL-6 Nồng độ 2000... viêm thông qua thụ IL -10 12 000 IL -12 p40 thể Dectin- 1 8000 Thụ 8000 thể Dectin- 1 tham gia chính trong quá trình nhận dạng miễn dịch ban 4000đó, Wedelolactone đã được điều đầu của nấm thông qua liên kết glucan [59] Do 4000 tra xem có khả năng ức chế quá trình sản xuất cytokine do zymosan kích thích 0 Đối với 0 mục đích DM DM 2.5 5 10 20 µg/ml này, ủ cùng với một số nồng Wđộ tăng dần của 2.5 BMDMs 5 10 ... macrophage từ tủy xương của chuột 2.2.2.Đánh giá hoạt tính độc tố của Wedelolactone tới khả năng sống của BMDM bằng kít đếm tế bào sống chết 2.2.3 Đánh giá khả năng sản xuất cytokine bằng ELISA Kit 2.2.4 Phân tích ức chế của Wedelolactone trong quá trình tạo phản ứng oxy hóa 2.2.5 Gây nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng ở chuột bằng tiêm zymosan 2.2.6 Đánh giá hiệu quả sống xót của chuột bị nhiễm trùng nặng. .. đặc hiệu của thụ thể Dectin- 1, góp phần làm sáng tỏ vai trò của hoạt chất Wedelolactone trong vai trò điều trị chống viêm Hình 6: Cấu trúc hóa học của Wedelolactone Chương 2: ĐỐI TƯỢ G VÀ PHƯƠ G PHÁP GHIÊ CỨU 2 .1 ĐỐI TƯỢ G GHIÊ CỨU 2 .1. 1.Động vật thí nghiệm Chuột Swiss được mua từ Viện vệ sinh dịch tế trung ương Trọng lượng chuột từ 18 -20gram 2 .1. 2 Hóa chất Wedelolactone được cung cấp từ Phòng Thí... chất cần nghiên cứu và sau đó so sánh thể tích bàn chân viêm với đối chứng [33]; ii) gây viêm xoang bụng (peritroneal inflammation) bằng cách tiêm carrageenan vào bụng chuột trong điều kiện có mặt và vắng mặt của chất nghiên cứu Lượng dịch viêm tiết trong xoang bụng chuột sẽ được thu lại và so sánh với đối chứng về thể tích cũng như lượng bạch cầu và protein trong dịch [15 ]; iii) gây viêm mạn tính (chronic ... nht l sau 18 gi nng cytokine (pg/ml) 15 000 nng cytokine (pg/ml) 15 000 IL-6 TNF- 10 000 10 000 5000 5000 12 000 18 48 (h) 10 000 IL12p40 18 48 (h) IL -10 8000 8000 4000 4000 2000 18 48 (h) 0 18 48 (h)... trỡnh sinh12000 cytokine tin viờm thụng qua th IL -10 12 000 IL -12 p40 th Dectin- 1 8000 Th 8000 th Dectin- 1 tham gia chớnh quỏ trỡnh nhn dng dch ban 4000ú, Wedelolactone ó c iu u ca nm thụng qua liờn... kt qu ny, cho C (n =10 ) Kh 10 0 nng sng 80 xút 60 (%) W= 10 mg/kg (n= 10 ) 40 P=0. 012 3* 20 0 20 40 60 80 10 0 (h) Kh nng 10 0 sng 80 xút (%) C (n =10 ) W= 20 mg/ kg (n =10 ) Kh nng 10 0 sng 80 xút(%) 60