Nghiên cứu sàng lọc phân lập và nhận dạng các hoạt chất axit béo, axit arachidonic và prostaglandin từ rong đỏ biển

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ …… ….***………… LÊ TẤT THÀNH NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC, PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG CÁC HOẠT CHẤT AXIT BÉO, AXIT ARACHIDONIC VÀ PROSTAGLANDIN TỪ RONG ĐỎ BIỂN Chuyên ngành: Hóa học hợp chất thiên nhiên Mã số: 62 44 01 17 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2016   Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: GS.TS Phạm Quốc Long Người hướng dẫn khoa học 2: TSKH Andrey B Imbs Phản biện 1: PGS.TS Hồng Thanh Hương Phản biện 2: GS.TS Lã Đình Mỡi Phản biện 3: PGS.TS Trần Thu Hương Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ Phịng họp tầng 2, Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Vào hồi …… ……, ngày …… tháng … năm 2016 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam   I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tính cấp thiết Nhóm axit béo C20 đa nối đơi, điển hình axit arachidonic (AA) axit eicosapentaenoic (EPA), có vai trị quan trọng nhóm chất lipit thể động vật bậc cao chúng tiền chất để sinh tổng hợp eicosanoid nhóm phân tử dẫn truyền tín hiệu sinh học (cịn gọi hoocmon tổ chức) prostaglandin, prostacyclin, leukotrien, thromboxan Axit arachidonic thành phần phospholipit cấu tạo nên màng tế bào não, bắp gan thường phân lập từ lipit gan, trứng loài cá biển AA thành phần lipit số lồi rong biển Axit arachidonic có tác dụng kích hoạt hệ enzyme NADPH oxygenase giúp hoạt hố q trình trao đổi oxi, kích hoạt kênh ion K+, Ca2+… Các prostaglandin (PG) hình thành từ các axit béo C20 đa nối đơi qua q trình chuyển hố enzym thể có chức sinh học quan trọng động vật Chúng mắt xích quan trọng chuỗi phản ứng miễn dịch thể, liên quan đến tượng quan trọng viêm tấy ung thư Chúng tác động lên khả chịu đựng hệ phẳng, hệ tiết, hệ tiêu hóa hệ tuần hồn thể sống Chính vậy, chúng sử dụng làm thuốc để điều tiết trình thụ thai, mang thai sinh đẻ coi chất hormon Các prostaglandin nhà khoa học nghiên cứu tổng hợp hay tìm kiếm từ nguồn nguyên liệu tự nhiên, đặc biệt nguồn sinh vật biển phát số loài rong Đỏ biển với hàm lượng cao axit béo khơng no đa nối đơi Vì rong đỏ biển đánh giá nguồn nguyên liệu tự nhiên tiềm để khai thác hoạt chất Trên sở phân tích nêu trên, chúng tơi lựa chọn rong Đỏ đối tượng nghiên cứu với đề tài: “Nghiên cứu sàng lọc, phân lập nhận dạng hoạt chất axit béo, axit arachidonic prostaglandin từ rong Đỏ biển” Mục tiêu luận án Mục tiêu rộng luận án điều tra, khai thác tài nguyên lipit loài rong đỏ biển đỏ Việt Nam Các mục tiêu cụ thể bao gồm:     Sàng lọc hóa học, xây dựng ngân hàng liệu hàm lượng lipit, thành phần axit béo prostaglandin mẫu rong đỏ biển đại diện cho loài, địa phương, điều kiện sinh trưởng, nuôi trồng thời kỳ thu hoạch khác Xác định yếu tố ảnh hưởng đến tích lũy lipit thành phần nêu - Tìm kiếm lồi rong Đỏ biển Việt Nam có tiềm thu nhận thành phần lipit có giá trị, đặc biệt axit béo C20 đa nối đôi prostaglandin - Thử nghiệm ni trồng số lồi rong đỏ chọn lọc, có: lồi rong Đỏ có giá trị di thực từ LB Nga; loài rong Đỏ Việt Nam Xác định động thái hình thành, tích luỹ axit béo PG q trình ni trồng - Xây dựng phương pháp phân lập hoạt chất AA, PG từ loài rong Đỏ biển Nội dung nghiên cứu luận án - Phân tích hàm lượng lipit thành phần axit béo 68 mẫu rong đỏ Việt Nam 01 mẫu rong đỏ LB Nga - Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến hình thành tích luỹ lipit axit béo rong Đỏ - Sử dụng phương pháp phân tích thành phần PCA phương pháp phân tích chùm để xử lý tập liệu thành phần axit béo mẫu rong đỏ, tìm mối quan hệ mẫu với với thành phần axit béo - Sàng lọc hoạt chất prostaglandin axit arachidonic mẫu rong Đỏ biển thu thập - Khảo sát số điều kiện sinh trưởng phát triển loài rong câu Gracilaria vermiculophylla thu từ vùng biển Viễn Đông - Liên bang Nga điều kiện PTN để theo dõi biến động hàm lượng axit béo prostaglandin q trình ni trồng - Phân lập, nhận dạng chứng minh cấu trúc PGE2, PGE3 axit arachidonic từ lồi rong Đỏ có tiềm thu biển Việt Nam biển Viễn Đông – Liên Bang Nga         Những đóng góp luận án Tập liệu hàm lượng lipit, thành phần axit béo prostaglandin 69 mẫu đại diện cho 25 loài thuộc họ rong đỏ biển Việt Nam thu địa phương, điều kiện sinh trưởng, nuôi trồng thời kỳ thu hoạch khác với 01 mẫu rong đỏ Liên bang Nga; Kết xác định đánh giá nhóm axit béo có giá trị cao thuộc dãy omega-3, omega-6, axit béo không no thiết yếu PUFA HUFA, lần xác định axit C22:6n-3 (DHA) có mẫu rong đỏ Kết sử dụng phương pháp phân tích PCA phân tích chùm xử lý tập số liệu 12 thành phần axit béo yếu 69 mẫu rong đỏ thu cho phép phân biệt rõ ràng mẫu thuộc họ Gracilariaceae, Hypneaeceae Ceraminaceae mối liên hệ chúng với Phương pháp xác định định tính định lượng PGE2 từ lồi rong Đỏ biển Từ sàng lọc tìm PGE2 69 mẫu nghiên cứu xác định lồi rong Câu có hàm lượng PGE2 cao có khả khai thác hoạt chất Kết khảo sát biến động tích luỹ hàm lượng axit béo prostaglandin loài rong Gracilaria vermiculophylla LB Nga q trình ni phịng thí nghiệm Việt Nam Phân lập, nhận dạng chứng minh cấu trúc hoạt chất PGE2, PGE3 AA từ nguyên liệu rong Đỏ biển Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án - Luận án bổ sung cho kho liệu điều tra tài nguyên HCTN biển Việt Nam số liệu hàm lượng lipit, thành phần axit béo hàm lượng prostaglandin 70 mẫu đại diện cho 25 loài thuộc họ rong Đỏ biển Việt Nam, có so sánh với mẫu rong biển có giá trị kinh tế LB Nga - phương pháp phân lập, nhận dạng PGE2, PGE3 axit arachidonic rong đỏ biển với kết nghiên cứu động thái tích luỹ hoạt chất sở khoa học cho việc sàng lọc định hướng khai thác nguồn hoạt chất từ nguồn rong biển Việt Nam         Bố cục luận án Luận án gồm 133 trang, có 37 hình, 15 bảng, biểu đồ Bố cục luận án: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan (36 trang); Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu (13 trang), Chương 3: Thực nghiệm (8 trang); Chương 4: Kết thảo luận (60 trang); Kết luận kiến nghị (3 trang); Tài liệu tham khảo (9 trang); Ngồi cịn có 51 trang phụ lục với hình phổ, kết phân tích TLC, GC GC-MS, HPLC, NMR II NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN MỞ ĐẦU Phần mở đầu đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính thực tiễn, đối tượng nhiệm vụ nghiên cứu luận án CHƯƠNG TỔNG QUAN Trong phần tổng quan, luận án giới thiệu chung lớp chất lipit, axit béo (đặc biệt axit béo có hoạt tính sinh học axit arachidonic) prostaglandin phương pháp nhận dạng, phân lập lớp chất lipit, axit béo hợp chất AA, PG Luận án tổng hợp đánh giá tiềm nguyên liệu rong biển Việt Nam từ số cơng trình nghiên cứu rong biển, tập trung vào đối tượng rong Đỏ biển Việc đánh giá tổng quan tài liệu cho thấy, nguồn hoạt chất axit béo, đặc biệt eicosanoit prostaglandin có hoạt tính mạnh nồng độ thấp có nhiều ứng dụng làm thuốc Việc tìm kiếm nguồn hoạt chất từ nguồn nguyên liệu có khả tái tạo cao rong biển có ý nghĩa khoa học thực tiễn Đây vấn đề giới Việt Nam Ở Việt Nam, nghiên cứu đóng góp thêm số liệu điều tra lớp chất lipit hoạt chất sinh học từ lớp chất đối tượng rong Đỏ biển Nghiên cứu có giá trị thực tiễn cao mở triển vọng nuôi trồng, khai thác phát triển nguồn nguồn lợi rong biển phục vụ phát triển kinh tế vùng ven biển         CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu 69 mẫu họ thuộc ngành rong đỏ Rhodophyta họ: Gracilariaceae (47 mẫu loài), Hypneaceae (10 mẫu loài), Ceramiaceae (4 mẫu loài), Bangiaceae (2 mẫu loài), Hylamaniaceae (2 mẫu loài), Bonnemaisioniaceae (1 mẫu), Phyllophoraceae Halymeniaceae (1 mẫu) (1 mẫu), Rhodymeniaceae (1 mẫu), Vị trí thu mẫu: 68 mẫu thu biển Việt Nam từ Quảng Ninh đến Ninh Thuận; 01 mẫu thu vùng biễn Viễn Đông – Liên bang Nga 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp thu bảo quản mẫu Việc thu mẫu vùng triều dựa vào quy phạm tạm thời điều tra tổng hợp biển (phần rong biển) Uỷ ban KHKT Nhà nước ban hành năm 1981 Khảo sát vùng triều dựa vào tài liệu hướng dẫn Wilkinson & Baker 1997 thiết bị lặn SCUBA Mẫu rong biển sau thu (khoảng kg tươi) rửa nước mặn sau rửa nước bảo quản nhiệt độ≤ 4OC, sau chia đơi bảo quản tủ lạnh sâu -20OC -47OC 2.2.2 Phương pháp phân lập, tách chiết lipit, axit béo, AA, PG 2.2.2.1 Phương pháp chiết lipit tổng Chiết lipit tổng phương pháp đặc hiệu Bligh&Dyer, 1959, sử dụng hệ dung môi CHCl3 : CH3OH với tỉ lệ 1/2 (v/v) 2.2.2.2 Phương pháp phân lập axit béo, AA, PG Để phân lập axit béo, axit arachidonic, prostaglandin từ rong đỏ sử dụng phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC), sắc kí lớp mỏng điều chế, sắc kí cột áp xuất thường (CC), sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC)         2.2.3 Phương pháp xác định thành phần, hàm lượng cấu trúc axit béo, AA, PG 2.2.3.1 Các phương pháp xác định thành phần, hàm lượng hợp chất Thành phần hàm lượng axit béo xác định theo phương pháp ISO/FDIS 659:1998, sử dụng GC-FID GC-MS Xác định hàm lượng prostaglandin (dạng methyl silyl hoá) GC-MS 2.2.3.2 Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc hợp chất Sử dụng phương pháp phổ khối lượng ion hoá phun mù điện tử ESIMS, phổ khối bắn phá điện tử EI-MS, phổ khối phân giải cao LCMS-ITTOF, phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều 1H-NMR, 13CNMR, DEPT phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY 2.2.4 Phương pháp phân tích cấu tử Phương pháp phân tích cấu tử (PCA, Principle Component Analysis) phân tích chùm (cluster analysis) sử dụng để xử lý số liệu đa biến thành phần axit béo mẫu rong đỏ nhằm tìm mối tương quan chúng với Phần mềm Statistica-PCA 69 sử dụng để thực phép phân tích cấu tử phần mềm Surfer 32 sử dụng để thực phép phân tích chùm Các số liệu xử lý trước phân tích phần mềm Microsof Excel CHƯƠNG THỰC NGHIỆM Các mẫu tiến hành nghiên cứu theo sơ đồ chung sau:         3.1 Chiết tách xác định hàm lượng lipit tổng Cân 100 gam mẫu rong biển tươi, nghiền nhỏ máy xay, chiết hệ dung môi CHCl3:CH3OH tỉ lệ 1:2 (100ml CHCl3: 200ml CH3OH), siêu âm Bổ sung 100ml CHCl3, thêm 100ml nước cất, lắc đều, đợi phân lớp lấy phần dung dịch phía dưới, rửa lại nước cất thêm lần sau làm khan Na2SO4 Cô cất loại dung môi thu lipit tổng (phương pháp chiết lặp lại lần lấy giá trị trung bình) 3.2 Xác định thành phần hàm lượng axít béo Lấy 10mg lipit tổng hịa tan với 1ml n-hexan lọ nhỏ nút kín, bổ sung 25ml dung dịch CH3ONa 30% lắc kĩ phút Thêm vào 20mg Na2SO4 loại sạch, lắc kĩ đem ly tâm chế độ 5000 vòng/phút phút Dịch trong, pha tách riêng, kiểm tra sắc kí mỏng (TLC) Tiến hành phân tích máy sắc kí khí GC, nhận dạng axit béo phần mềm chun dụng, tính tốn chuyển đổi qua giá trị thời gian lưu tương đương ECL (Equivalent Chain Length) có sử dụng hệ chất chuẩn axit béo C16:0 C18:0 Kết tính theo công thức: 2(lg RTx – log T16:0) ECL = ±16 lg RT18:0 – lg RT16:0 3.3 Sàng lọc định tính, định lượng prostaglandin 3.3.1 Phân tích định tính prostaglandin Lấy 25g rong tươi, nghiền nitơ lỏng, bổ sung 50ml nước cất, khuấy máy khuấy từ thời gian 60 phút nhiệt độ 5-60C Nhỏ từ từ axit HCl đặc kiểm tra pH = 2-3, khuấy tiếp 60 phút Chiết etyl axetat 50ml (2 lần), để phân lớp thu phần dịch phía Cô cất chân không nhiệt độ < 300C thu cặn chiết etyl axetat Kiểm tra mỏng silicagel 60 GF254 với hệ dung môi dioxan:benzen:axit axetic (30:50:2), thuốc thử dung dịch H2SO4/MeOH 5%, phát định tính PGE2 có màu vàng nhạt, sử dụng chất chuẩn PGE2 có độ tinh khiết 93% cung cấp hãng sigma 3.3.2 Phân tích định lượng PGE2 mẫu rong Đỏ Dịch chiết etyl axetat metyl silyl hoá xác định hàm lượng PGE2 GC-MS Nhận dạng prostaglandin phần mềm chun dụng, tính tốn chuyển đổi qua giá trị thời gian lưu tương đương ECL, sử dụng hệ chất         chuẩn PGB2 PGE2 Tính tốn hàm lượng PGE2 có g rong tươi (µg/g rong tươi) 3.3.3 Khảo sát biến động tích luỹ prostaglandin axit béo trình sinh trưởng phát triển lồi rong câu Gracilaria vermiculophylla Nga ni PTN Việt Nam Mơ tả chi tiết cách bố trí thí nghiệm theo dõi sinh trưởng phát triển lồi rong G vermiculophylla ni phịng thí nghiệm Thu mẫu phân tích đánh giá biến động hàm lượng PG, axit béo 3.4 Phân lập prsotaglandin từ rong Đỏ 3.4.1 Phân lập PGE2 từ loài rong câu Gracilaria vermiculophylla Sơ đồ phân lập PGE2 gồm bước: Xử lí mẫu; Chiết dịch tổng etyl axetat; Phân lập tinh chế PGE2 HPLC điều chế • Các liệu phổ PGE2 phân lập được: Hợp chất phân lập dạng bột, màu vàng Điểm nóng chảy 65,5 – 660C Rf = 0,5 (TLC, silica-gel, C6H6 : EtOAc 1:1, màu vàng, H2SO4 10%/ MeOH) Phổ khối ESI-MS: m/z = 375 [M+Na]+ Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3 & CD3OD), δ ppm: 5,62 (1H, m, H14); 5.58 (1H, m, H-13); 5,43 (1H, m, H-5); 5,34 (1H, m, H-6); 4,06 (2H, m, H-11, H-15); 2,70 (1H, ddd, J = 1.5, 7.5, 18.0 Hz, H-10a); 2,42 (1H, m, H-12); 2,35 (2H, m, H-7); 2,29 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-2); 2,18 (1H, m, H-8); 2,17 (1H, m, H-10b); 2,09 (2H, m, H-4); 1,67 (2H, qd, J = 2,0; 7,5 Hz, H3); 1,58 (1H, m, H-16a); 1,48 (1H, m, H-16b); 1,30-1,40 (6H, m, H-17, H18, H-19) 0,91 (3H, t, J = 7.0 Hz, H-20) Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3 & CD3OD), δ ppm: 216,7 (C-9); 177,0 (C-1); 137,4 (C-14); 131,8 (C-13); 131,6 (C-5); 127,3 (C-6); 73,4 (C15); 72,5 (C-11); 55,3 (C-8); 53,9 (C-12); 47,1 (C-10); 37,9 (C-16); 34,1 (C-2); 32,5 (C-18); 27,4 (C-4); 26,0 (C-17); 25,6 (C-3); 25,5 (C-7); 23,3 (C-19) 14,3 (C-20) 3.4.2 Nhận biết PGE3 từ loài rong câu Gracilaria vermiculophylla Dịch chiết etyl axetat loài rong câu Liên bang Nga Gracilaria tenuistipitata tách thành phân đoạn cột thường Phân đoạn giàu PGE3 (phát TLC) phân tích phương pháp HPLC         lồi H japonica Ví dụ AA mẫu N10 N11 loài H flegelliformis hàm lượng đạt 0,33 0,1% lồi N6 lại lên tới 22,35% 4.1.2.3 Thành phần hàm lượng axit béo 12 mẫu thuộc họ rong Đỏ Ceramiaceae, Bangiaceae, Hylamaniaceae, Bonnemaisoniaceae, Phyllophoraceae, Rhodymeniaceae, Halymeniaceae Biểu đồ 4.2 Hàm lượng họ axit béo 12 mẫu thuộc họ rong Đỏ Đã xác định 47 axit béo C12 đến C24 Axit béo no: Hàm lượng SFA trung bình 65,05%, dao động từ 40,18% đến 76,92% PUFA: hàm lượng trung bình 13,47%, dao động từ 3,35% đến 36,12% 50% số mẫu khoảng 7,51% đến 12,78% HUFA: hàm lượng trung bình 9,48%, dao động từ đến 30,8% 50% số mẫu nằm khoảng từ 2,88% đến 11,67% Omega-3: Đã phát axit omega-3 mạch cac bon từ C18 đến C22 có hàm lượng trung bình 3,84%, dao động từ đến 17,67% Tiếp tục phát mẫu rong Đỏ có chứa DHA mẫu N4, lồi Liagora sp1, hàm lượng đạt 1,82% mẫu T2, loài Grateloupia lithophila, hàm lượng đạt 0,6% tổng axit béo Omega-6: Đã phát 10 axit omega-3 mạch cac bon từ C18 đến C23 có hàm lượng trung bình 9,6%%, dao động từ 2,1% đến 18,89% Thành phần omega-6 quan trọng AA (11/12) mẫu, điển hình mẫu T2, N9 (loài Grateloupia lithophila) hàm lượng AA đạt 16,1% 14,45%   12       Về số PUFA/SFA: Giá trị số thấp nhiều so với hai họ rong Câu rong Đơng, trung bình 0,24, dao động từ 0,04 đến 0,9 Về số n3/n6: Giá trị trung bình 0,54, dao động từ đến 2,44 Trong 12 mẫu có 50% số mẫu đạt mức >0,1 là: N4 (2,44), CC1 (1,67), N9 (0,97), N7 (0,6), T12 (0,35) N1 (0,24) 4.1.2.4 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến tích luỹ lipit hình thành axit béo rong Đỏ Chúng tơi tìm hiểu sâu biến động tích luỹ lipit axit béo hình thành chúng mẫu đặc trưng cho họ, chi loài rong Đỏ thu số vùng sinh thái biển • Đúc kết yếu tố ảnh hưởng sở số liệu mẫu rong Đỏ thu đảo Cồn Cỏ - Quảng Trị Cồn Cỏ - Quảng Trị đặc trưng vùng biển miền Trung có khí hậu chủ yếu nắng, nóng năm Chúng tơi nghiên cứu 11 mẫu 11 lồi thuộc họ rong Đỏ (bảng 4.3) đặc trưng cho họ rong Đỏ khác vùng sinh thái Kết nghiên cứu cho thấy việc sinh tổng hợp axit béo không khác biệt mẫu khác họ mà cặp mẫu lồi có quan hệ phát sinh sinh vật gần gũi (cùng chi) N2/N6, N4/N7 N5/CC2 Minh chứng qua hàm lượng AA (C20:4n-6) EPA (C20:5n-3) Chẳng hạn mẫu N6 hàm lượng AA cao (22,35%) mẫu N2 lại vằng mặt hoạt chất Tương tự mẫu N7 không phát AA EPA hàm lượng hoạt chất N4 1,7 6,24% tổng axit béo • Đúc kết yếu tố ảnh hưởng sở số liệu mẫu rong Đỏ thu khu vực Phù Long - Hải Phòng Khu vực Phù Long – Hải Phòng khu vực điển hình cho vùng biển Đơng Bắc, nơi có mùa đơng lạnh năm, tập trung nhiều lồi thuộc chi rong Câu Chúng tơi thu thập loài thuộc chi rong Câu khu vực Kết nghiên cứu cho thấy hàm lượng lipit mẫu mức trung bình thấp Về thành phần axit béo, chúng có đặc trưng tương tự họ rong Đỏ khác thu Cồn Cỏ - Quảng Trị (1) hàm lượng axit   13       béo no cao, (2) tỷ lệ hàm lượng axit béo no thấp hàm lượng axit béo không no PUFA HUFA cao ngược lại, (3) hàm lượng axit béo họ omega-6 cao omega-3 Các tính chất phù hợp với đặc trưng chung họ thuộc ngành rong Đỏ công bố trước Kết nghiên cứu cho thấy, chi rong câu Gracilaria có biến dị thành phần axit béo Ví dụ thấy rõ mẫu A22 (loài Gracilaria gigas) xuất axit mạch dài C21:0, C22:2n-6, C22:5n-3, C22:6n-3 (DHA) khơng phát lồi thuộc chi rong Câu • Đúc kết yếu tố ảnh hưởng sở số liệu mẫu rong Đỏ thu tỉnh khác khác Nghiên cứu tiến hành mẫu loài rong Câu vàng thu tỉnh, thành khác (từ Quảng Ninh đến Bình Thuận) mẫu xuất xứ từ mẫu T28 nuôi PTN Viện (nhiệt độ phịng ni 20-220C) để xem xét hình thành tích luỹ axit béo loài điều kiện sinh thái khác Kết nghiên cứu cho thấy, mẫu rong Câu vàng thu trải dài tỉnh khác tích luỹ lipit axit béo no khơng có nhiều biến động Điều đáng ý axit C20:4n-6 có mặt 8/8 mẫu, song hàm lượng khác biệt Điều cho thấy hình thành tích luỹ axit béo nhóm axit béo khơng no định vào chất sinh học loài song chịu tác động không nhỏ điều kiện tự nhiên Khi so sánh mẫu rong Câu vàng (Gracilaria tenuistipitata) thu tự nhiên (mẫu T28) mẫu nuôi PTN, hàm lượng lipit tổng khơng thay đổi đáng kể nhiên thành phần axit béo biến động đáng ý Mẫu rong nuôi phát sinh thêm axit C15:1n-7, C15:1n-5, C16:1n9, C17:0 C20:3n-6 Hàm lượng axit C16:0 đặc trưng cho họ axit béo no mẫu rong thu tự nhiên giảm 23,2% so với tổng axit béo axit C20:4n-6 tăng 10,03% Như nhận định điều kiện nhiệt độ trình sinh trưởng rong ảnh hưởng lớn đến thành phần hàm lượng axit béo theo hướng giảm axit béo no tăng axit béo không no   14       4.1.3 Sử dụng phương pháp PCA phương pháp phân tích chùm để xử lý tập liệu thành phần axit béo mẫu rong đỏ Từ 69 mẫu rong Đỏ xác định 12 axit béo yếu C14:0, C15:0, C16:0, C16:1n-7, C18:0, C18:1n-9, C18:1n-7, C18:2n-6, C20:3n-6, C20:4n-6, C20:5n-3 C22:0 Các mẫu rong Đỏ phân bố giản đồ chiều hình 4.1 thể rõ rệt họ Gracilariaceae, Hypneaceae, Ceramiaceae Hình 4.1 Kết phân tích PCA lồi rong Đỏ 2.50 F2 Ban2 Hyl1 Rho 2.00 1.50 Gra31 Gra28 Gra19 Gra18 Gra27 Gra24 Gra12 Gra21 Gra30 Gra36 1.00 Gra32 Gra29 Gra10 0.50 0.00 -0.50 Gra39 Gra11 Ban1 Gra35 Gra6 Gra25 Gra13 Gra3 Gra1 Gra40 Gra16 Gra41 Gra45 Gra46 Cer3 Gra14 Gra22 Gra43 Gra17 Gra7 Gra34 Gra2 Hyp10 Gra9 Gra44 Gra4 Cer1 Gra5 Hyp9 Gra8 Hyp5 Cer4 Hyp4 -1.00 Hyp2 -1.50 Bon Hyp6 Hal Gra23 Gra38 Gra26 Gra37 Gra42 Gra33 Gra20 Cer2 GraNga Hyp1 Hyp8 Hyp3 Hyp7 -2.00 Hyl2 Phy -2.50 Gra15 -1.50 -1.00 -0.50 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 F1 Sử dụng phần mềm SURFER 32, biểu diễn biểu đồ phân loại hình 69 mẫu rong đỏ theo liệu thành phần hàm lượng axit béo yếu hình 4.2 Hình 4.2 Sơ đồ phân loại 69 loài rong đỏ dựa vào thành phần hàm lượng axit béo yếu Tree Diagram for Variables Single Linkage Euclidean distances 25 Linkage Distance 20 15 10 GraNga Hyl2 Gra15 Ban2 Ban1 Gra11 Phy Hyl1 Hal Rho Hyp2 Gra8 Hyp9 Hyp8 Hyp10 Gra34 Hyp3 Gra44 Hyp6 Hyp4 Hyp1 Hyp7 Hyp5 Bon Gra23 Gra25 Gra9 Gra7 Gra4 Gra3 Gra38 Gra41 Gra33 Gra40 Gra29 Gra1 Gra10 Gra6 Gra5 Gra2 Gra45 Gra46 Gra42 Gra39 Gra37 Gra21 Gra26 Gra31 Gra32 Gra36 Gra30 Gra28 Gra24 Gra27 Gra19 Gra35 Gra18 Gra43 Gra20 Gra17 Gra12 Gra13 Gra16 Gra14 Gra22 Cer2 Cer1 Cer3 Cer4   15       4.2 Kết sàng lọc prostaglandin axit arachidonic từ loài rong đỏ thu thập 4.2.1 Kết khảo sát định tính PGE2 Chúng tơi tiến hành khảo sát định tính PGE2 mẫu rong Đỏ phương pháp sắc ký mỏng (TLC) Hình 4.3 Sắc kí lớp mỏng định tính PGE2 (a) Các mẫu có vết PGE2, (b) Các mẫu khơng có vết PGE2 Kết phân tích cho thấy có tín hiệu xuất PGE2 39 mẫu, tín hiệu rõ ràng mẫu rong Nga (kí hiệu TAX hay M0) 38 mẫu rong Đỏ Việt Nam Tuy nhiên, xuất tín hiệu khác nhau, đa phần mẫu xuất tín hiệu dạng vết, có mẫu xuất tín hiệu PGE2 rõ ràng mẫu T5, A3, A7, A16 4.2.2 Kết khảo sát định lượng PGE2 Kết phân tích định lượng PGE2 xác định 15 mẫu (T5, T22, T28, A3, A4, A5, A6, A7, A16, N3, N6, N9, CC2, T2 TAX) có hàm lượng PGE2 từ 0,3 – 21,52µg/g rong tươi Trong hàm lượng cao mẫu rong Câu Nga TAX (loài Gracilaria vermiculophylla), mẫu rong Câu Việt Nam mẫu A16 (loài Gracilaria gigas), mẫu T5 (loài Gracilaria tenuistipitata) với hàm lượng 3,6 3,4 µg/g rong tươi So sánh tương quan hàm lượng PGE2 AA 39 mẫu rong Đỏ (bảng 4.6) cho thấy, mẫu có hàm lượng AA cao có khả phát PGE2 hàm lượng cao ngược lại Tuy nhiên, tỉ lệ tương quan hàm lượng AA PGE2 họ rong Đỏ không giống   16       4.2.3 Khảo sát biến động tích luỹ hàm lượng axit béo, prostaglandin trình sinh trưởng phát triển loài rong câu Gracilaria vermiculophylla Nga nuôi PTN Việt Nam 4.2.2.1 Khảo sát sinh trưởng phát triển loài rong câu Gracilaria vermiculophylla điều kiện phịng thí nghiệm Kết nghiên cứu (bảng 4.7 biểu đồ 4.3) Biểu đồ 4.3 Tốc độ tăng sinh khối rong Câu G vermiculophylla Kết khảo sát cho thấy rong có khả sống ni điều kiện thí nghiệm với thời gian tháng Đặc biệt tháng đầu, tốc độ tăng trọng đạt 1-3%/ngày, sau rong bị chết ngừng sinh trưởng 4.2.2.2 Khảo sát biến động hàm lượng lipit axit béo trình sinh trưởng phát triển rong câu G vermiculophylla Kết khảo sát (bảng 4.8) cho thấy, hàm lượng lipit tổng sau tháng nuôi giảm dần từ 1,39% (mẫu M0, M1) xuống 0,55% (mẫu M5) Các axit béo no hàm lượng tăng từ 33,68 lên đến 55,76% tổng axit béo (tăng 60,4%) Hàm lượng axit béo không no PUFA omega-6 giảm tương ứng từ 49,41% 46,34% xuống 15,91% tổng axit béo tháng thứ Trong đặc biệt AA giảm từ 33,3% xuống 11,44% 4.2.2.3 Khảo sát biến động PGE2 rong câu Gracilaria vermiculophylla ni phịng thí nghiệm Kết phân tích hàm lượng PGE2 mẫu rong nuôi từ tháng 1-5 lấy mẫu thêm 01 mẫu M6 tháng thứ rong lụi bảng 4.9 Bảng 4.9 Hàm lượng PGE2 mẫu rong ni (µg/g rong tươi) Mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 Hàm lượng PGE2 21,52 18,33 8,26 5,21 3,16   17       Hàm lượng PGE2 giảm dần theo tháng q trình ni từ 21,52 (M0) xuống cịn 3,16 (M5) Có mẫu khơng phát PGE2 mẫu M2 (khi có sinh vật giáp xác phát triển mạnh) M6 (sau rong lụi) 4.3 Phân lập hoạt chất prostaglandin từ rong Đỏ Phân lập prostaglandin (PGE2, PGE3) theo sơ đồ hình 4.5 Hình 4.5 Sơ đồ phân lập PG từ rong câu Gracilaria vermiculophylla 4.3.1 Phân lập PGE2 từ loài rong Câu Gracilaria vermiculophylla 4.3.1.1 Khảo sát điều kiện phân lập PGE2 Đã xác định điều kiện nghiền mẫu: nitơ lỏng, thêm nước cất ủ điều kiện tối ưu Các thông số cho trình ủ để phân lập PGE2: nhiệt độ 3-60C, pH 2-3, thời gian: 2h 4.3.1.2 Tinh chế PGE2 Tách PGE2 cột silica gel với hệ dung môi etyl axetat:hexan:axit axetic biến đổi gradient (30:70:2 – 50:50:2 – 70:30:2), thu phân đoạn E1-E7 Tiếp tục tinh chế phân đoạn E6 HPLC điều chế thu PGE2 phút thứ 39 Độ tinh >90% 4.3.1.3 Xác định cấu trúc hoá học PGE2   18       Từ kết phân tích liệu phổ thu nêu cộng với so sánh với tài liệu tham khảo [89,91] cho phép xác định xác cấu trúc hóa học hợp chất thu prostaglandin E2 (PGE2) Bảng 4.12 Các liệu phổ 1H, 13C, COSY and HMBC NMR PGE2 TT H (δ, J in Hz) 2,29, t, 7.5 1.67, qd, 3.0, 7.5 2,09, m 5,43, m 5,34, m 2,35, m 2,18, m 11 2,70, ddd, 1.5, 7.5, 18.0 2,17, m 4,06, m 12 2,42, m 13 14 15 5,58, m 5,62, m 4,06, m 1,58, m 1,48, m 1,33, m 1,33 m 1,35 m 0,91, t, 7.5 10 16 17 18 19 20 Hợp chất PGE2 13 C HMBC (δ, ppm) 177,0 , H-3 34,1 H-3, H-4 25,6 H-4, H-2 27,4 H-6, H-2, H-3 131,6 H-7, H-3, H-4 127,3 H-7, H-8 25,5 H-5, H-8 55,3 H-7 216,7 H-10, H-7 47,1 H-13, H-10 53,9 H-14,H-10 H-11, H-12, H-15 H-12, H-15 H-13 37,9 26,0 32,5 23,3 14,3   19   H-10, H-12 H-11, H-13, H-8 H-12, H-14 H-13, H-15 H-14, H-16 H-15, H-17 H-16 H-19, H-20, H-17 H-20 H-19 Prostaglandin E2   H-3 H-2, H-4 H-3, H-5 H-4, H-6 H-5, H-7 H-6, H-8 H-7, H-12 H-10b, H-11 H-11 72,5 131,8 137,4 73,4 COSY H-16, H-18 H-17, H-19 H-18, H-20 H-19   4.3.2 Nhận biết prostaglandin E3 Trên phổ khối phân giải cao LCMS-IT-TOF xác định hợp chất phân lập từ phân đoạn E5 PGE3 ! Hình 4.16 Phổ LCMS PGE3 4.3.3 Bàn luận chuyển hoá axit béo họ eicosanoit thành prostaglandin enzyme nội sinh từ rong Đỏ Các kết nghiên cứu cho thấy mẫu rong Nga Gracilaria vermiculophylla hàm lượng AA cao (33% tổng axit béo) chứa lượng đáng ý EPA (2,08% tổng axit béo) Đây tiền chất cho trình sinh tổng hợp prostaglandin có nối đơi Điều nguyên nhân trực tiếp phát sinh PGE2 PGE3 thu trình phân lập hoạt chất từ mẫu rong Đây mẫu xem nguồn nguyên liệu tiềm cho việc thu nhận prostaglandin 4.4 Phân lập axit arachidonic từ lồi rong Câu vàng Gracilaria tenuistipitata 4.4.1 Quy trình phân lập axit arachidonic (hình 4.17) 4.4.2 Thuỷ phân lipit tổng Quá trình thủy phân sử dụng KOH dung môi etanol Điều kiện tiến hành phản ứng thủy phân sau: Thời gian 120 phút; Nồng độ cồn 70%; Nhiệt độ 750C Hàm lượng AA sau thuỷ phân 12,18%   20       4.4.3 Nghiên cứu làm giàu AA phương pháp tạo muối với LiOH Hỗn hợp axit béo tạo muối với LiOH axeton, muối axit béo no kết tủa lọc để loại Các điều kiện tối ưu cho phản ứng là: Thời gian 60 phút; Tỉ lệ LiOH/axit béo 2:1; Nhiệt độ phản ứng từ 35oC ÷ 40oC Hàm lượng AA sau phản ứng 69,71% Hình 4.17 Sơ đồ phân lập axit arachidonic từ loài rong Câu vàng Gracilaria tenuistipitata 4.3.4.4 Tinh chế axit arachidonic chứng minh cấu trúc Tinh chế axit arachidonic từ hỗn hợp axit béo sau làm giàu HPLC Shimadu – LC8A, cột SDSH C-18 (250mm x 50mm, ID 10µm) thu axit arachidonic dạng etyl este   21       Các liệu phổ thu nêu cộng với so sánh với tài liệu tham khảo [96,107] cho phép xác định xác cấu trúc hóa học hợp chất thu etyl arachidonat Bảng 4.14 Các liệu phổ 1H, 13C, COSY and HMBC NMR STT H (δ, J in Hz) etyl arachidonat C HMBC (δ, ppm) 173,5 H-21; H-2; H-3 33,7 H-3, H-4 25,6 H-2, H-4, H-5 26,5 H-2, H-3, H-5 127,8 H-7, H-4 127,5 H-7 25,6 H-8, H-9 128,9 H-7, H-10 128,8 H-10 25,6 H-12 128,5 128,1 H-13 24,8 128,1 H-13 130,4 H-13, H-16 27.2 H-17 29,3 H-16 31,5 H-6, H-17, H20 22,5 H-17,H-20,H-18 14,1 H-18 13 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2,30 1,70 2,10 5,37 5,37 2,80 5,37 5,37 2,80 5,37 5,37 2,80 5,37 5,37 2,06 1,35 1,30 1,30 0,90 21 4,12 60.2 H-22 H-22 22 1,27 14,2 H-21 H-21   22     COSY H-3 H-2, H-4 H-3, H-5 H-4, H-6 H-5, H-7 H-6, H-8 H-7, H-9 H-8, H-10 H-9, H-11 H-10, H-12 H-13 H-12, H-14 H-13, H-15 H-14, H-16 H-15, H-17 H-16, H-18 H-19, H-20 H-18, H-20 H-19   KẾT LUẬN Lần Việt Nam, nghiên cứu sàng lọc toàn diện hàm lượng lipit tổng, thành phần axit béo, axit arachidonic prostaglandin 70 mẫu rong Đỏ thu biển Việt Nam 01 mẫu rong Đỏ thu biển Viễn Đông - Liên bang Nga Đã xác định hàm lượng lipit tổng 70 mẫu 25 loài thuộc họ rong Đỏ, 64 mẫu 21 loài hàm lượng nằm khoảng từ 0,118-0,449% khối lượng tươi, mẫu lồi thuộc họ rong Đơng (Hypneaceae) hàm lượng lipit tổng lên đến 0,6-0,73% Riêng mẫu loài rong Câu Nga hàm lượng lipit tổng 1,39 khối lượng rong tươi, gấp 2-10 lần so với mẫu rong Việt Nam Đã xác định thành phần hàm lượng axit béo 70 mẫu nghiên cứu đánh giá nhóm axit béo có giá trị cao thuộc dãy omega-3, omega-6, axit béo không no thiết yếu PUFA HUFA Trong đặc biệt tìm thấy axit C20:4n-6 (AA), C20:5n-3 (EPA) có hàm lượng cao nhiều mẫu rong Đỏ Lần xác định axit C22:6n-3 (DHA) có mẫu rong Đỏ, mẫu cao lồi Hypnea flagelliformis (Grev.) có hàm lượng 2,61% tổng axit béo Các kết cho phép phát số cá thể đặc biệt họ, cụ thể mẫu A5, A3, T28, T5, T29, A16, A17 (thuộc họ Gracilariaceae), mẫu N6 (họ Hypneaceae), mẫu N9 họ Hylamaniaceae Các mẫu có hàm lượng axit béo quý vượt trội (mẫu N9, N6, A5, A3, T28, T5), có số PUFA/SFA omega-3 / omega-6 cao, thích hợp làm chất bổ sung dinh dưỡng (mẫu T29, N6, A3, A16, A17, T28), xứng đáng nghiên cứu kỹ lưỡng để chọn giống có tính chất ưu việt cho thu hái ni trồng Qua nghiên cứu việc hình thành tích luỹ lipit axit béo mẫu đặc trưng cho họ, chi loài ngành rong Đỏ vùng sinh thái khác rút kết luận sơ bộ: Sự hình thành tích luỹ lipit axit béo rong Đỏ chịu tác động không nhỏ điều kiện tự nhiên vùng biển thu mẫu, dinh dưỡng, độ sâu mà rong phân bố đặc biệt   23       nhiệt độ theo hướng giảm hàm lượng axit béo không no tăng axit béo no nhiệt độ môi trường sống rong giảm Kết phân tích PCA phân tích chùm tập số liệu 12 thành phần axit béo yếu (là C14:0, C15:0, C16:0, C16:1n-7, C18:0, C18:1n-9, C18:1n-7, C18:2n-6, C20:3n-6, C20:4n-6, C20:5n-3, C22:0) 69 mẫu rong đỏ thu cho phép phân biệt rõ ràng mẫu thuộc họ Gracilariaceae, Hypneaceae Ceraminaceae mối liên hệ chúng với Đã xác định hàm lượng PGE2 loài rong Câu Nga Gracilaria vermiculophylla (Ohmi) Papenf 21,52 µg/g rong tươi cao gấp 6-20 lần, trung bình 10 lần mẫu rong Đỏ Việt Nam Đã xác định định lượng PGE2 có 14 mẫu rong Việt Nam có hàm lượng từ 0,3 đến 3,6 µg/g rong tươi Từ xác định số lồi rong có tiềm để khai thác hoạt chất prostaglandin loài rong Câu Gracilaria vermiculophylla (Ohmi, Papenf.) (Liên bang Nga), 02 loài rong Câu Việt Nam Gracilaria tenuistipitata (Zhang et Xia) Gracilaria gigas (Harv.) Đã khảo sát biến động axit béo prostaglandin loài rong Gracilaria vermiculophylla (Ohmi) Papenf thu từ biển Viễn Đông – LB Nga q tình ni (từ 8/11/2011 đến 30/3/2012) phịng thí nghiệm Việt Nam Trong đó: Hàm lượng axit béo no tăng dần theo thời gian nuôi từ 33,68% lên đến 68,89%; Hàm lượng axit béo không no đặc biệt PUFA có AA), giảm dần theo thời gian ni từ 49,41 xuống cịn 15,91% tổng axit béo; Hàm lượng PGE2 q trình ni lồi rong Câu phịng thí nghiệm giảm từ 21,52 xuống cịn 3,16 µg/g rong tươi Đã xây dựng quy trình phân lập prostaglandin E2 từ lồi rong Gracilaria vermiculophylla (Ohmi, Papenf.) Lần chiết xuất, làm giàu nhận dạng prostaglandin E3 từ loài rong Câu Gracilaria vermiculophylla (Ohmi, Papenf.) Đã xây dựng đươc quy trình phân lập axit arachidonic từ lồi rong Câu vàng Gracilaria tenuistipitata Zhang et Xia   24       KIẾN NGHỊ Các lồi rong có khả tích lũy lipit cao A5, A3, T28, T5, T29, A16, A17 (thuộc họ Gracilariaceae), mẫu N6 (họ Hypneaceae), mẫu N9 họ Hylamaniaceae, có hàm lượng PUFA số PUFA/SFA n-3/n-6 cao (các mẫu T29, N6, A3, A16, A17, T28) cần nghiên cứu kỹ để làm nguồn nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức cho mục đích kinh tế khác Các lồi rong Việt Nam có hàm lượng PGE2 hàm lượng AA cao cần nghiên cứu thu hái nuôi trồng để làm nguồn nguyên liệu sản xuất prostaglandin E2 thực vật Cần tiếp tục nghiên cứu sâu thành phần hố học, chất có hoạt tính sinh học cao số lồi rong Đỏ có tiềm để có sở khai thác chế biến sản phẩm từ rong Đỏ nhằm phát triển kinh tế vùng ven biển Việt Nam CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN A.B.Imbs N.A., Latyshev V.I., Svetashev A.V., A Skriptsova, Thanh L.T., Quan P.M., Son N.V and Long P.Q., (2012), Distribution of polyunsaturated fatty acids in red algae of the genus Gracilaria, a promising source of prostaglandins, Russian Journal of Marine Biology, ISSN :1063- 0740, Vol: 38, Issue: 4, pp 318-325 V.G Rybin, V.I Svetashev, A.B Imbs, T.T Le, L.Q Pham, and H.V Ha (2013), Detection of prostaglandin E3 in the red alga Gracilaria vermiculophylla, Chemistry of Natural Compounds Vol 49, No 3, July Lê Tất Thành, Nguyễn Văn Tuyến Anh, Nguyễn Thị Hương Liên, Nguyễn Văn Trung, Đàm Đức Tiến, A.V Skriptsova, A.B Imbs, Phạm Quốc Long (2012), Bước đầu khảo sát số điều kiện sinh trưởng phát triển rong biển Gracilaria vermiculophylla nuôi điều kiện phịng thí nghiệm, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ số 50, tập 3A, trang 320-326 Lê Tất Thành, Nguyễn Văn Tuyến Anh, Nguyễn Thanh Hòa, Nguyễn Thị Nguyệt, Đàm Đức Tiến, Đoàn Lan Phương, Phạm Quốc Long (2013), Khảo sát hàm lượng lipit thành phần axit béo rong biển chi Hypnea, Tạp chí hóa học tập 6ABC, trang 49-53   25       Lê Tất Thành, Hồng Thị Bích, Nguyễn Văn Tuyến Anh, Nguyễn Thị Thủy, Đinh Thị Thu Thủy, Vũ Thị Oanh, Đỗ Trung Sỹ, Đàm Đức Tiến, Phạm Quốc Long (2013), Nghiên cứu thu nhận lipit giàu axit béo họ eicosanoid từ trình sản xuất agar, Tạp chí khoa học cơng nghệ số 51, tập 6A, trang 183-188 Lê Tất Thành, Nguyễn Văn Tuyến Anh, Trần Quốc Tồn, Hồng Thị Bích, Hà Việt Hải, Lê Xn Hưng, Dương Nghĩa Bang, Đàm Đức Tiến, Đỗ Trung Sỹ, Phạm Quốc Long (2014), Nghiên cứu quy trình phân lập axit Arachidonic từ rong câu Việt Nam, Tuyển tập Hội nghị khoa học toàn quốc sinh học biển phát triển bền vững lần thứ hai, trang 729- 734 Lê Tất Thành, Trần Quốc Toàn, Nguyễn Văn Tuyến Anh, Hồng Thị Bích, Hà Việt Hải, Đàm Đức Tiến, Nguyễn Thị Kiều Oanh, A.B Imbs, Đỗ Trung Sỹ, Phạm Quốc Long (2014), Nghiên cứu quy trình cơng nghệ phân lập prostaglandin E2 từ rong câu vàng Việt Nam (Gracilaria tennuispititata Zhang et xia), Tuyển tập Hội nghị khoa học toàn quốc sinh học biển phát triển bền vững lần thứ hai, trang 717- 723 Lê Tất Thành, Phạm Minh Quân, Nguyễn Văn Tuyến Anh, Đàm Đức Tiến, Đỗ Trung Sỹ, Phạm Thu Huế, Phạm Quốc Long (2015), Nghiên cứu sử dụng liệu axit béo phân loại hóa thực vật (Chemotaxonomy) lồi rong đỏ, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Biển số 3/2015   26     ... (sau rong lụi) 4.3 Phân lập hoạt chất prostaglandin từ rong Đỏ Phân lập prostaglandin (PGE2, PGE3) theo sơ đồ hình 4.5 Hình 4.5 Sơ đồ phân lập PG từ rong câu Gracilaria vermiculophylla 4.3.1 Phân. .. CHCl3 : CH3OH với tỉ lệ 1/2 (v/v) 2.2.2.2 Phương pháp phân lập axit béo, AA, PG Để phân lập axit béo, axit arachidonic, prostaglandin từ rong đỏ sử dụng phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC), sắc... phương pháp phân tích chùm để xử lý tập liệu thành phần axit béo mẫu rong đỏ, tìm mối quan hệ mẫu với với thành phần axit béo - Sàng lọc hoạt chất prostaglandin axit arachidonic mẫu rong Đỏ biển