Hóa miễn dịch tổ chức (1)

Hóa miễn dịch tổ chức Hóa miễn dịch tổ chức Bởi: Nguyễn Bá Tiếp Chuẩn bị hóa chất (ghi chú: MW=molecular weight; khối lượng phân tử) - Cồn tuyệt đối (ethanol absolute, C2H5OH, MW=46.07 g/mol) - Xylene(Xylol, C6H4(CH3)2 MW=106.17 g/mol) - Citric acid monohydrate (C6H8O7H2O, MW=210.14 g/mol) - tri-Sodium citrate dehydrate (C6H5Na3O7.2H2O, MW=294.10 g/mol) - Glycine(MW=75.1 g/mol) - Ethylenediaminetetracetic acid, Disodium salt.2H2O (Na2-EDTA.2H2O, MW: 0372.24 g/mol) - Hydrogen peroxide solution (30%) - Di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous (Na2HPO4, MW=141.96 g/mol) - Sodium chloride (NaCl, MW=58.44 g/mol) - Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4, MW= 136.09 g/mol) - Potassium chloride (KCl, MW074.56 g/mol) - Bovine Albumin (BA) Fraction V Solution 7.5% (7.5g/100ml) - Tween 20 (Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate) - Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol), X-100 - DePex Mounting medium contains Xylene (mixture of isomers), Dibutylphthalate 1/5 Hóa miễn dịch tổ chức - DAB+Chromogen (contains Biphenyl-3, 3’ 4, 4’- tetrayltetraammonium tatrachloride), - Dung dịch Mayer’s Haematoxylin Pha loại dung dịch 1) Cần loại dung dịch: Xylol, nước cất, nước máy, dung dịch ethanol nồng độ 75%, 96%, 100% 2) Pha 0.01 M dung dịch đệm Citrate có pH 6.0: 5,942 g muối ngậm 2.H2O lít nước 3) Pha lít dung dịch đệm (10X PBS): NaCL: 80 g KCl: g Na2HPO4: 11,5 g KH2PO4 : g Trộn hòa tan nước cất Chỉnh pH đến 6.8 (dùng 0.1N HCl) 4) Blocking peroxidase solution: Methanol: 90 ml H2O2 30: 10 ml v.v 5) DAKO antibody diluent 6) Envision polymer reagent: Envision TM/HRP, Rabbit/Mouse (ENV) 7) Mouse anti-proliferating cell nuclear antigen (PCNA) (PC-10); Mouse monoclonal IgG2a, 200 μg/ml 8) Normal Goat serum blocking solution (chuẩn bị trươcs dùng sau: Pha ml: Bovine albumin 7,5%: 400 μl Goat normal serum: 30 μl 1X PBS: 2570 μl 9) Dung dịch Mayer’s Haematoxylin 2/5 Hóa miễn dịch tổ chức 10) DAKO DAB staining Kit: DAB (20μl) + Chromogen solution + Substrate buffer (1 ml) Tiêu gắn parafin Mô cần quan sát cắt microtome gắn parafin phiến kính sau làm khô (để qua đếm nhiệt độ phòng dùng bàn hấp 40 độ) Các bước tiến hành Phương pháp ứng dụng nhuộm quan thụ cảm hormon estrogen beta từ tiêu gắn parafin tử cung, bàng quang, tuyến tiền liệt (do GS Sari Mäkelä, Saija Savolainen, Teija Humerinta, Viện nghiên cứu y sinh Đại học Turku, FINLAND cung cấp) Cần "giải phóng" mô khỏi parafin (deparaffinize): Đánh dấu tiêu (bao gồm thông tin kháng nguyên (antibody), độ pha loãng (dilution) Rửa hộp xylen đặt cạnh (5 phút/1 hộp) Rửa hộp ethanol 100%(x3); 96%(x2); 75%(x1); (2 phút/hộp) Nước cất: phút Đặt phiến kính khay có nâng, phủ phần có gắn mô cần nhuộm 0.01 M Citrate acid buffer pH 6.0 "Nấu" Microwave phút (750 watt) Cho dung dịch đệm citrat đến mức với trước "nấu" để phút nhiệt độ phòng Nhắc lại bước Tiếp tục cho thêm dung dịch đệm acid bù phần hao hụt sau microwave, để 30 phút nhiệt độ phòng Đặt phiến kính nước cất phút 10 Đặt hộp ethanol theo nồng độ tăng dần:75% (x1); 96% (x2); 100% (x1) (2 phút/hộp) 11 Peroxidase activity blocking: 3% H2O2 Methanol, 30 phút (1ml/lam kính) 3/5 Hóa miễn dịch tổ chức 12 Ethanol 100%(x1); 96% (x2); 75% (x1) (2 phút/hộp) 13 Nước cất phút 14 Rửa hai lần 1XPBS (5 phút/hộp; vẩy nhẹ) 15 Đặt lam kính đỡ đặt mặt hộp nhựa có chứa dung dịch đệm để làm ẩm (lưu ý không để mô gắn lam kính bị khô) 15 Blocking of non-specific binding of immunoglobulin with Normal Goat serum blocking solution **For ml: Bovine albumin 7.5% (400μl)+Goat normal serum(30 μl)+ 1X Phủ hoàn toàn bề mặt mô (khoảng 500ul/lam kính) Ủ nhiệt độ phòng 30 phút 16 Rửa 1X PBS tiếp tục đặt 1X PBS phút (2 lần); vẩy nhẹ 17 Phủ primary antibody (1:800) (khoảng 200 μl/lam kính) Ủ 45 phút nhiệt độ phòng (Lam kính đối chứng phủ 1X PBS) 18 Rửa 1X PBS chuyển vào hộp chứa 1X PBS (3 lần, phút/hộp; vẩy nhẹ) (Chú ý: Đặt lam kính đỡ đặt hộp, phủ phía phiến kính kính giấy tráng nhôm để tránh ánh sáng) 19 Phủ phần mô gắn secondary antibody; để nhiệt độ phòng 30 phút(khoảng 200 μl/lam kính) 20 Rửa 1X PBS đặt 1X PBS phút/hộp (2 hộp), vẩy nhẹ) 21 Rửa DAB từ 10 đến 15 phút (200 μl /lam kính) đến phần mô nhuộm chuyển sang màu nâu 22 Rửa nước cất sau cho vào hộp nước cất phút, vẩy nhẹ 23 "Nhúng" lam kính Haematoxylin khoảng 15 giây 24 Rửa nước máy phút sau đặt vòi nước chảy 5-10 phút 25 Rửa hộp nước cất phút 26 Ethanol: 75% (x1); 96% (x2); 100% (x3) (3 phút/hộp) 4/5 Hóa miễn dịch tổ chức 27 Xylen (x3) (5 phút/hộp) 28 Gắn lamen; tiêu sẵn sàng để quan sát kính hiển vi!!!! 5/5 .. .Hóa miễn dịch tổ chức - DAB+Chromogen (contains Biphenyl-3, 3’ 4, 4’- tetrayltetraammonium tatrachloride), - Dung dịch Mayer’s Haematoxylin Pha loại dung dịch 1) Cần loại dung dịch: Xylol,... Bovine albumin 7,5%: 400 μl Goat normal serum: 30 μl 1X PBS: 2570 μl 9) Dung dịch Mayer’s Haematoxylin 2/5 Hóa miễn dịch tổ chức 10) DAKO DAB staining Kit: DAB (20μl) + Chromogen solution + Substrate... 3/5 Hóa miễn dịch tổ chức 12 Ethanol 100%(x1); 96% (x2); 75% (x1) (2 phút/hộp) 13 Nước cất phút 14 Rửa hai lần 1XPBS (5 phút/hộp; vẩy nhẹ) 15 Đặt lam kính đỡ đặt mặt hộp nhựa có chứa dung dịch