Dứa là cây ăn quả nhiệt đới, có nguồn gốc ở Nam Mỹ (Brazil, Argentina, Paraguay)
Mục lục MỤC LỤC Mục lục . Danh mục bảng iii Danh mục hình .iv Lời mở đầu 1 CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU TỔNG QUAN .2 1.1 Đặc điểm nguồn nguyên liệu .2 1.2 Enzyme 3 1.2.1 Phân loại .3 1.3 Enzyme Bromelain .3 1.3.1 Cấu tạo hóa học 4 1.3.2 Cấu trúc không gian 4 1.3.3 Tính chất vật lý .5 1.3.4 Hoạt tính của Bromelain .5 a. Hoạt tính phân giải 5 b. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Bromelain 6 CHƯƠNG 2: NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA ENZYME BROMELAIN 8 2.1 Ứng dụng trong y dược 8 2.1.1 Bromelain giảm thiểu viêm xoang 8 2.1.2 Bromelain làm liền sẹo .9 2.1.3 Bromelain giảm đau nhức do hư khớp .9 2.1.4 Bromelain làm tăng hệ miễn dịch .9 2.1.5 Bromelain và bệnh hen suyễn .9 2.1.6 Bromelain và HIV .9 2.2 Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm .10 2.2.1 Bromelain làm mềm thịt 10 2.2.2 Bromelain sử dụng trong quá trình đông tụ sữa .10 2.2.3 Bromelain trong chế biến thủy sản .10 2.3 Ứng dụng trong công nghiệp dệt may 10 2.4 Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da .10 2.5 Bromelain dùng để thu nhận các chất ức chế protease 10 2.6 Ứng dụng làm thực phẩm chức năng .11 CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME BROMELAIN .13 3.1 Các phương pháp thu nhận enzyme Bromelain .13 3.1.1 Phương pháp siêu lọc 13 a. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc 13 b. Các kiểu siêu lọc .14 c. Những thuận lợi của phương pháp siêu lọc .15 3.1.2 Phương pháp kết tủa .15 3.1.3 Phương pháp hấp phụ .18 3.2 Các phương pháp tinh sạch enzyme Bromelain 18 i Mục lục 3.2.1 Phương pháp thẫm tích .18 3.2.2 Phương pháp lọc Sephatex G-50 18 3.2.3 Phương pháp sắc kí .19 Kết luận .20 Tài liệu tham khảo .21 ii Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Những tính chất vật lý của Bromelain thân 5 Bảng 1.2 Hoạt tính phân giải casein của Bromelain 6 Bảng 1.3 Hoạt tính phân giải Benzoyl – L – Arginine amide của Bromelain 6 iii Danh mục hình DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 C u trúc s i hydrate carbon c a Bromelain ấ ợ ủ 4 Hình 2.1 Dược phẩm Bromelain có hoạt lực cao (1200 gdu/g hay 1800mcu/g) 12 Hình 2.2 Dược phẩm chức hàm lượng Bromelin cao 12 Hình 2.3 Thực phẩm chức năng gồm tinh chất Bromelain và Curcumin 12 Hình 2.4 Quercetin & Bromelain: Thuốc giúp bệnh Gút .12 Hình 2.5 Medizym: chống viêm, liền sẹo 12 Hình 2.6 Dứa enzyme: Complex – 800 GDU .12 Hình 3.1 Lọc cross - flow 13 Hình 3.2 Kiểu một bước 14 Hình 3.3 Kiểu lô .14 Hình 3.4 Kiểu thể tích không đổi .15 Hình 3.5 Quy trình thu nhận enzyme Bromelain .17 Hình 3.6 Cấu tạo của kaolin .18 iv Lời mở đầu LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay với sự tiến bộ và phát triển không ngừng của khoa học thì nhu cầu về sản phẩm của Khoa học Công nghệ ngày càng cao, đặc biệt là công nghệ enzyme. Việc sản xuất enzyme từ các nguồn động, thực vật và vi sinh vật có vai trò quan trọng vì được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp và đời sống, đặc biệt có thể giúp cải tiến được nhiều quy trình chế biến, nâng cao chất lượng, hạ giá thành sản phẩm, rút ngắn thời gian sản xuất và đáp ứng được những nhu cầu như an toàn sinh học, không gây bệnh đối với người. Một trong những enzyme quan trọng trong cuộc sống đó là enzyme Bromelain nó được ứng dụng trong công nghiệp, thực phẩm và quan trọng nhất là trong y dược. Với những đặc điểm và tầm quan trọng của enzyme Bromelain Đề tài “Tìm hiểu về Bromelain enzyme, chiết suất và ứng dụng” được thực hiện nhằm ly trích và giúp hiểu được tầm quan trọng của enzyme Bromelain trong cuộc sống. 1 Chương 1: Giới thiệu tổng quan CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm nguồn nguyên liệu Dứa là cây ăn quả nhiệt đới, có nguồn gốc ở Nam Mỹ (Brazil, Argentina, Paraguay), hiện ở những vùng này vẫn có thể tìm thấy nhiều giống dứa hoang dại. Hiện nay trên thế giới, cây dứa được trồng hầu hết ở các nước trừ ở Châu Âu. Các nơi trồng nhiều như là: Hawaii, Brazil, Philipines, Thailand…Ở nước ta, dứa trồng từ Bắc đến Nam, diện tích trồng cả nước khoảng 40.000 ha với sản lượng khoảng 500.000 tấn, trong đó 90% ở khu vực phía Nam. Các tỉnh trồng dứa nhiều ở miền Nam là Kiên Giang, Tiền Giang, Cà Mau… miền Bắc có Thanh Hóa, Tuyên Quang, Phú Thọ…miền Trung có Nghệ An, Quảng Nam… Trên thế giới có khoảng 60-70 giống dứa và được chia thành 7 nhóm, trong đó có 3 nhóm trồng phổ biến là nhóm Cayenne, nhóm Queen và nhóm Spanish. - Nhóm Cayenne là nhóm dứa trồng phổ biến nhất trên thế giới, chiếm khoảng 80% diện tích. Ở nước ta mới trồng ở một số ít nơi như Vĩnh Phúc, Nghệ An, Lâm Đồng. Dứa thuộc nhóm này có quả lớn nhất, mắt phẳng và nông. Thịt quả kém vàng, nhiều nước, ít ngọt và kém thơm hơn dứa Queen. - Nhóm Queen còn gọi là dứa Hoàng Hậu, dứa hoa, dứa tây. Đây là nhóm dứa trồng phổ biến nhất ở nước ta hiện nay, với các giống dứa tây, giống dứa Na Hoa ở phía Bắc, các giống Queen Long An, Kiên Giang ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (còn gọi là khóm hoặc thơm). Dứa thuộc nhóm này có quả tương đối nhỏ, mắt lồi. Thịt quả vàng đậm, giòn, hương thơm, vị chua và ngọt lâu. Nhóm này có chất lượng cao nhất, trên thế giới thường dùng để ăn tươi. - Nhóm Spanish còn gọi là dứa Tây Ban Nha, dứa ta. Nhóm này được trồng ở Thailand, Cuba… Quả dứa thuộc nhóm này lớn hơn dứa Queen, mắt sâu. Thịt quả vàng nhạt, có chỗ trắng, vị chua ít thơm nhưng nhiều nước hơn dứa hoa. Dứa nhóm này chịu bóng râm, ít dập nát khi vận chuyển và hàm lượng đường thấp nên không được phát triển. 2 Chương 1: Giới thiệu tổng quan 1.2 Enzyme - Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất. Sự trao đổi chất mà ngừng lại thì sự sống sẽ không còn tồn tại. Quá trình trao đổi của một chất là tập hợp của rất nhiều các phản ứng hóa học phức tạp. Enzyme là hợp chất protein xúc tác cho các phản ứng hóa học đó. Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể sống. - Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống. Chính do những tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chất xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học. - Chúng là chất xúc tác sinh học không chỉ có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng, phát triển của mọi sinh vật mà nó còn giữ vai trò rất quan trọng trong các lĩnh vực khác như: công nghệ chế biến thực phẩm, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen vào bảo vệ môi trường, đặc biệt là trong y học với ứng dụng sản xuất dược phẩm. 1.2.1 Phân loại - Ngày nay ngày càng nhiều enzyme mới được phát hiện, và để thống nhất tên gọi enzyme người ta đã phân tất cả enzyme làm 6 loại: Oxidoreductase: là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hoá khử. Transferase: là nhóm enzyme xúc tác phản ứng chuyển vị một nhóm (gốc) nào đó từ chất này sang chất khác. Hydrolase: là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân (phản ứng cắt có sự tham gia của nước). Lyase: là nhóm các enzyme xúc tác quá trình phân cắt một nhóm nào đó ra khỏi hợp chất mà không có sự tham gia của nước. Izomerase: là nhóm enzyme xúc tác sự đồng phân hoá, chuyển dạng đồng phân này sang dạng đồng phân khác. Ligase: là nhóm enzyme xúc tác sự tổng hợp chất hữu cơ nhờ năng lượng ATP và các chất tương tự. 1.3 Enzyme Bromelain - Bromelain là protein-enzyme có nhiều trong quả dứa và có một ít trong quả chuối, enzyme này được phát hiện từ giữa thế kỉ 19 nhưng mới được nghiên cứu từ giữa thế kỷ 20. Ở nước ta nghiên cứu về bromelain được bắt đầu từ những năm 1968 -1970. 3 Chương 1: Giới thiệu tổng quan - Bromelain là nhóm protease thực vật có mã số EC-3.4.22.33 được thu nhận từ họ bromeliaceae, đặc biệt là từ thân và trái dứa. Ở mỗi bộ phận khác nhau thì bromelain có pH tối ưu khác nhau và cấu tạo cũng có sự khác nhau. - Bromelain có trong toàn bộ cây dứa, nhưng nhiều nhất là trong quả. Bromelain là nhóm endoprotease có khả năng phân cắt các liên kết peptide nội phân tử protein để chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi là các peptide [5] . - Thành phần chủ yếu của bromelain có chứa nhóm sulfurhydryl thủy giải protein. Khi chiết tách và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm sulfurhydryl của bromelain thì thu được một enzyme thủy phân protein hiệu quả in vitro [1] . 1.3.1 Cấu tạo hoá học - Bromelain thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác như papain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose, 2 glucosamine, 1 xylose, và 1 fructose [1] . - Các nghiên cứu ghi nhận, polypeptide của bromelain thân có acid amin đầu – NH 2 là valine và đầu carboxyl là glycine; còn đối với bromelain quả, acid amin đầu – NH 2 là alanine [1] . OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH CH OH 2 CH OH 2 CH OH 2 OH OH NHCONH 3 NHCONH 3 NHCOCH 2 C N CH CH 2 Fructose Maltose Maltose Maltose Xylo se Glucofamine Hình 1.1: C u trúc s i hydrate carbon c a bromelainấ ợ ủ 1.3.2 Cấu trúc không gian - Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelain và nhận thấy cách sắp xếp amino acid trong phân tử bromelain như sau: - Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp - - Gly – Cys – Lys - 4 Chương 1: Giới thiệu tổng quan - Bromelain là một protease trong tâm hoạt động có chứa cysteine và hai sợi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối - S – S -. Phân tử có dạng hình cầu do có cách sắp xếp phức tạp. - Trong phân tử bromelain thân có chứa nhóm sulfurhydryl có vai trò chủ yếu trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Ngoài ra, trong phân tử còn có các ion Zn 2+ có lẽ có vai trò trong duy trì cấu trúc không gian của enzyme. 1.3.3 Tính chất vật lí - Murachi và cộng sự năm 1964 đã nghiên cứu về tính chất vật lý của enzyme bromelain trích từ thân cây dứa và thấy như sau: Bảng 1.1 Những tính chất vật lý của bromelain thân Tính chất Ký hiệu Số liệu Hằng số sa lắng S (s) 2.73 Hằng số khuếch tán D (cm 2 / s) 7.77 x 10 -7 Thể tích riêng phần V (ml/g) 0.743 Độ nhớt bên trong [ I ] (dl/g) 0.039 Tỷ số ma sát f / f o 1.26 Điểm đẳng điện pI 9.55 Sự hấp thu A 1% cm ở 280nm 20.1 Trọng lượng phân tử 32.000 * 32.100 ** 35.500 *** * : Tính bằng phương pháp sa lắng - khuếch tán ** : Tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên trong *** : Tính bằng phương pháp Archibald 1.3.4 Hoạt tính của bromelain a. Hoạt tính phân giải - Bromelain có 3 hoạt tính: peptidase, amidase và esterase, hoạt tính esterase ở bromelain hơn papain trong đu đủ và ficin trong cây thuộc họ Sung [1] . - Khả năng phân giải các cơ chất tự nhiên của bromelain. Bảng 1.2: Hoạt tính phân giải casein của bromelain Cơ chất Hoạt tính phân giải casein ( UI/mg) Bromelain thân Bromelain quả xanh Bromelain quả chín 5 Chương 1: Giới thiệu tổng quan Casein 7.4 4.0 3.0 - Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelain thân cao hơn trong quả xanh và quả chín. - Khả năng phân giải các cơ chất nhân tạo của bromelain. Bảng 1.3 Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) của bromelain Cơ chất Hoạt tính phân giải BAA ( UI/mg) Bromelain thân Bromelain quả xanh Bromelian quả chín BAA 3.7 9.1 7.2 - Qua bảng trên ta thấy bromelain quả xanh có hoạt tính phân giải BAA cao hơn bromelain thân và quả chín. b. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain - Giống như các loại chất sinh học khác, bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch, phương pháp tinh khiết . - Các yếu tố như nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động của các phản ứng xúc tác của bromelain không ổn định mà phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu tố khác như: bản chất cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, sự có mặt của các chất hoạt hóa… Ảnh hưởng của pH : pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme, pH tối thích của bromelain không ổn định mà tuỳ thuộc vào nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch enzyme…Ví dụ: Khi thu thập bromelain thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là (NH 4 ) 2 SO 4 thì enzyme có hoạt tính cao nhất ở pH = 4.8, ổn định ở pH = 4.6 - 5.4. Bromelain đã được tinh sạch một phần có hoạt tính cao nhất ở pH = 6.0 và pH = 8.0, ổn định ở pH = 3.5 – 5.6 với nhiệt độ 63 º C. Bromelain có biên độ pH rộng (3 -10), tốt nhất là pH = 5 – 8 tuỳ thuộc vào cơ chất. Ảnh hưởng bởi cơ chất : trên những loại cơ chất khác nhau, bromelain có hoạt tính khác nhau. Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelain mạnh hơn papain gấp 4 lần, nếu cơ chất là casein thì hoạt tính của bromelain tương tự như papain. Đối với các cơ chất tổng hợp như BAA (Benzoyl-L-Arginine amide), BAEE (Benzoyl-L-Arginine ethyl ester) thì khả năng thuỷ giải của bromelain yếu hơn papain. 6 [...]... pH=9.5 - Bromelain thân khi dùng sắc kí gel trên sephadex G-50 và sắc kí trao đổi ion trên DEAE-cellulose thì thấy có 1 thành phần chính và 5 thành phần phụ - Bromelain quả dùng sắc kí trên DEAE-cellulose và sulfoethyl sephadex thì thấy có 1 thành phần chính và 2 thành phần phụ 19 Kết luận KẾT LUẬN Sau khi hoàn thành bài báo cáo chuyên đề với đề tài Tìm hiểu về Bromelain Enzyme, chiết suất và ứng dụng ... như: - Hiểu được về tính chất và đặc điểm của enzyme Bromelain - Nắm được ứng dụng to lớn của enzyme Bromelain trong công nghiệp cũng như trong đời sống - Giúp hiểu một phần nào về qui trình thu nhận và các phương pháp tinh sạch enzyme Bromelain 20 Tài liệu tham khảo TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Nguyễn Đức Lượng Công nghệ enzyme, 2004, NXB Đại Học Quốc Gia 2 Lê Thị Thanh Mai Nghiên cứu về enzym bromelin và con... chất ức chế protein có chứa nhóm –SH Các chất ức chế này được sử dụng nhiều trong công nghiệp và y tế 10 Chương 2: Những ứng dụng của enzyme Bromelain 2.6 Ứng dụng làm thực phẩm chức năng Bromelain kết hợp với Curcumin (chiết suất từ củ nghệ vàng) điều chế thành thực phẩm chức năng an toàn Brocurma C-B có tác dụng tăng cường miễn dịch và khảng năng đề kháng của cơ thể, tăng khả năng phòng một số bệnh... nhưng rất đắc tiền và cũng gây nhiều phản ứng phụ Các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên có khả năng ức chế protease HIV và đã tìm thấy 19 hợp chất thiên nhiên có tác dụng tương tự thuốc anti protease, trong đó bromelain trong dứa được coi là có giá trị nhất và có thể ăn, uống để điều trị HIV/AIDS 9 Chương 2: Những ứng dụng của enzyme Bromelain 2.2 Ứng dụng trong công nghiệp... ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme do chúng gắn vào các trung tâm hoạt động của enzyme Chẳng hạn muối thuỷ ngân có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bromelain và mức độ kìm hãm tuỳ thuộc vào nồng độ của muối 7 Chương 2: Những ứng dụng của enzyme Bromelain CHƯƠNG 2 NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA ENZYME BROMELAIN - Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh mẽ trên qui mô công nghiệp... đến 4ºC và acetone tinh khiết ở - 20ºC Ethanol cũng được sử dụng để làm kết tủa bromelain và cũng phải giữ ở nhiệt độ thấp Sau khi thu được kết tủa, tủa bromelain phải rửa bằng acetone và làm khô thật nhanh để bromelain không bị biến tính - Thông thường những yếu tố chính có thể ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng của chế phẩm enzyme đó là: Nồng độ của tác nhân kết tủa pH của dịch chiết Nhiệt... các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng Các chế phẩm enzyme phổ biến như amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, glucoseoxydase… - Chế phẩm enzyme không chỉ được ứng dụng trong y học mà còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, như trong công nghiệp thực phẩm, dệt may, thuộc da… 2.1 Ứng dụng trong y dược - Enzyme có một... còn 6 ngày) - Bromelain còn được dùng làm thuốc tấy giun, một loại giun nhỏ thường gặp ở trẻ em Qua nghiên cứu của Hordegen.P thì bromelain cũng cho kết quả tốt như pyratel 8 Chương 2: Những ứng dụng của enzyme Bromelain 2.1.2 Bromelain làm liền sẹo Enzyme Bromelain có tác dụng làm mau lành các vết thương ở da hay các vết phỏng Một số thí nghiệm cho thấy, ở chuột bị phỏng, chất chiết xuất bromelain từ... trị tốt như diclofenac về đau nhức do hư khớp, không có tác dụng phụ 2.1.4 Bromelain làm tăng hệ miễn dịch Bromelain làm tăng hệ miễn dịch giúp cho người bị ung thư (phổi, bàng quang, vú, buồng trứng…) giảm được hiện tượng di căn Đồng thời bromelain còn ức chế quá trình viêm, làm giảm hiện tượng phù nề và tụ huyết, cũng như giảm đau nhức Do đó, các chuyên gia y tế đề nghị sử dụng bromelain như chất làm... sữa truyền thống Tuy nhiên, lượng renin sản xuất chưa đáp ứng đủ nhu cầu trong sản xuất sữa Gần đây người ta sử dụng enzyme thực vật vào trong chế biến sữa và đang được nghiên cứu Trong đó, enzyme Bromelain đang được quan tâm với mục đích này 2.2.3 Bromelain trong chế biến thủy sản Trong sản xuất nước mắm thì thời gian chế biến thường dài và hiệu suất thủy phân độ đạm không cao nên hiện nay người ta chú