Vi khuẩn e coli là đối tượng mô hình tốt nhất (1)

Vi khuẩn E.coli đối tượng mô hình tốt Vi khuẩn E.coli đối tượng mô hình tốt Bởi: Nguyễn Lân Dũng PGS TS Phạm Thành Hổ Vi khuẩn E.coli đối tượng mô hình tốt Escherichia coli (E.coli) vi khuẩn nghiên cứu kĩ nhất, nhiều chủng khác phân lập Ba dòng thường gặp phòng thí nghiệm di truyền E.coli B (tế bào chủ cho phage dãy T), E.coli C (tế bào chủ cho phage mạch ϕX 174) E.coli K12 (tế bào chủ phage λ) Do thuận tiện nuôi cấy, nhân giống, thu nhận đột biến dễ phân tích kiện di truyền hoi Đến nay, coi đối tượng mô hình số Sinh học phân tử công nghệ gen Các liệu di truyền học E coli – Kích thước gen (Genome size): 4,6 Mb – Nhiễm sắc thể: phân tử ADN vòng tròng – Số lượng gen: 4.000 – Phần trăm gen tương đồng với người: 8% – Kích thước trung bình gen: kb, intron – Các transposon: tùy chủng, ~ 60 sao/bộ gen Kết thúc giải ký tự chuỗi: 1997 Các phương pháp phân tích di truyền Ngoài phương pháp lai để phân tích tái tổ hợp (recombination) bổ trợ (complementation), có nhiều kỹ thuật biến đổi di truyền (Techniques of Gentic Modification): 1/5 Vi khuẩn E.coli đối tượng mô hình tốt – Gây đột biến (Mutagensis): • Hóa chất chiếu xạ: đột biến xoma ngẫu nhiên • Dùng transposon: xen đoạn (Insertions) xoma ngẫu nhiên – Chuyển gen (Transgensis): • Trên vector plasmid: tự hay chèn vào (integratd) • Trên vector phage: tự hay chèn vào (integratd) • Biến nạp: chèn vào – Làm im lặng gen mục tiêu (Targeted gen knockout): • Alen không (Null alen) vector: thay gen tái tổ hợp • Alen thiết kế (Engineered alen) vector: đột biến điểm định hướng (Site-directed mutagensis) thay gen E.coli tế bào chủ kỹ thuật di truyền Các nghiên cứu E coli làm sở cho đời kỹ thuật di truyền E coli đóng vai trò chủ yếu chuyển gen đến sinh vật khác Nó sinh vật chuẩn để tạo dòng gen (cloning gens) sinh vật E coli coi tế bào vật chủ đơn giản công nghệ gen Vi khuẩn E coli dễ dàng chấp nhận nhiều loại vector chuyển gen plasmid hay phage qua biến nạp hay tải nạp Những protein tái tổ hợp insulin, xomatostatin đến hàng trăm protein khác tạo dòng E coli vào sản xuất công nghiệp với thị trường hàng chục tỷ USD/năm Các đóng góp chủ yếu E.coli – Đối tượng chủ yếu cho nghiên cứu: • • • • Sao chép, phiên mã, dịch mã tái tổ hợp Đột biến Điều hòa biểu gen (Gen regulation) Kỹ thuật ADN tái tổ hợp (recmbinant ADN technology) – Đóng góp cho nghiên cứu lĩnh vực khác: Trao đổi chất tế bào (Cell metabolism), gen ức chế vô nghĩa (Nonsense suppressors), tuyến tính (Colinearity) gen polypeptit, Operon, đề kháng thuốc dựa vào plasmid (Plasmid-bazơd drug resistance) vận chuyển tích cực (Active transport) 2/5 Vi khuẩn E.coli đối tượng mô hình tốt Các enzym protein tham gia tổng hợp cắt nucleic axit Sao chép ADN nghiên cứu chi tiết E coli, mà phần chủ yếu nêu chương II Ở đây, số chi tiết bổ sung, cụ thể phức hợp enzym tách mạch ADN mẹ tổng hợp mạch (bảng dưới) Hàng loạt enzym protein, mà phần lớn phức hợp protein đa phân, tham gia tổng hợp ADN, phiên mã tạo ARN Cả tế bào nhân sơ lẫn nhân chuẩn có hoạt tính ADN polymeaz đa Một số ADN polymeaz hoạt động enzym độc lập, số khác (chủ yếu replicaz) kết thành phức hợp lớn nhiều protein Tiểu phần (subunit) tổng hợp nhiều chức khác replicaz tháo xoắn (unwinding), khởi tổng hợp mạch mới, … Các enzym tham gia chép ADN vi khuẩn E coli Enzym Gen mã hoá Chức ADN polymeaz III polC; Enzym polyme hoá chủ yếu ADNE,Q,N,X; ADN polymeaz I polA-E; mutD.polA Cắt mồi ARN, lắp chỗ trống Helicaz ADN B Tháo xoắn chẻ ba chép Primaz ADN G Tạo mồi mạch ADN Protein gắn điểm khởi (Origin-binding protein) ADN A Gắn điểm khởi chép (Ori); tạo thuận lơi cho mở tách mạch Protein căng mạch SSB ssb (Single-strand binding protein) Ngăn mạch đơn tách không chập lại ADN ligaz Nối đầu hở ADN ligA, ligB Các enzym ADN polymeaz vi khuẩn E coli Enzym Gen mã hoá Chức ADN polymeaz I polA; ADNE,Q,N,X Enzym phục hồi chủ yếu Cắt mồi ARN lắp kín khoảng trống ADN polymeaz II holA-E; mutD Enzym phục hồi phụ (minor) ADN polymeaz III polB Replicaz, polyme hoá chủ yếu 3/5 Vi khuẩn E.coli đối tượng mô hình tốt ADN polymeaz IV polC ADN polymeaz V ADN B umuD’ Phục hồi cấp cứu (SOS repair) 2C Phục hồi cấp cứu (SOS repair) Ở E coli tìm biết chức của5 loại ADN polymeaz (bảng trên) Sự phân hủy nucleic axit đòi hỏi enzym đặc hiệu: – Deoxyribonucleaz (ADNaz)là enzym cắt liên kết phân tử ADN Nó cắt mạch đơn hay kép Gyraz loại enzym topoixomrazcắt ADN làm tháo xoắn – Ribonucleaz (ARNaz)là enzym cắt ARN, đặc hiệu ARN mạch đơn hay mạch kép Các nucleaz chia thành nhóm: – Exonucleazcắt từngnucleotit từ đầu mút mạch polynucleotit; chúng đặc hiệu đầu mút 5’ hay 3’ ADN hay ARN • Endonucleazcắt liên kết bên mạch ADN; chúng đặc hiệu ARN hay ADN mạch đơn mạch kép Cấu trúc chức tiểu phần ADN polymeaz III: Tất ADN polymeaz có tính chất cấu trúc chung giống Replicaz ADN polIII holoenzym 900 kD (kilodalton), phức hợp gồm 10 phân tử protein (hình 6.12) Đặc biệt protein vòng β (β-ring) làm móc (clamp) bao ADN để trượt trước mà mạch đơn không bị bong chép Ngoài ra, ADN polymeaz phải có khả nhận biết loại N chất phản ứng phụ thuộc vào chỗ "đọc" mạch khuôn Sao chép ADN E coli diễn với tốc độ nhanh, đạt đến 50.000 nucleotit/ phút Thật khó hình dung trình phức tạp, thưc xác, mà diễn với tốc độ nhanh vậy, chưa kể đến việc N tập trung với nồng độ cao đáp ứng kịp thời cho nhu cầu 4/5 Vi khuẩn E.coli đối tượng mô hình tốt Replicaz ADN pol III phức hợp gồm 10 protein 5/5 ... Thật khó hình dung trình phức tạp, thưc xác, mà diễn với tốc độ nhanh vậy, chưa kể đến vi c N tập trung với nồng độ cao đáp ứng kịp thời cho nhu cầu 4/5 Vi khuẩn E.coli đối tượng mô hình tốt Replicaz... plasmid (Plasmid-bazơd drug resistance) vận chuyển tích cực (Active transport) 2/5 Vi khuẩn E.coli đối tượng mô hình tốt Các enzym protein tham gia tổng hợp cắt nucleic axit Sao chép ADN nghiên cứu... Enzym phục hồi phụ (minor) ADN polymeaz III polB Replicaz, polyme hoá chủ yếu 3/5 Vi khuẩn E.coli đối tượng mô hình tốt ADN polymeaz IV polC ADN polymeaz V ADN B umuD’ Phục hồi cấp cứu (SOS repair)