Sản xuất ezym từ thực vật

Luận văn về sản xuất ezym từ thực vật

CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 1 c lc Chng 1: NGUYÊN LIU THU ENZIM VÀ PHÂN B 3 1.1. Ngun ng vt: 3 1.2. Ngun gc thc vt: 4 1.3. Ngun vi sinh vt: 4 Chng 2: N XUT CÁC CH PHM ENZIM T VI SINH VT 5 2.1. u hoà quá trình sinh tng hp enzim trong môi trng nuôi cy vi sinh vt 5 2.2. Tuyn chn và ci to ging vi sinh vt cho enzim có hot lc cao: .11 2.3. Phng pháp bo qun ging vi sinh vt : 12 2.4. Môi trng nuôi cy vi sinh vt sinh tng hp enzim: 13 2.5. Các phng pháp nuôi cy vi sinh vt: 17 2.6. Tách và làm sch ch phm enzym : 22 Chng 3:  THUT SN XUT CH PHM T HT CC NY MM (MALT) .24 3.1. Nguyên liu i mch: 24 3.2. Làm sch và phân loi ht: .25 3.3. a, sát trùng và ngâm ht: 26 3.4. y mm: .28 3.5. y malt: 34 3.6. Tách mm, r, bo qun malt: .37 3.7.  thut sn xut mt s loi malt c bit: .38 Chng 4: N XUT ENZIM T THC VT 40 4.1. n xut ureaza tu ra: .40 4.2. Thu nhn bromelain t da: 40 Chng 5: ENZIM CNH .44 5.1. Gii thiu chung: 44 5.2. t s phng pháp ch yu ch to enzim cnh : 44 5.3. t s liên kt trong vic cnh enzim .45 5.4. nh hng ca s cnh n hottính ca enzim .46 5.5. Các reactor cha enzim cnh: .48 5.6. . S dng enzim cnh trong y hc và trong công nghip: .50 Chng 6: GII THIU MT S LOI ENZIM CH YU VÀ KH NNG NG NG 55 6.1. Amylaza 55 6.2. Proteaza .58 6.3. Pectinaza 60 6.4. Xenluloza: .64 CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 2 6.5. Saccaraza và glucooxydaza .66 Chng 7: PHNG PHÁP XÁC NH HOT  MT SÔ LOI ENZIM 68 7.1. n vo hot : .68 7.2. Các phng pháp xác nh hot  enzim: .69 7.3. Chun b dch chit enzim  xác nh ho 71 CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 3 Chng 1: NGUYÊN LIU THU ENZIM VÀ PHÂN B 1.1. Ngun ng vt: 1.1.1. Tu tng: (Pan creas) ây là ngun enzim sm nht, lâu dài nht, có cha nhiu loi enzim nht nh: tripxin, kimotripxin, cacboxy pectidaza A và B, ribonucleaza, amilaza, lipaza. + Tripxin y hc phi là loi tinh ch. + ng dng u tiên ca ch phm tripxin là làm mn da  lt da, kh các vt nt trên da. + Sn xut sn phm thu phân protein y hc (dch truyn y t) và môi trng nuôi cy vsv. + Ch phm dch tu y hc  cha bnh v tu (ri lon chc nng, b ct b tu). + Sn xut ch phm enzim ty ra (vt bn, màu khó tan)  nhit  va phi, không thích hp vi nhit  cao và pH thay i. 1.1.2. Màng nhy d dày ln: Là ngun enzim pepxin A, B, C, D, gastrisin. Các enzim này c tit ra ngoài t bào cùng vi dch v ( khi tiêu hoá thc n). i vi các typ pepxin có pH opt =1.3÷2.2. 1.1.3.  dày bê: Trong ngn th t ca d dày bê có tn ti enzim thuc nhóm Proteaza tên là renin. Enzim này ã t lâu c s dng ph bin trong công ngh phomat. Renin làm bin i cazein thành paracazein có kh nng kt ta trong môi trng sa có  nng  Ca 2+ . ây là quá trình ông t sa rt n hình, c nghiên cu và ng dng y  nht. Trong thc t nu ch phm renin b nhim pepxin (trong trng hp thu ch phm renin  bê quá thì. Khi ó, d dày bê ã phát trin y  có kh nng tit ra pepxin) thì kh ng ông t sa kém i. n ây có nghiên cu sn xut proteaza t vsv có c tính renin nh  các loài Eudothia Parasitica và Mucor Purillus. 1.1.4. Các loi ni tng khác: Gan, lá lách, thn, phi, c hoành tim, d con, huyt. Các loi này u có cha enzim, a s tn ti trong t bào. Ch có mt s loi c sn xut di dng ch phm nh: gan, tim ln  tách aspartat-glutamat aminotransferaza, huyt tng (t huyt)  tách ra trombia (Proenzim chng ông máu) Nhìn chung nguyên liu ng vt dùng  tách enzim phi ti tt (ly ngay sau khi git m) hoc gi -20 0 C có thc 1÷12 tháng vn không làm gim hot tính enzim. CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 4 1.2. Ngun gc thc vt: 1.2.1. Cây u ra (Canavalin ensifirmis): ây là cây thuc hu Canavalia – có nhiu  châu Phi,  Vit Nam có nòi k trên. Trong tt c các nòi u ra u rt giàu enzim Ureaza, hàm lng có thn 20% cht khô. 1.2.2.  da (Bromalaceae): Bao gm tt c các nòi da trng ly qu, ly si (k c các nòi da di). Trong các b phn khác nhau ca cây da (v, lõi, chi, thân, lá,…) u có cha enzim bromelain. Trong ó nhiu nht là phn lõi u qu da. Hot tính ca enzim bromelain ph thuc nhiu vào trng thái và u kin bo qun nguyên liu. Các nghiên cu ã ch ra rng các nguyên liu sy khô  nhit  400C s gi c hot tính enzim tt hn so vi nguyên liu ã c bo qun lnh  nhit  4 0 C. 1.2.3. Nha u  (Carica Papaya. L): ây là loi cây n qu ph bin  các nc nhit i. T qu ti hoc thân thu c nha (latex) chính là ch phm papain thô  tó tinh ch thành papain thng phm. Hin nay ngi ta ã to ra c các ging u  có sn lng m và hot tính papain cao  khai thác có hiu qu ngun enzim này (không t vn  ly qu). 1.2.4. t s loi nguyên liu thc vt khác: Khi tin hành nghiên cu khoa hc, y sinh hc, nhiu khi cn xem xét (nh tính, nh ng, cu trúc phân t,  hot ng enzim, …) ca mt s loi enzim có trong bn thân nguyên liu ó nh lng s dng. áng chú ý hn c là: Ch phm enzim Polyphenoloxydaza (EPPO): n hình nht là eppo ca lá chè, ca i nh ht ca cao ti, nc ép qu nho. Ch phm loi này ph bin hn c là loi “bt axeton”. 1.2.5. t cc và mt s loi c cha tinh bt: Trong ht cc ny mm (malt) và mt s loi c ny mm (n hình là khoai lang) có t h enzim rt phong phú c ngi ta s dng t rt lâu trong các lnh vc: mt tinh t (mch nha), ru và bia (thm chí có mt phng pháp sn xut ru etylic mang tên là phng pháp maltaza hay phng pháp malt) 1.3. Ngun vi sinh vt: ây là ngun enzim phong phú nht, có  hu ht các loài vi sinh vt nh: nm mc, vi khun và mt s loài nm men. Có th nói vi sinh vt là ngun nguyên liu thích hp nht  sn xut enzim  qui mô ln dùng trong công ngh và i sng. Dùng ngun vi sinh vt có nhng li ích chính nh sau: + Chng v nguyên liu nuôi cy vi sinh vt và ging vi sinh vt. + Chu k sinh trng ca vi sinh vt ngn: 16÷100 gi nên có th thu hoch nhiu ln quanh nm. + Có thu khin sinh tng hp enzim d dàng theo hng có li (nh hng s ng và tng hiu sut tng thu hi). + Giá thành tng i thp vì môt trng tng i r, n gin, d t chc sn xut. Tuy nhiên trong mi trng hp cn lu ý kh nng sinh c t (gây c, gây bnh)  có bin pháp phòng nga, x lý thích hp. CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 5  sn xut ch phm enzim, ngi ta có th phân lp các ging vi sinh vt có trong t nhiên hoc các ging t bin có la chn theo hng có li nht, ch tng hp u th t loi enzim nht nh cn thit nào ó. Chng 2: SN XUT CÁC CH PHM ENZIM T VI SINH VT 2.1. u hoà quá trình sinh tng hp enzim trong môi trng nuôi cy vi sinh vt i mc ích nuôi cy thu hi enzim vi hiu sut cao, cn phi nhn r quá trình u hoà sinh tng hp enzim  có các nh hng tác ng thích hp trong công ngh. T bào vi sinh vt ch tng hp enzim khi cn thit vi s lng thích hp mong mun. 2.1.1. u hoà theo hng óng m bi gen operator (gen u khin) _hin ng trn áp : + hin tng trn áp (c ch) (repression): là làm gim quá trình sinh tng hp do sn phm cui cùng ca quá trình nuôi cy. Hin tng này thng gp i vi các enzym xúc tác quá trình sinh tng hp mt chiu nh: quá trình sinh tng hp axit amin, nucleotit. Ví d: khi thêm mt axit amin nào ó vào môi trng nuôi cy thì t bào s không cn ng hp này na. Do ó cng sình ch quá trình sinh tng hp enzym, xúc tác cho quá trình tng hp nên chính axit amin ó. Enzym này chc tng hp tr li khi có nhu u ngha là khi làm gim nng  axit amin tng ng. i vi h thng phân nhánh ngha là quá trình dn n vic to thành nhiu sn phm cui cùng khác nhau t mt c cht chung ban u thì c ch trn áp có thc thc hin theo các cách khác nhau. Ví d: Phn ng u tiên ca quá trình sinh tng hp các axit amin lizin, methionin, treonin u do enzym aspactokinaza xúc tác. Enzym này có 3 izoenzim. Ký hiu: a l , a m , a t . Quá trình sinh tng hp a l s b trn áp bi nng  lizin. a m ca methionin. Riêng i vi a t thì treonin va là sn phm cui cùng ca c quá trình va là  cht ban u  sinh tng hp izolxin. Do ó quá trình sinh tng hp axit t ch b trn áp khi c treonin và izolexin t nng  cao vt quá nhu cu ca t bào. Có th minh ho c ch trn áp này theo s: CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 6 al am at A B C D Methionin E G Lizin Treonin Izoloxin Ghi chú: A – C cht Aspartic ban u. B, C, D, G là các sn phm trung gian có tác dng trn áp. Nh vy ây s trn áp ch xy ra khi có s hp ng tác dng ca c 2 sn phm. u trn áp hp ng này cùng xy ra i vi quá trình sinh tng hp enzym ging nhau xúc tác cho các phn ng song song to thành 2 sn phm cui cùng khác nhau. Ví d: quá trình sinh tng hp valin và izolxin do 4 enzym ging nhau xúc tác theo s sau: Valin Izoloxin 432 1 Hin nay ngi ta cho rng ARN mi là yu t trn áp thc s cho quá trình sinh tng p các enzym xúc tác  tng hp các axit amin tng ng. + Hin tng cm ng (induction): là hin tng ngc li vi hin tng trn áp làm ng lng enzym ca t bào (Ghi chú  s trên: 1: -axeto.-oxyaxítintetaza 2: reductoizomeraza (axetolactat mutaza) 3: hydrooxyaxit dehydrataza 4: amino transpheraza 4 Phn ng 4 Phn ng 6 Phn ng -axetolactat -axeto -Oxybutirat -Dioxy  metylvalerat -Xeto  - metyl -Xeto izovalerat -Dioxy izovalerat CH 3 CHO hot ng CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 7 Ngha là khi trong môi trng nuôi cy có cht cm ng s kích thích cho vi sinh vt sinh tng hp nên nhiu enzym hn so vi bình thng. Cht cm ng c xem nh là mt cht nn (Cht c s, b khung cácbon)  sinh ng hp enzym. Hin nay, ngi ta ch ra rng có th các sn phm trung gian ca quá trình bin i óng vai trò là cht cm ng, thm chí nhiu c cht ca enzym cng có th là cht cm ng. n hình là các gluxit (monosaccarit và polysaccarit). Trong s các enzim do vi sinh vt tng hp, có nhng enzim bình thng chc ng hp rt ít i nhng khi thêm mt s cht nht nh vào môi trng nuôi cy thì hàm ng ca chúng có th tng lên rt nhiu ln. Monod và Cohn (1925) gi các enzim này là enzim cm ng, cht gây nên hiu qu này là gi là cht cm ng. Các enzim cm ng thng là nhng enzim xúc tác cho quá trình phân gii nh: Proteinaza, amylaza, pectinaza, penixilinaza, _galactosidaza  t bào E. coli. Khi nuôi cy E. coli trong môi trng glucoza và glyxerin, vi khun ch tng hp khong 10 phn t_galactosidaza/t bào. Nu nuôi cy trên môi trng lactoza là ngun các bon duy nht thì hàm lng enzim là 6÷7% tng hp lng protein ca t bào. Trích ra t t bào cha n 6000 phn  enzim, ngha là tng lên gn 1000 ln so vi khi nuôi cy trong môi trng c.  cm ng thng có tính cht dây chuyn. Trong h thng gm nhiu phn ng, c cht u tiên ca h thng có th cm ng quá trình sinh tng hp tt c các enzim xúc tác cho quá trình chuyn hoá ca nó. u này c thc hin theo c ch sau: Trc ht cht cm ng làm tng quá trình sinh tng hp enzim tng ng, sau ó sn phm này li m ng tng hp enzim  phá hu nó, tip theo sn phm th 2 này li cm ng tng p nên enzim th 3,… Ví d: Histidin có tác dng cm ng hàng lot các enzim xúc tát cho quá trình chuyn hoá nó thành axít glutamic (Chasin và Magasamil (1968)). + C chu hòa theo kiu trn áp và cm ng: Zocob và Monod ã  ra mô hình gii thích c ch ca 2 hin tng trn áp và cm ng trên c s di truyn. Theo mô hình này, s trn áp và cm ng sinh tng hp enzim c thc hin theo cùng mt c ch chung da trên c su hoà hot ng ca các gene di tác dng ca các cht phân t thp. Nhng cn c chính ca thuyt này nh sau: 1) Có s phân hoá chc nng ca các giai n khác nhau trong phân t AND trong nhim sc th, da vào chc phn ca chúng trong qui trình sinh tng hp Protein có th chia thành các loi gene sau: - Gene cu trúc (ký hiu: S 1 ,S 2 ,S 3 ) : mã hoá phân t protein enzim c tng hp, tc là th t các axit amin trong phân t enzim c tng hp là tu thuc vào th t các nucleotit ca n gene này. Các gene mã hóa các enzim c íp xp lin nhau thành t nhóm trên nhim sc th. Chúng là khuôn  tng hp phân t ARN tt . - Gene Operator (ký hiu: O):  cnh nhóm gene cu trúc, không mã hoá protein nhng m bo cho quá trình sao chép mã  gene cu trúc theo c ch “óng m” ta nh công tc ca mt dây èn. Quá trình sao chép ch có th tin hành khi gene operator  trng thái “m” (không kt vi cht nào c) và ngng li khi nó b “óng” (kt hp vi t cht c bit gi là cht trn áp represson). Mt gene operator có th “ph trách” mt nhóm gene cu trúc các gene cu trúc này cùng vi gene operator ca chúng hp thành CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 8 t n v sao chép s cp gi là mt operon. S tng hp ARN tt c bt u  mt u ca operon và chuyn qua các gene cu trúc n u kia ca operon. - Gene Promotor (gene hot hoá ký hiu P) ng trc gene operator là n And mà ARN-polimeraza s kt hp và bt u quá trình sao chép các gene cu trúc. - Gene u hoà regulator (ký hiu R): Gene này mã hoá cho mt protein c bit gi là cht trn áp (repressor). Cht trn áp có vai trò “óng-m” gene operator. Do ó gene u hoà có th kim tra quá trình sao chép gene cu trúc thông qua cht trn áp này. + Không có repressor (sn phm cui cùng) R P O S1 S2 S3 ADN E3E2E1 A BC D ARNtt + Có repressor (sn phm cui cùng): Phiên mã CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 9 R P O S1 S2 S3 ADN : ARN-polymeraza : Repressor : coreressor R: Gene u hoà, P: Gene promotor, O: Gene Operator, S1, S2, S3: Các gene cu trúc. 2) Trong trng hp u hoà sinh tng hp enzim theo c ch trn áp, repressor do gene u hoà tng hp còn  dng không hot ng (aporepessor) cha có kh nng kt p vi gene operator nên quá trình sao chép các gene cu trúc tin hành bình thng. Các enzim c tng hp xúc tác cho các phn ng  to thành các sn phm cui cùng, n phm cui cùng này li có kh nng kt hp vi aporepessor và hot hoá nó. Aporepessor ã c hot hoá s kt hp vi operator ngn cn quá trình sao chép các gene cu trúc, làm ngng vic tng hp ARN tt tng ng do ó ình ch quá trình sinh ng hp các enzim tng ng. Trong trng hp này các sn phm mi c coi nh là cht trn áp (repressor). 3) i vi trng hp cm ng: + Không có cht cm ng R P O S1 S2 S3 ADN + Có cht cm ng: CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 10 ADNS3S2S1OPR ARNtt A BC D E1 E2 E3  minh ho c ch cm ng sinh tng hp enzim : Cht cm ng Khi không có mt cht cm ng, cht trn áp (repressor) c tng hp ã  trng thái hot ng, nó kt hp vi gene u khin operator, quá trình sao chép mã ca gene cu trúc b bao vây nên các enzim tng ng không c tng hp. Khi có mt cht cm ng thì cht trn áp repressor b mt hot ng, tách khi gene u khin operator và quá trình sao chép mã bt u, kt qu làm tng lng enzim c ng hp. Nh vy ta thy hin tng trn áp và cm ng sinh tng hp enzim là hai mt i lp a mt quá trình hoá sinh thng nht c thc hin thông qua hot ng “óng-m” gene di tác dng ca các cht phân t thp 2.1.2. u hoà tng tác gia ARN-polymeraza vi gene promotor: Nhiu du hiu thc nghim cho thy các gene bo m sinh tng hp mt s enzim m ng xúc tác cho quá trình phân gii không ch chu s kim tra theo c ch cm ng nhã trình bày  trên mà còn chu s kim tra theo mt c ch khác nh tác dng ca AMP vòng (AMP v ) gi là “trn áp phân gii” (cactabolic repressor) AMP v có tác dng kích thích ca AMP v i vi quá trình sao chép mã ca các operon phân gii. Hin tng này ã c nghiên cu nhiu i vi operon lactoza. Theo nhiu tác gi, tác dng kích thích ca AMP v i vi quá trình sao chép mã c thc hin nh mt protein c bit làm trung gian gi là protein nhn AMP v , hay còn gi là protein hot hoá gene phân gii CAP (catabolite gene activator protein). Khi AMP v kt hp vi CAP to thành phc hp có tác dng hot hoá gene promotor làm cho ARN-polymeraza d dàng kt hp vi nó  t u quá trình sao chép mã. Nh vy AMP v có tác dng làm tng cng quá trình sao chép. Cng có ý kin cho rng phc hp AMP v -CAP-ARN-polymeraza cho phép bt u quá trình sao chép mã.