Mục tiêu: Mô tả tỷ lệ và đặc điểm các kiểu đột biến gen kháng Lamivudine trên bệnh nhân chưa đáp ứng với trị liệu Lamivudine >12 tháng.. Xét nghiệm xác định đột biến kháng Lamivudine đư
Trang 1ĐẶC TÍNH KHÁNG LAMIVUDINE TRÊN BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN KHÔNG ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU TRỊ TẠI BV BỆNH NHIỆT ĐỚI
Phạm T Lệ Hoa*, Nguyễn Hữu Chí*, Cao Ngọc Nga*, Nguyễn T Cẩm Hường*, Phạm Hùng Vân**
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Lamivudine được dùng đơn trị liệu viêm gan B mạn từ cuối thập niên 1990 tại VN, gây
đáp ứng mạnh và hữu hiệu nhưng mất dần khi dòng virút kháng thuốc xuất hiện và trở nên ưu thế Tỷ lệ kháng Lamivudine tăng dần theo thời gian trị liệu gồm 4 vị trí đột biến chủ yếu trên cấu tạo gen polymerase (173, 180, 204, 207) Tỷ lệ hiện diện các đột biến này mới được vài báo cáo tại Việt Nam
Mục tiêu: Mô tả tỷ lệ và đặc điểm các kiểu đột biến gen kháng Lamivudine trên bệnh nhân chưa đáp
ứng với trị liệu Lamivudine >12 tháng
Phương pháp: Khảo sát mô tả cắt ngang thực hiện tại BV Bệnh Nhiệt Đới từ tháng 06/2006 đến tháng
12/2006 Xét nghiệm xác định đột biến kháng Lamivudine được thực hiện bằng kỹ thuật giải trình tự phát hiện kháng hoàn toàn và không hoàn toàn (với khả năng phát hiện chủng kháng không hoàn toàn khi tỷ lệ chiếm ≥15% quần thể chung)
Kết quả: Có 146 ca viêm gan B mạn được xác định không đáp ứng với trị liệu Lamivudine >12 tháng
Tỷ lệ có ít nhất một điểm đột biến trên polymerase của HBV là 34,9% (51/146 ca) Kiểu đột biến chính M204V/I gặp nhiếu nhất 77 /146 ca (24,7% có đột biến hoàn toàn và 28,1% có đột biến không hoàn toàn) Kết hợp đột biến M204V/I với L180M có tỷ lệ ưu thế (18/24 ca) trong các trường hợp có nhiều đột biến Kiểu gen B có tỷ lệ đột biến cao hơn (67%) so với kiểu gen C (34%) Kháng không hoàn toàn với hiện diện song song chủng hoang dại và kháng thuốc cũng hay gặp trong kiểu đột biến chính (37/56 ca M204I và 4/21
ca M204V)
Kết luận: Đột biến trên polymerase được chọn lọc dưới áp lực của Lamivudine gặp với tỷ lệ 34,9% trên
người trị liệu lamivudine trên 12 tháng Kiểu đột biến M204V/I chiếm ưu thế Kiểu gen B có tỷ lệ đột biến cao hơn Có tình trạng kháng không hoàn toàn nhất là trong kiểu đột biến chính M204I và M204V Tình trạng kháng thuốc kiểu gen cần được lưu ý bởi các thầy thuốc lâm sàng trong những trường hợp không đáp ứng với điều trị lamivudine kéo dài để định hướng cho việc thay đổi thuốc trị liệu
ABSTRACT
GENOTYPIC RESISTANCE AMONG PATIENTS WITH CHRONIC HEPATITIS B TREATED BY
LAMIVUDINE AT HOSPITAL FOR TROPICAL DISEASES
Pham Thi Le Hoa, Nguyen Huu Chi, Cao Ngoc Nga, Nguyen Thi Cam Huong, Pham Hung Van
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 12 – Supplement of No 1 - 2008: 120 - 124
Background: Lamivudine was the first oarl nucleoside analogue monotherapy for chronic hepatitis B in
VietNam since 1992 However, the response will fade away with clinical deterioration as the HBV mutants become prominent The rate of lamivudine resistance increased with the duration of treatment The resistance mutations on the polymerase gene, like rt173, rt180, rt204 and rt207 have aldready been documented The preliminary results of the study on HBV resistannce in HCM city has just been reported
Objectives: To describe the rates and characteristics of lamivudine resistant mutations in patients with
lamivudine treatment-on >12 months
* Bộ Môn Nhiễm – Đại học Y Dược TP HCM
** Bộ Môn Vi sinh – Đại học Y Dược TP HCM
Trang 2Methods: The cross-sectional study was done in the out-patient clinic at Hospital for Tropical Diseases
from June 2006 to December 2006 The PCR-based sequencing technique were applied to detect the complete and heterozygote or mixed mutation in the polymerase
Results: 146 cases were enrolled in our study 51/146 (34.9%) cases with at least one mutation were
detected The rate of primary resistance mutation rtM204V/I were highest: 24.7% complete and 28.2% mixed The double mutation rtM204V/I + rtL180M (18/24 cases) were prominent among the double or triple ones HBV genotype B had higher rate of mutation in comparison with HBV genotype C (67% vs 34%) Co-existence of wild type and mutants were also common in the primary resistance mutation (37/56 cases with rtM204I and 4/21 cases with rtM204V)
Conclusion: The rate of resistance mutation on the polymerase gene were 34.9% in the
lamivudine-treated patients with the duration more than 12 months The rtM204V/I was classified in the first rank The mutation rate of HBV genotype B was higher than HBV genotype C The high rate of co-existence of wild type and mutants, especially with rtM204V/I was observed in our study The genotypic resistance should be paid attention by the clinician, especially in poor responders or refractory cases in order to select an rational strategy for the individual cases
ĐẶT VẤN ĐỀ
Lamivudine là thuốc chống virút được dùng
đơn trị liệu viêm gan B mạn gây đáp ứng ức chế
virút mạnh, đáp ứng sinh hóa và mô học hữu
hiệu Các đáp ứng trên bị mất dần khi xuất hiện
dòng virút kháng thuốc, có thể dẫn đến viêm
gan bùng phát, suy gan cấp nặng và tử vong
Tỷ lệ kháng Lamivudine tăng dần từ 17%
sau 1 năm, 22% và 37% sau 2 và 3 năm, trên 50%
sau 4 năm (Kao 2002)(3) Có 4 vị trí đột biến kiểu
gen chủ yếu trên cấu tạo gen polymerase (173,
180, 204, 207) ảnh hưởng đến đáp ứng với
lamivudine và hoạt động sao chép của virút Tại
Viêt Nam, dùng kỹ thuật giải trình tự gen đã
phát hiện được cả 4 loại đột biến điểm trên ở
người điều trị lamivudine và bước đầu đã có
được vài báo cáo (Hồ Tấn Đạt 2006)(2) nhưng
hình thái vẫn chưa đầy đủ
Mục tiêu
Mô tả tỷ lệ và đặc điểm các kiểu đột biến
kháng Lamivudine ở bệnh nhân chưa đáp ứng
trị liệu Lamivudine >12 tháng
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu mô tả cắt ngang thực hiện trên
bệnh nhân đã điều trị viêm gan B mạn bằng
lamivudine thời gian >12 tháng chưa đáp ứng,
chưa chuyển đổi huyết thanh HBeAg và/hoặc có
HBVDNA >1000 copy/ml, theo dõi khám tại
khoa khám bệnh BV Bệnh Nhiệt đới từ tháng 06/2006 đến tháng 12/2006
Biến số nghiên cứu: Tuổi, giới, kiểu gen, đột biến trên trình tự nucleotide của vùng b hay c trên polymerase (vị trí 173, 180, 204, 207)
Xét nghiệm xác định đột biến kháng Lamivudine được thực hiện bằng kỹ thuật giải trình tự trên hệ thống mở, phát hiện kháng hoàn toàn và không hoàn toàn (với khả năng phát hiện chủng kháng không hoàn toàn khi tỷ lệ chiếm ≥15% quần thể chung) Nhập và phân tích
số liệu dùng phần mềm SPSS 12.0, phép kiểm Chi Bình Phương để so sánh các tỷ lệ, mức ý nghĩa p<0,05
KẾT QUẢ Đặc điểm dân số nghiên cứu
Bảng 1: Đặc tính dân số nghiên cứu
Tuổi trung bình 34,8 ± 17,8 (4-68)
Có đột biến Hoàn toàn 51 34,9
Không hoàn toàn 34 23,2
Trang 3Đặc tính kháng thuốc
Cĩ 51/146 trường hợp cĩ đột biến kháng
lamivudine hồn tồn ở ít nhất một vị trí, chiếm
tỷ lệ 34,9% (bảng 1 & 2) Đột biến chính tại vi trí
M204I/V chiếm ưu thế, 36/146 ca, 24/7% (19 ca
M204I và 17 ca M204V) Đột biến tại vị trí 180
(L180M, 15,1%) chiếm hàng thứ hai, đột biến
M207V/I cũng cĩ tỷ lệ 13,7%
Đột biến khơng hồn tồn (heterozygote) với
một fần dân số virút hoang dại bị thay thế bởi
dịng đột biến cũng hay gặp, nhiều nhất tại vị trí
204 (41 ca, 28,1%) trong đĩ M204I (37ca) chiếm
đa số trương hợp đột biến khơng hồn tồn (so
với chỉ cĩ 4 ca M204V khơng hồn tồn) (bảng 2,
hình 1)
Ngồi ra, cĩ 24 trường hợp cĩ đột biến kết
hợp từ 2-4 vị trí đột biến (22 trường hợp cĩ kết
hợp 2 điểm đột biến, 2 trường hợp cĩ cùng lúc 3 điểm đột biến), tất cả các trường hợp này đều cĩ đột biến nền M204V hay M204I
Hiện diện đồng thời đột biến nguyên phát
M204I/V với đột biến thứ phát L180M thường
gặp nhất (23/24 ca) trong các trường hợp cĩ kết hợp nhiều đột biến Chỉ 1 trường hợp kết hợp đột biến M204I + V173L
Bảng 2: Phân loại theo vị trí đột biến trên cấu trúc
men reverse transcriptase (n=146)
Kháng hồn tồn
Kháng khơng hồn tồn
T ng s ố
V ị trí đ i ể m độ t
bi ế n
T n s ố T l T ầ n s ố T ỷ ệ T ầ n s ố T ỷ ệ
Cĩ ít nhất 1 điểm 51 34,9 34 23,2
173 2 1,4 15 10,3 17 11,7
207 20 13,7 0 0 20 13,7
V173L L180M M204I/V V207M/I
Kháng 1,4 15,1 24,7 13,7 Khơng HT 10,3 5,4 28,1 0
T ng số 11,7 20,5 52,7 13,7
Hình 1: Tính chất và tỷ lệ đột biến kháng lamivudine
Khảo sát trong tất cả trường hợp kháng hồn
tồn (85 trường hợp), genotype B cĩ tỷ lệ kháng
thuốc nhiều hơn genotýp C (67.6% so với 34.1%)
(bảng 3), khác biệt rõ nhất trong đột biến kháng
ở vị trí 180 (24.8% so với 9.8%) và 204 (60% so
với 34.1%) trên cấu tạo của polymerase
Bảng 3: Tỷ lệ đột biến kháng thuốc theo kiểu gen
Ki ể u gen
V ị trí độ t bi ế n Cĩ độ t
P
T t cả vị trí 85 71 (67,6) 14 (34,1) 0,000
Độ t bi ế n hồn tồn 51 42 (40,0) 9 (22,0) 0,040
Vị trí 173 17 13 (12,4) 4 (9,8) 0,657
Vị trí 180 30 26 (24,8) 4 (9,8) 0,044
Vị trí 204 77 63 (60) 14 (34,1) 0,005
Vị trí 207 19 17 (16,2) 2 (4,9) 0,068
67.6**
24.8*
60**
23.8*
16.2*
0 10 20 30 40 50 60 70
C hu
ng 17 3 18 0 20 4 20 7
20 4&
18 0
20 4&
20 7
B C
Biểu đồ 1: Tỷ lệ đột biến theo kiểu gen
Khơng cĩ khác biệt về tỷ lệ kháng thuốc của hai giới, ngoại trừ tỷ lệ kháng 207 ở nữ nhiều hơn nam (22,2% so với 8,9%)
YMDD
POLYMERASE (RT)
Trang 4BÀN LUẬN
Đột biến thay thế acid amin trên vùng B
(L180M) và C (M204V/I) trên cấu tạo polymerase
của HBV là đột biến được chọn lọc dần trong quá
trình điều trị Lamivudine kéo dài Sự thay đổi
M204V/I làm biến đổi cấu hình cấp 2 trong không
gian của túi YMDD, vị trí gắn của lamivudine trên
polymerase, gây giảm khả năng gắn kết
lamivudine, nhưng đồng thời làm giảm khả năng
sao chép của HBV do polymerase họat động kém
hiệu quả hơn Sự xuất hiện thêm các đột biến thứ
phát là kết quả của quá trình chọn lọc tạo nên
chủng virút thích hợp vừa kháng thuốc vừa giữ
được khả năng sao chép Thí dụ phổ biến là việc
xảy ra thêm đột biến L180M khi có sẵn đột biến
M204 Đột biến kép L180M kết hợp M204V/I vừa
sao chép mạnh, vừa kháng lamivudine (Warner
2007)(5) Đột biến V173L không gây kháng
lamivudine, nhưng sự thay thế Valine bằng
Leucine phục hồi khả năng sao chép cho chủng
virus đã có đột biến M204V/I và L180M Như vậy,
trình tự xảy ra đột biến trên bệnh nhân được điều
trị lamivudine trước tiên thuờng là ở vị trí 204
(M204I hay M204V), tiếp theo là L108M và sau đó
là V173L Do vậy trên thực tế có thể quan sát thấy
kiểu kết hợp đột biến V173L-L180M-M204I hay
V173L -L180M-M204V
Về tỷ lệ đột biến trong nghiên cứu
Do bệnh nhân thường khó xác định được
đúng thời gian đã dùng Lamivudine, tỷ lệ đột
biến trong nghiên cứu là tỷ lệ sau điều trị tối
thiểu 1 năm Chúng tôi phát hiện được 34,9% có
đột biến trên polymerase liên quan với kháng
lamivudine Tỷ lệ đột biến tại vị trí 204 chiếm đa
số, phù hợp với quá trình chọn lọc nên đột biến
nguyên phát và tương tự với các nghiên cứu
trong và ngoài nước (27,8% sau 1 năm của Hồ
Tấn Đạt tại TP HCM; 17-32% theo báo cáo của
khu vực và thế giới sau 1 – 2năm) Sự khác biệt
về trị số có lẽ do khác nhau trong chọn mẫu
Trong nghiên cứu của chúng là chọn trên những
bệnh nhân đến khám bệnh sau khi điều trị chưa
đáp ứng, vì vậy do không có dữ liệu về những
trường hợp mất theo dõi nên tỷ lệ có đột biến thật sự có thể thấp hơn
Về tình trạng đột biến không hoàn toàn hay kháng hỗn hợp
Chúng tôi nhận thấy có tình trạng tồn tại song song của quần thể virút đột biến và quần thể virút hoang dại với tỷ lệ đáng kể (heterozygote detection), nhất là tại vị trí 204 Trong các truờng hợp kháng không hoàn toàn hay hỗn hợp này, cũng gặp đột biến ở các vị trí
173 và 180 nhưng tỷ lệ ít hơn vị trí 204, chứng minh rằng quá trình xuất hiện dần của đột biến vẫn đang tiếp tục dưới áp lực của lamivudine, phản ánh quá trình thay đổi thứ phát đang được chọn lọc sau khi đã có đột biến nguyên phát Điều này giải thích sự gia tăng dần tỷ lệ đột biến theo thời gian tiếp xúc với thuốc
Mặt khác, tính chất kháng hỗn hợp với tồn tại vừa chủng hoang dại vừa chủng kháng cho thấy tính chất phức tạp của việc đối phó với kháng thuốc Quyết định theo hướng phối hợp thuốc hay chuyển hẳn sang thuốc nhóm tác dụng khác cần được cân nhắc và nghiên cứu để
có hướng dẫn thích hợp
Về bản chất của đột biến tại vị trí 204
Trên các nghiên cứu ở vùng lưu hành của týp gen A và D, thay đổi Methionin thành Valine (rtM204V hay YMDD) gặp nhiều hơn thay đổi Methionin thành Isoleucin (rtM204I hay YIDD) Theo tác giả Hồ Tấn Đạt, M204V cũng gặp nhiều hơn M204I (36% so với 11%)
Theo khảo sát này tỷ lệ đột biến rtM204I là 13% (YIDD) và rtM204V là 11.6% (YMDD) tương đương nhau Tuy nhiên, khảo sát trong nhóm đột biến không hoàn toàn, kiểu đột biến rtM204I (25.3%, 37 ca) nhiều hơn kiểu rtM204V (2.7%, 4 ca) Như vậy có thể đột biến rtM204 được chọn lọc sớm hơn Nếu lamivudine tiếp tục được dùng nhiều năm sau, kiểu thay thế rtM204I có thể xuất hiện nhiều hơn Nếu vậy thì đột biến ở vị trí rtM204V/I có liên quan gì hay không với týp gen B cũng cần được nghiên cứu tiếp
Trang 5Theo Allen 1998, đột biến rtM204I (nhóm II)
và đột biến kép rtM204V + rtL180M (nhóm I) có
gia tăng >1000 lần IC50 so với chủng hoang dại(1)
Đột biến đơn rtM204V hay rtL180M gây tăng
IC50 ít hơn nhiều (153 lần và 18 lần) (Allen 1998)
Allen cũng không gặp đột biến kép rtL180M +
rtM204I nhưng đột biến rtL180M bao giờ cũng
đi kèm rtM204V
Trong khảo sát này, 52,7% có đột biến hoàn
toàn hay không hoàn toàn với Lamivudine, tỷ lệ
đột biến rtM204I cũng chiếm 38,3% (13% đột
biến hoàn toàn, 23,3% đột biến không hoàn toàn
hay hỗn hợp) là tỷ lệ đáng chú ý Vì vậy cần đưa
ra quyết định thay đổi điều trị nếu sau 1 năm
không có đáp ứng với biểu hiện HBVDNA còn
cao, chưa chuyển đổi HBeAg Tuy nhiên, ở mức
nào của HBVDNA để ra quyết định thay đổi
điều trị, hay nên phối hợp sớm thêm một thuốc
diệt virút theo cơ chế tác dụng khác để tránh
chọn lọc dòng đột biến là điều cần được nghiên
cứu để khuyến cáo
Trong một nghiên cứu can thiệp cùng tại BV
Bệnh Nhiệt Đới nhằm quan sát đáp ứng trị liệu
của hai phác đồ ADV đơn độc và ADV+LAM
cho bệnh nhân kháng lâm sàng lamivudine
chúng tôi ghi nhận được kết quả như bảng 4
Bảng 4: Biên độ giảm HBVDNA sau 3 tháng (n=36)
Biên độ gi ả m HBVDNA (log copy/ml) n (%)
Biên độ gi ả m HBVDNA (log copy/ml) n (%)
Nhóm can
thi ệ p
>1 ≤1 P (OR) > 2 ≤ 2 p
ADEFOVIR +
LAMIVUDINE
(n1= 16)
15
(93,8)
1
(6,3)
0,10 10
(62,5)
6
(37,5) 0,30
ADEFOVIR
(n2=20)
14
(70,0)
6
(30,0)
(0,98 – 1,83)
9
(45,0)
11
(55,0)
Tỷ lệ gây được đáp ứng virút đo bằng giảm
HBVDNA sau 3 tháng >1 log copy/ml hay >2 log
copy/ml và biên độ giảm HBVDNA trung bình
không khác nhau ở phác đồ ngưng hẳn LAM
hay tiếp tục LAM Tuy nhiên nhóm ngưng ADV
có 2/20 ca 10%) có cơn bùng phát virút trong
vòng 3 tháng nhưng không có biểu hiện lâm
sàng cơn bùng phát viêm gan Tình trạng kháng
hỗn hợp còn tồn tại một tỷ lệ virút hoang dại
nhậy lamivudine có thể là nguyên nhân gây nên cơn bùng phát sau khi ngưng LAM như trên
KẾT LUẬN
Qua khảo sát tính chất thay đổi trình tự nucleotide trên polymerase của 146 bệnh nhân không đáp ứng với lamivudine có thời gian điều trị > 1 năm, chúng tôi có kết luận như sau:
- Tỷ lệ có ít nhất 1 điểm đột biến hoàn toàn là 34.9% Đột biến M204V/I chiếm ưu thế trong các kiểu đột biến đơn và đột biến kết hợp ở nhiều vị trí
- Có tình trạng đột biến không hoàn toàn gây hiện diện song song chủng hoang dại và chủng đột biến với tỷ lệ 43.8% ở nhiều vị trí như 204,
173 và 180
- Kiểu gen B có tỷ lệ đột biến cao hơn C
- Cần nghiên cứu để có kết luận về thời điểm
và biện pháp thay đổi trị liệu (ngưng hay phối hợp) trước khi quá trình chọn lọc chủng kháng thuốc hoàn tất
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Allen M., Deslauriers M., Andrews C., Tipples G., Walters K., Tyrrell D., Brown N and Condreay L Identification and characterization of mutations in hepatitis B virus resistant to lamivudine Lamivudine Clinical Investigation Group Hepatology 27(6):1670-1677, 1998
2 Hồ Tấn Đạt, P.T.T Thủy, N.B Toàn, N.T.K Oanh, N.T Tòng Xác định kiểu gen và các đột biến kháng thuốc của siêu vi viêm gan B bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi Y học VIệt Nam 329(số đặc biệt tháng 12/2006):32-39, 2006
3 Kao J.H., Liu C.J and Chen D.S Hepatitis B viral genotypes and lamivudine resistance Journal of hepatology 36:303-304, 2002
4 Teney D.J and al e Clinical emergence of entecavir-resistant hepatitis B virus requires additional sustitutions
in virus already resisitant to lamivudine Antimicrobial Agents Chemotherapy 48:3498-3507, 2004
5 Warner N., Locarnini S., Kuiper M., Bartholomeusz A., Ayres A., Yuen L and Shaw T The L80I Substitution in the Reverse Transcriptase Domain of the Hepatitis B Virus Polymerase Is Associated with Lamivudine Resistance and Enhanced Viral Replication In Vitro Antimicrobial Agents and Chemotherapy 51(7):2285-2292, 2007