ỨNG DỤNG CỦA XẠ KHUẨN TRONG THUỐC KHÁNG SINH

MỤC LỤC I Khái quát chung xạ khuẩn Khái niệm xạ khuẩn .3 Phân bố xạ khuẩn tự nhiên 3 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn Cấu tạo xạ khuẩn Các phương pháp phân loại xạ khuẩn đại Một số ứng dụng xạ khuẩn II Ứng dụng xạ khuẩn thuốc kháng sinh Lịch sử hình thành chất kháng sinh .7 Sự hình thành chất kháng sinh xạ khuẩn Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh Quy trình công nghệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis .10 III Một số nghiên cứu liên quan đến xạ khuẩn 14 Page LỜI MỞ ĐẦU Việt Nam nước nông nghiệp nằm vùng nhiệt đới nóng ẩm Mưa điều kiện thuận lợi cho VSV phát triển, đặc biệt VSV gây bệnh thực vật Vì việc sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật từ lâu phổ biến Việt Nam Song việc sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật thường độc hại tồn dư đất, nước nông sản ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khoẻ người, gây ô nhiễm môi trường cân sinh thái Chính vậy, với chiến lược sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế phát triển quần thể ký sinh Một hướng nghiên cứu theo xu hướng sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế quần thể VSV gây bệnh Trong số tác nhân sinh học thường sử dụng để ức chế VSV gây bệnh, xạ khuẩn nhóm có nhiều tiềm tỷ lệ loài có khả sinh CKS cao, có nhiều CKS có khả chống nấm mạnh Page ỨNG DỤNG CỦA XẠ KHUẨN TRONG THUỐC KHÁNG SINH I Khái quát chung xạ khuẩn Khái niệm xạ khuẩn Xạ khuẩn (danh pháp khoa học: Actinobacteria; tiếng Anh: Actinomycetes) nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi tự nhiên Trước xếp vào Tản thực vật (tức nấm), ngày chúng xếp vào vi khuẩn (Schizomycetes) Phân bố xạ khuẩn tự nhiên Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi tự nhiên Chúng có đất, nước, rác, phân chuồng,bùn, chí chất mà vi khuẩn nấm mốc không phát triển Sự phân bố xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác thảm thực vật Theo Waksman gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm - 45% tổng số VSV Sự phân bố xạ khuẩn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, chúng có nhiều lớp đất trung tính kiềm yếu axit yếu 6,8 - 7,5 Xạ khuẩn có lớp đất kiềm axit lớp đất kiềm, số lượng xạ khuẩn đất thay đổi theo thời gian năm Đặc điểm hình thái xạ khuẩn  Khuẩn lạc Đặc điểm bật xạ khuẩn có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử hình thành bào tử) Kích thước khối lượng hệ sợi thường không ổn định phụ thuộc vào điều kiện sinh lý nuôi cấy Kích thước hình dạng khuẩn lạc thay đổi tuỳ loài tuỳ vào điều kiện nuôi cấy thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm… Khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài điều kiện ngoại cảnh Khuẩn lạc có lớp, lớp vỏ có dạng sợi bện chặt, lớp tương đối xốp, lớp có cấu trúc tổ ong Khuẩn ty lớp có chức sinh học khác Các sản phẩm trình trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu cơ…có thể tích luỹ sinh khối tế bào xạ khuẩn hay tiết môi trường  Khuẩn ty Trên môi trường đặc, hệ sợi xạ khuẩn phát triển thành loại: loại cắm sâu vào môi trường gọi hệ sợi chất (khuẩn ty chất substrate mycelium) với chức chủ yếu dinh dưỡng Một loại phát triển bề mặt Page thạch gọi hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh aerial mycelium) với chức chủ yếu sinh sản Nhiều loại có hệ sợi chất có loại (như chi Sporichthya) lại có hệ sợi khí sinh Khi HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng Cấu tạo xạ khuẩn Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự vi khuẩn Gram dương, toàn thể tế bào bao gồm thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân thể ẩn nhập Thành tế bào xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác dụng trì hình dáng khuẩn ty, bảo vệ tế bào Thành tế bào gồm lớp: Lớp cùng, lớp rắn chắc, lớp dày Thành tế bào xạ khuẩn không chứa xenllulose kitin chứa nhiều enzym tham gia vào trình trao đổi chất trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào Căn vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn chia thành nhóm chính:  Nhóm I: Thành phần thành tế bào axit L - 2,6 diaminopimelic (L - ADP) glyxin Chi Streptomyces thuộc nhóm  Nhóm II: Thành phần thành tế bào axit meso - 2,6 diaminopimelic (m - ADP) glyxin  Nhóm III: Thành phần thành tế bào axit meso - 2,6 diaminopimelic  Nhóm IV: Thành phần thành tế bào axit meso - 2,6 diaminopimelic, arabinose galactose Dưới lớp thành tế bào màng sinh chất dày khoảng 50 nm cấu tạo chủ yếu thành phần photpholipit protein Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trình trao đổi chất trình hình thành bào tử xạ khuẩn Nguyên sinh chất nhân tế bào xạ khuẩn khác biệt lớn so với tế bào vi khuẩn Trong nguyên sinh chất xạ khuẩn chứa mezoxom thể ẩn nhập Các phương pháp phân loại xạ khuẩn đại  Đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy Đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy thông tin quan trọng để phân loại xạ khuẩn Để làm cho chủng xạ khuẩn cần định loại biểu đầy đủ đặc điểm, người ta thường xuyên nuôi cấy chúng môi trường dinh dưỡng khác điều kiện nhiệt độ thời gian định Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh ghi lại đặc điểm hình thái nuôi cấy xạ khuẩn, đặc biệt quan mang bào tử, hình dạng bề mặt bào tử Theo Pridham cộng [38], cuống sinh bào tử chia thành nhóm: RF cho cuống sinh bào tử thẳng lượn sóng RA cho cuống sinh bào tử xoắn, thô sơ ngắn S cho cuống sinh bào tử phát triển mạnh xoắn Việc sử dụng đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy coi Page liệu dùng phân loại xạ khuẩn Tuy nhiên ta biết xạ khuẩn không bền vững mặt di truyền, thường xuyên xảy xếp lại phân tử DNA Trong loài biểu khác hình thái hay loài khác giống mặt hình thái Vì để phân loại xác, ngày người ta phải dùng thêm tiêu khác bổ sung đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học hay sinh học phân tử  Đặc điểm hóa phân loại Đặc điểm hóa phân loại sử dụng rộng rãi hiệu vòng 20 năm trở lại Đây phương pháp có hiệu thông qua việc định tính định lượng thành phần hóa học tế bào VSV Hóa phân loại chủ yếu dựa vào đặc điểm sau: - Typ thành tế bào dựa sở phân tích axit amin thành phần peptit đường thành tế bào hay polysaccarit gắn vào thành tế bào - Typ peptidoglycan (PG) dựa vào thông tin thành phần cấu trúc mạch tetrapeptit PG cầu nối peptit liên kết mắt xích PG - Axit mycolic phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi Nocardia, Rhodococus, Mycobacterium cornebacter Đây đặc điểm phân loại cho chi - Axit béo thường sử dụng phân loại axit béo bão hòa mạch thẳng không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso enteiso metyl hóa nguyên tử cacbon thứ 10 Sự có mặt axit 10 - metylloctade canoit (axit tubereulostearinoic) đặc điểm để phân loại đến chi - Photpholipit có typ photpholipit (P I, PII, PIII, PIV, PV) có thành phần đặc trưng có ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn Trong phân loại xạ khuẩn typ thành tế bào đặc điểm quan trọng Khi muốn đưa loài mô tả loài có ý nghĩa đó, người ta không xác định thành tế bào  Đặc điểm sính lý – sinh hóa Để phân loại xạ khuẩn đến loài, người ta sử dụng hàng loạt đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác khả đồng hóa nguồn cacbon nitơ, nhu cầu chất kích thích sinh trưởng, khả biến đổi chất khác nhờ hệ thống enzym Nhu cầu oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả chịu muối yếu tố khác môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng phát triển khác nhau, tính chất đối kháng nhạy cảm với chất kháng sinh, khả tạo thành chất kháng sinh sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác xạ khuẩn Hopwood (1975) khẳng định phần lớn đặc điểm sinh lý – sinh hóa đặc điểm nuôi cấy dễ bị biến động có giá trị thấp mặt phân loại Do tính không ổn định biến dị cao xạ khuẩn mà ngày nguyên tắc sử dụng đặc điểm sinh lý - sinh hóa để phân loại xạ khuẩn phải thay đổi  Phân loại số Để phát loài sở khác đặc điểm sinh lý, sinh hóa người ta sử dụng kết dựa phân loại số Page Phương pháp dựa đánh giá số lượng mức độ giống VSV theo số lớn đặc điểm chủ yếu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Để so sánh chủng xạ khuẩn với đôi một, người ta vào hệ số giống (hệ số S - Similarity) có công thức tính hệ số S hay sử dụng - Công thức Sokal Michener (SSM ) - Công thức Jacard (SJ) Kết cuối phân loại số vẽ sơ đồ phân nhánh (kiểu "rễ cây") thông số Ở sơ đồ chủng giống nhiều xếp vào nhóm Bằng phân loại số người ta chia xạ khuẩn chi Streptomyces thành nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ 13 cụm với đại diện định  Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces Chi Streptomyces giống xạ khuẩn bậc cao Wakman Henrici đặt tên năm 1943 Đây chi có số lượng loài mô tả lớn Các đại diện chi có HSKS HSCC phát triển phân nhánh Đường kính sợi xạ khuẩn khoảng - 10 µm, khuẩn lạc thường không lớn có đường kính khoảng - mm Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào chất Bề mặt khuẩn lạc thường phủ KTKS dạng nhung, dày chất, có tính kỵ nước Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bào tử Trên đầu sợi khí sinh hình thành cuống sinh bào tử chuỗi bào tử Cuống sinh bào tử có hình dạng khác tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng Bào tử hình thành cuống sinh bào tử hai phương pháp phân đoạn cắt khúc Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5 µm Màng bào tử nhẵn, gai, khối u, nếp nhăn tùy thuộc vào loài xạ khuẩn môi trường nuôi cấy Thường môi trường có nguồn đạm vô glucoza, bào tử biểu đặc điểm rõ Màu sắc khuẩn lạc hệ sợi khí sinh khác tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc biến đổi nuôi cấy môi trường khác Vì mà ủy ban Quốc tế phân loại xạ khuẩn ISP nêu môi trường chuẩn phương pháp chung để phân loại nhóm VSV Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, dị dưỡng chất hữu Nhiệt độ tối ưu thường 25 - 30 0C, pH tối ưu 6,5 - 8,0 Một số loài phát triển nhiệt độ cao thấp (xạ khuẩn ưa nhiệt ưa lạnh) Xạ khuẩn chi có khả tạo thành số lượng lớn CKS ức chế vi khuẩn, nấm sợi, tế bào ung thư, virus nguyên sinh động vật Cho đến để xác định thành phần loài chi Streptomyces, nhà phân loại sử dụng hàng loạt điều kiện khóa phân loại khác Một số ứng dụng xạ khuẩn Đặc tính xạ khuẩn khả tiết kháng sinh (antibiotic), dùng làm thuốc điều trị bệnh cho người gia súc trồng Xạ khuẩn có khả sinh vitamin thuộc nhóm B, số acid amin acid hữu Xạ khuẩn Page có khả tiết enzym (proteas, amylaz ) tương lai dùng xạ khuẩn để chế biến thực phẩm thay cho nấm vi khuẩn nấm sinh aflatonxin độc cho người gia súc II Ứng dụng xạ khuẩn thuốc kháng sinh Lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh Theo định nghĩa Outchinnikov Chất kháng sinh chất có nguồn gốc thiên nhiên sản phẩm cải biến chúng đường hóa học có khả tác dụng chọn lọc phát triển VSV, tế bào ung thư nồng độ thấp Người đặt móng cho khoa học nghiên cứu CKS Alexander Fleming - Nhà sinh vật học người Anh, phát penixillin vào tháng 10 năm 1928 Sau thập kỷ, nhờ nỗ lực hợp tác nhà vi sinh học sinh hóa học Anh, Mỹ, penixillin nghiên cứu, sản suất với số lượng lớn trở thành "một loại thuốc thần kỳ" Năm 1945, A.Fleming, E Chain H.W.Florey nhận giải thưởng Nobel khám phá giá trị to lớn penixillin mở kỷ nguyên y học - kỷ nguyên kháng sinh Những năm 1940 - 1959 coi thời kỳ hoàng kim việc nghiên cứu CKS với hàng loạt CKS liên tiếp phát như: gramixidin, tiroxidin Rene' Jules Dubos phát năm 1939, streptomycin Waksman phát năm 1941, erythomycin Gurre phát năm 1952 Cùng với việc phát CKS mới, công nghệ lên men sản xuất CKS đời dần hoàn thiện Ngay từ năm 1950, CKS nghiên cứu sử dụng việc phòng chống bệnh, kích thích tăng trưởng động vật nuôi trồng CKS thu hút quan tâm nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác giới Tốc độ tìm kiếm CKS thời gian gần diễn nhanh chóng, nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học y học, dược phẩm nông nghiệp nhiều nước giới liên tục phát hàng loạt CKS có giá trị ứng dụng thực tiễn Năm 1999 kháng sinh khác phát có tác dụng ngăn chặn tượng cholesterol, tăng sức đề kháng chất độc chuột, kháng sinh có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh Đó kháng sinh loposomal HA - 92, tách từ xạ khuẩn Streptomyces CDRLL - 312 Năm 2003, nhiều nước giới tiếp tục phát hàng loạt CKS Tại Nhật Bản, chất kháng sinh yatakemycin tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces sp TP - A0356 phương pháp sắc kí cột CKS có khả kìm hãm phát triển nấm Aspergillus fumigalus Candida albicans Ngoài chất có khả chống lại tế bào ung thư với giá trị Mic 0,01- 0,3 mg/ml Năm 2007, Hàn Quốc phân lập loài xạ khuẩn Streptomyces sp C684 sinh CKS laidlomycin, chất tiêu diệt tụ cầu kháng Page methicillin cầu khuẩn kháng vancomycin Ngày nay, với phát triển mạnh mẽ sinh học đại hỗ trợ nhiều ngành khoa học khác giúp cho việc tìm kiếm ứng dụng CKS đạt thành tựu rực rỡ Để sản xuất CKS người không tìm kiếm chủng VSV sinh CKS từ tự nhiên mà cải tạo chúng nhiều phương pháp dùng kỹ thuật di truyền công nghệ gene, gây đột biến định hướng, chọn dòng gene sinh tổng hợp, tạo dung hợp tế bào trần để tạo chủng có HTKS cao, đồng thời nhằm mục đích tìm kiếm loại kháng sinh quý thời gian ngắn Những thành tựu gần sinh học phân tử tái tổ hợp ADN, kỹ thuật tách dòng gene biểu tổng hợp vi khuẩn E.coli đem lại kết to lớn phát triển chủng giống mà mở phương hướng đầy triển vọng sản xuất CKS Sự hình thành chất kháng sinh xạ khuẩn Một đặc điểm quan trọng xạ khuẩn khả hình thành CKS Trong số 8000 CKS biết giới có 80% có nguồn gốc từ xạ khuẩn Một tính chất CKS có nguồn gốc từ VSV nói chung từ xạ khuẩn nói riêng có tác dụng chọn lọc Mỗi CKS có tác dụng với nhóm VSV định Hầu hết CKS có nguồn gốc xạ khuẩn có phổ kháng khuẩn rộng Khả kháng khuẩn CKS đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn Có nhiều quan điểm khác khả hình thành CKS Một số tác giả cho hình thành CKS chế giúp cho VSV tồn môi trường tự nhiên Số khác cho rằng, hình thành CKS cạnh tranh môi trường dinh dưỡng Hầu hết tác giả cho kháng sinh sản phẩm chuyển hóa thứ cấp hình thành vào cuối pha tích lũy thừa, đầu pha cân chu kỳ sinh trưởng Mặc dù CKS có cấu trúc khác VSV sinh chúng đa dạng, trình sinh tổng hợp chúng theo số đường định • CKS tổng hợp từ chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua chuỗi phản ứng enzym • CKS hình thành từ hai ba chất chuyển hóa sơ cấp khác • CKS hình thành đường polyme hóa chất chuyển hóa sơ cấp, sau tiếp tục biến đổi qua phản ứng enzym khác Nhiều chủng xạ khuẩn có khả tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS có cấu trúc hóa học có tác dụng tương tự Quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc vào chế điều khiển đa gene, gene chịu trách nhiệm tổng hợp CKS, có gene chịu trách nhiệm tổng hợp tiền chất, enzym cofactor Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh  Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy Page  Nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng khả tổng hợp CKS xạ khuẩn Đa số xạ khuẩn phát triển tốt nhiệt độ 28 - 30 0C, nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng tổng hợp CKS thường nằm khoảng 18 - 280C  pH môi trường Sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc nhiều vào pH môi trường pH tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo tế bào, đến hoạt lực enzym tác động gián tiếp qua môi trường pH thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thường trung tính, pH kiềm hay axit ức chế trình tổng hợp CKS  Độ thông khí Xạ khuẩn loại VSV có nhu cầu thông khí cao so với VSV khác, giai đoạn nhân giống (khoảng từ thứ đến thứ 12 trình nuôi cấy) Do để đảm bảo thông khí tốt, người ta thường bổ sung vào môi trường lên men benzilthioxyanat làm tăng khả hòa tan oxy Nồng độ oxy thích hợp cho sinh tổng hợp CKS - 8ml O2/ 100ml môi trường lên men  Tuổi giống Việc tổng hợp CKS không phụ thuộc vào điều kiện lên men, mà phụ thuộc vào chất lượng bào tử giống sinh dưỡng Tuổi giống cấy truyền vào môi trường lên men cho hiệu suất CKS cao thường 24 tuổi Lượng giống cấy truyền khoảng từ - 10%  Ảnh hưởng thành phần môi trường lên men CKS sản phẩm thứ cấp nên trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc chặt chẽ vào thành phần môi trường dinh dưỡng Trước hết nguồn cacbon, nitơ, tỷ lệ C/N chất khoáng  Nguồn cacbon Các hợp chất cacbon có ý nghĩa hàng đầu sinh trưởng hình thành CKS Đối với nhiều chủng xạ khuẩn, nguồn cacbon thích hợp tinh bột Tuy nhiên, tùy chủng khác mà khả sử dụng loại đường khác nhau, có chủng sử dụng tốt loại đường đơn glucoza, mannoza, fructoza có chủng sử dụng tốt loại đường đôi sacaroza, maltoza Ngoài số chủng sử dụng loại acid hữu chất béo làm nguồn thức ăn cacbon lên men sinh CKS  Nguồn nito Hầu hết chủng xạ khuẩn sinh CKS đòi hỏi hai nguồn nitơ hữu vô Nguồn nitơ hữu thích hợp thường hợp chất từ thực vật bột đậu tương, cao ngô Cao ngô nguồn bổ sung nitơ protein, nhiên lượng phốt phát vô cao ngô cao ức chế sinh tổng hợp CKS[27] Nguồn nitơ vô thường sử dụng muối amon Muối nitrat không thích hợp cho sinh tổng hợp CKS nhiều chủng xạ khuẩn  Nguồn photphat vô Photphat vô đóng vai trò tác nhân điều chỉnh sinh tổng hợp CKS Nồng độ photphat thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thường không vượt 10 mg/ml Nồng độ photphat ban đầu cao làm tăng lượng axit nucleic dẫn đến kéo Page dài pha sinh trưởng, rút ngắn pha tổng hợp, làm tăng ATP tế bào, dẫn đến giảm ngừng hẳn sinh tổng hợp CKS  Các yếu tố vi lượng Đây thành phần thiếu môi trường lên men Nếu môi trường lên men có nguồn dinh dưỡng tự nhiên hầu hết nguyên tố vi lượng có sẵn Việc bổ sung chất giàu nguyên tố vi lượng vào môi trường làm thay đổi đáng kể khả tổng hợp CKS nhiều chủng xạ khuẩn  Hình thức lên men Trong tổng hợp CKS, phương pháp nuôi cấy yếu tố định Khi nuôi cấy bề mặt, đặc điểm hai pha thường không quan sát thấy CKS tạo thành suốt pha sinh trưởng Quá trình sản xuất CKS thường tiến hành theo phương pháp nuôi cấy chìm nồi lên men có cách khuấy đảo sục khí Quy trình công nghệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis Vancomycin chất kháng sinh sử dụng rộng rãi có tác dụng tích cực chữa bệnh Các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học (Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam) nghiên cứu điều kiện thích hợp sản xuất vancomycin từ biến chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis nhận từ xử lý N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) lên tế bào trần chủng gốc Vancomycin chất kháng sinh thuộc nhóm glycopeptid có tác dụng tích cực điều trị bệnh, coi phương thuốc cuối có khả điều trị bệnh nhiễm trùng nguy hiểm chủng vi sinh vật kháng methicillin (chất kháng sinh nhóm β-lactam) gây nên Vancomycin đưa vào chữa bệnh từ 40 năm qua, ngày coi kháng sinh quan trọng hiệu chữa bệnh cao dùng phối hợp với kháng sinh khác, chống lại vi khuẩn nhờn với nhiều loại kháng sinh thông dụng Bởi vậy, việc nghiên cứu sinh tổng hợp vancomycin quan tâm, phát triển, để từ hình thành nên hệ kháng sinh có hiệu chữa bệnh cao Hơn nữa, nghiên cứu lên men vancomycin nắm vững quy trình sản xuất chất kháng sinh tạo tiền đề cho việc xây dựng sở sản xuất chất kháng sinh quy mô công nghiệp điều kiện Việt Nam, góp phần thực mục tiêu tới năm 2020 sản xuất 50% tổng số thuốc, Bộ Y tế đề Trong bối cảnh vậy, việc nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vancomycin nguyên liệu nước, phù hợp với điều kiện kinh tế môi trường khí hậu Việt Nam cần thiết Cùng với nó, việc triển khai xây dựng sở sản xuất kháng sinh với công suất 500 kg/năm góp phần phục vụ công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng a Chủng giống vi sinh vật Chủng xạ khuẩn Streptomycws orientalis 4912 chủng vi sinh vật kiểm định Bacillus subtilis ATCC 6633, B cereus ATCC 21778, Staphylococcus aureus 209P, Sarcina lutea Eschrochia coli PA2 (Bộ sưu tập giống Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học); hóa chất dung để phân tích, định Page 10 lượng vancomycin chuẩn (Merck) môi trường nghiên cứu Gause 1, A4, A-4H, TH447, A12, A-9, 48 A Hình dạng khuẩn lạc, B Cuống sinh bào tử, C Bào tử Hình 1: Chủng xạ khuẩn Streptomycws orientalis 4912 b Lựa chọn môi trường điều kiện lên men sinh kháng sinh chủng S.orientalis 4912 Thử nghiệm lên men số môi trường thường dùng lên men sinh kháng sinh xạ khuẩn cho thấy, chủng S orientalis 4912 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh lựa chọn môi trường MT48 cho hoạt tính kháng sinh cao làm môi trường sở để nghiên cứu ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng điều kiện lên men đến khả tạo kháng sinh Hình 2: Hoạt tính kháng sinh chủng S orientalis 4912 Chủng S orientalis 4912 sử dụng tốt nguồn đường saccharose với hàm lượng thích hợp 3%, cho hoạt tính kháng sinh cao Trong số nguồn nitơ thử nghiệm bột đậu tương cho hoạt tính kháng sinh cao nhất, với hàm lượng 0,2% thích hợp Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ pH cho thấy, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng, phát triển sinh tổng hợp kháng sinh chủng S.orientalis 4912 280C pH từ đến Lượng giống cấy vào môi trường lên men thích hợp - % so với môi trường lên men Nghiên cứu động thái trình lên men chủng S orientalis 9412 cho thấy, sinh khối hoạt tính kháng sinh tăng dần đạt cực đại sau 120 lên men Như vậy, động thái trình lên men chủng có đặc trưng giống chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh khác c Nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng S.orientalis 4912 Trước hết, nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phương pháp gây chủng đột biến tia UV Kết nghiên cứu khả sống sót tế bào trần bào tử chủng S orientalis 4912 sau xử lý UV độ sống sót từ 1-10%, Page 11 kiểm tra hoạt tính kháng sinh theo phương pháp cục thạch cho thấy, khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng tăng lên từ 8-30,3% xử lý bào tử 66,33% xử lý tế bào trần Hình 3: Khả sống sót tế bào trần bào tử Hình 4: Hoạt tính kháng sinh khuẩn lạc chủng S orientalis 4912 chủng S orientalis 4912 xác định phương sau xử lý UV pháp cục thạch (A) đục lỗ (B) MNNG Sau đó, nhà khoa học tiếp tục áp dụng phương pháp thứ hai, gây chủng đột biến MNNG Trên sở lựa chọn nồng độ MNNG, pH thời gian xử lý thích hợp để xử lý bào tử tế bào trần tỷ lệ biến chủng có hoạt tính kháng sinh cao chủng gốc 80,8 92,86 % Kết nhận biến chủng S orientalis 4912-81-61 (xử lý tế bào trần MNNG) có hoạt tính kháng sinh cao 1683 mcg/ml, lựa chọn cho nghiên cứu điều kiện lên men sản xuất vancomycin (hoạt tính kháng sinh chủng gốc 866 mcg/ml) d Lựa chọn môi trường điều kiện lên men vancomycin chủng đột biến Dựa môi trường lên men thích hợp cho chủng S orientalis 4912, tiến hành lựa chọn môi trường lên men tối ưu theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm Box-Wilson cho biến chủng S orientalis 4912-81-61 sau Saccharose 49,8 g/l; glucose 17 g/l; bột đậu tương 30,6 g/l; NaCl 2,5 g/l; CaCO g/l; CaCl2 40 mg/l; CuSO4 10 mg/l Ảnh hưởng yếu tố điều kiện lên men cho thấy, tỷ lệ tiếp giống 4%, nhiệt độ lên men tối ưu 28oC nồng độ pH thích hợp Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng oxy hòa tan (dO2) môi trường tới sinh trưởng sinh tổng hợp vancomycin, thí nghiệm lên men biến chủng S orientalis 4912-81-61 thực hệ thống Bioflo 110 dung tích 7,5 lit với điều kiện pH, nhiệt độ tỉ lệ giống xác định Kết xác định sinh khối khô hoạt tính kháng sinh sau 120 lên men cho thấy, dO2 trì mức 2030% lượng vancomycin sinh khối đạt cao nhất, tương ứng 2983 mcg/ml 9,8 mg/ml Như vậy, kết thí nghiệm cho thấy việc cung cấp đủ oxy hòa tan bảo đảm đảo trộn tốt bình lên men điều kiện thiết yếu sản xuất vancomycin Để xác định thời điểm thu hồi vancomycin thích hợp nhất, biến chủng S orientalis 4912-81-61 nuôi thiết bị lên men Bioflo 110 dung tích với Page 12 thành phân môi trường lên men tối ưu cho thấy, biến chủng phát triển tốt bình lên men, đặc biệt từ thứ 48 sinh khối chủng tăng nhanh đạt 5,8 mg/ml Cũng thời điểm chủng bắt đầu sinh vancomycin, tới 120 nồng độ đạt cực đại 2983 mcg/ml Hình 5: Biến động trình lên men sinh tổng hợp vancomycin biến chủng S orientalis 4912-81-61 Hình 6: Thiết bị lên men Bioflo 5000 thiết bị Bioflo 5000 e Tách chiết tinh chế vancomycin từ dịch lên men Hình 7: Quy trình chiết xuất vancomycin Page 13 Quy trình chiết xuất vancomycin Kết kiểm tra vancomycin tách chiết từ biến chủng S orientalis 4912-8161 sắc ký lớp mỏng hệ dung môi Butanol - axit acetic - H 2O (4 : : 7) cho giá trị Rf mẫu 0,75; phương pháp phổ khối Agilent 6310 Ion Trap máy HPLC-MS, trọng lượng phân tử 1449,27 sắc ký lỏng cao áp máy HPLC-SPA-10 Shimadzu, thời gian lưu 4,4 phút giống vancomycin chuẩn (Merck) Sắc ký đồ HPLC cho thấy pic tạp chứng tỏ vancomycin chế phẩm tinh sạch, độ tinh khiết đạt 95,4% Hình 8: Kiểm tra vancomycin sắc ký lớp mỏng Hình 9: Phỏ UV Hình 10: Phỏ HPLC Vancomycin từ môi vancomycin chuẩn vancomycin chuẩn (trên) trường nuôi cấy, (trên) vancomycin vancomycin chủng S Vancomycin tách chiết chủng S orientalis orientalis 4912 (dưới) làm tinh khiết; 4912 (dưới) Vancomycin chuẩn (Merck) Vancomycin kháng sinh nhóm glycopeptid sử dụng để chữa bệnh nhiễm trùng vi khuẩn Gram dương gây ra, đặc biệt vi khuẩn kháng lại kháng sinh methicillin penicillin Kết nghiên cứu xây dựng quy trình thích hợp để sản xuất vancomycin từ biến chủng nhận cao chủng gốc 344% Chất kháng sinh thu nhận từ dịch lên men tương đương với vancomycin chuẩn (Merck) III Một số nghiên cứu liên quan đến xạ khuẩn Xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật Các nhà bệnh học thực vật toàn giới điều tra nghiên cứu tình hình Page 14 sử dụng CKS việc ngăn chặn bệnh thực vật Tuy mức thấp thu thành tựu định nông nghiệp đại Sự đối kháng VSV đất sở biện pháp sinh học phòng chống bệnh Sự có mặt xạ khuẩn đối kháng đất làm giảm rõ rệt tỷ lệ mắc bệnh Thông thường, loại xạ khuẩn đối kháng ức chế vài loại nấm gây bệnh có loài hoạt phổ rộng ức chế nhiều tác nhân gây bệnh có đất Không phải tất xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm invitro thể đất (khoảng - 5%) chúng có vai trò quan trọng việc ức chế nấm gây bệnh ngăn ngừa khả nhiễm bệnh cho Đây quy luật cân sinh học tự nhiên Nếu cân đi, nảy sinh bệnh đất có mầm gây bệnh Xạ khuẩn chống nấm việc tiết CKS, tác động lên khu hệ VSV thông qua enzym phân giải Ngoài ra, nhiều XK tiết chất kích thích sinh trưởng thực vật kích thích khu hệ VSV có lợi vùng rễ Năm 2002 Ấn Độ phân lập chủng Streptomyces sp 201 có khả sinh CKS z - methylheptyl iso- nicotinate, chất kháng sinh có khả kháng nhiều loại nấm gây bệnh Furasium oxysporum, F solina… Ở Việt Nam sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh bảo vệ thực nhập từ Trung Quốc hay Nhật Bản phân lập số chủng xạ khuẩn có khả chống Pyricularia oryae gây bệnh đạo ôn F oxysporum gây bệnh thối rễ thực vật Tuy nhiên việc sử dụng CKS lĩnh vực bảo vệ thực vật nước ta mức độ thấp tập quán canh tác quen dùng số hóa chất bảo vệ thực vật định Ngoài ra, chế phẩm sinh học chưa phù hợp với điều kiện sản xuất chế phẩm sinh học người nông dân Do đó, cần có phối hợp thống việc nghiên cứu , sản xuất chế phẩm phòng trị sinh học với việc truyền thông , xây dựng phương pháp canh tác nhằm thu hiệu to lớn phòng chống dịch bệnh, nâng cao suất trồng hiệu kinh tế đồng thời bảo vệ môi trường sức khỏe người Hơn 50 loại thuốc kháng sinh khác phân lập từ loài Streptomyces, bao gồm: streptomycin, chloramphenicol, neomycin tetracycline Khả kháng bệnh gây héo xanh chủng xạ khuẩn L30 đất trồng lạc Tiến hành nhiễm chủng xạ khuẩn nghiên cứu vào đất, cho chúng phát triển hai tuần sau nhiễm tiếp chủng gây bệnh héo xanh Pseudomonas solanacearum 222 vào trước trồng lạc Sau tháng trồng lạc tiến hành quan sát chậu đất Khi lạc - phiến tiến hành tiêm vi khuẩn gây bệnh héo xanh vào lách lạc Sau tháng đọc kết Page 15 Khả kháng bệnh gây héo xanh chủng xạ khuẩn L30 đất trồng lạc Số lạc sống sót Nhiễm P Tiêm P Mẫu solanacearum solanacearum vào Đối chứng vào đất lạc Không nhiễm xạ khuẩn 25 Nhiễm xạ khuẩn 25 25 25 Kết ghi bảng cho thấy nhiễm P solanacearum vào đất trồng lạc, hay tiêm trực tiếp vào thân điều kiện trước nhiễm chủng xạ khuẩn bị nhiễm bệnh (tỷ lệ sống sót 100%), đất không nhiễm xạ khuẩn có 80 - 100% bị bệnh Từ ta kết luận  Chủng xạ khuẩn L30 có phổ kháng sinh rộng với nhiều loại vi sinh vật kiểm định đặc biệt la hoạt tính mạnh kháng Pseudomonas solanacearum  Dựa vào đặc điểm nuôi cấy, hình thái sinh lý hóa, chủng L30 có đặc điểm khác với loài mô tả  Điều kiện thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng xạ khuẩn L30 môi trường ISP-4 với pH=7, nhiệt độ 28-350C, thời gian lên men 120-144 giờ, nguồn cacbon tinh bột nguồn nito (NH4)2SO4  Chất kháng sinh chủng xạ khuẩn L30 sinh không ảnh hưởng đến khả nảy mầm hạt lạc  Khi nhiễm xạ khuẩn sinh chất kháng sinh vào đất không gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng lạc mà có tác dụng ức chế bệnh héo xanh Xạ khuẩn chế phẩm vi sinh Việc nghiên cứu ứng dụng đặc điểm hữu ích vi sinh vật ngày trở nên phổ biến; có lĩnh vực xử lý phế phẩm, chất thải trình sản xuất nông nghiệp Để xử lý loại phế phẩm nông nghiệp, rác thải sinh hoạt có chế phẩm BIMA (Trichoderma), ACTIVE CLEANER (xạ khuẩn Streptomyces sp., nấm Trichoderma sp., vi khuẩn Bacillus sp.) sử dụng để ủ phân gia súc, chất thải hũu rơm, rạ, rác thải sinh hoạt hữu (đã tách riêng rác vô cơ) Việc sử dụng chế phẩm giúp rút ngắn thời gian ủ hoai phân chuồng, phân xanh, rác từ 2-3 lần so với cách ủ thông thường Page 16 KẾT LUẬN Từ mẫu đất khác nhau, phân lập khiết 80 chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces, số có 30 chủng có hoạt tính kháng nấm gây bệnh chè mức độ khác nhau, chiếm tỷ lệ 37,5% Trong số chủng có hoạt tính kháng nấm, nhóm trắng chiếm 36,7%, xám - 26,7%, xanh - 23,3%, hồng - 6,7%, nâu - 3,3%, lục - 3,3% Cho tới khoảng 8000 chất kháng sinh biết giới có tới 80% xạ khuẩn sinh Trong số có 15% có nguồn gốc từ loại xạ khuẩn Micromonospora Actinomadura, Actinoplanes, Streptoverticillium, Streptosporangium… Điều đáng ý xạ khuẩn cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị dùng y học gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixi Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào trình chuyển hoá nhiều hợp chất đất, nước Dùng để sản xuất nhiều enzym proteaza, amylaza, Page 17 xenluloza…một số axit amin axit hữu Một số xạ khuẩn gây bệnh cho người, động vật Page 18 TÀI LIỆU THAM KHẢO http://www.ebook.edu.vn/?page=1.18&view=17462 http://www.vast.ac.vn/index.php? option=com_content&view=article&id=1106%3Anghien-cu-quy-trinh-cong-ngh-sn-xutkhang-sinh-vancomycin-t-x-khun-streptomyces-orientalis&catid=37%3Atin-khcn-trongnc-&Itemid=34&lang=vi http://vi.wikipedia.org/wiki/X%E1%BA%A1_khu%E1%BA%A9n Page 19 [...]... dạng khuẩn lạc, B Cuống sinh bào tử, C Bào tử Hình 1: Chủng xạ khuẩn Streptomycws orientalis 4912 b Lựa chọn môi trường điều kiện lên men sinh kháng sinh của chủng S.orientalis 4912 Thử nghiệm lên men trên một số môi trường thường dùng trong lên men sinh kháng sinh ở xạ khuẩn cho thấy, chủng S orientalis 4912 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh và đã lựa chọn được môi trường MT48 cho hoạt tính kháng sinh. .. chủng xạ khuẩn L30 trên môi trường ISP-4 với pH=7, nhiệt độ 28-350C, thời gian lên men là 120-144 giờ, nguồn cacbon trên tinh bột và nguồn nito là (NH4)2SO4  Chất kháng sinh do chủng xạ khuẩn L30 sinh ra không ảnh hưởng đến khả năng nảy mầm của hạt lạc  Khi nhiễm xạ khuẩn sinh chất kháng sinh vào đất không gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng của cây lạc mà còn có tác dụng ức chế bệnh héo xanh 3 Xạ khuẩn. .. nghiên cứu tình hình Page 14 sử dụng CKS trong việc ngăn chặn các bệnh thực vật Tuy còn ở mức thấp nhưng đã thu được những thành tựu nhất định trong nền nông nghiệp hiện đại Sự đối kháng giữa các VSV trong đất là cơ sở của biện pháp sinh học phòng chống bệnh cây Sự có mặt của xạ khuẩn đối kháng trong đất làm giảm rõ rệt tỷ lệ mắc bệnh của cây Thông thường, một loại xạ khuẩn đối kháng có thể ức chế một vài... 100%), trong khi đó ở đất không nhiễm xạ khuẩn thì có 80 - 100% cây bị bệnh Từ đó ta có thể kết luận  Chủng xạ khuẩn L30 có phổ kháng sinh rộng với nhiều loại vi sinh vật kiểm định đặc biệt la hoạt tính mạnh kháng Pseudomonas solanacearum  Dựa vào đặc điểm nuôi cấy, hình thái và sinh lý hóa, chủng L30 có đặc điểm khác với các loài đã mô tả  Điều kiện thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của. .. trưng giống như ở các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh khác c Nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng S.orientalis 4912 Trước hết, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phương pháp gây chủng đột biến bằng tia UV Kết quả nghiên cứu khả năng sống sót của tế bào trần và bào tử chủng S orientalis 4912 sau khi xử lý UV ở độ sống sót từ 1-10%, Page 11 kiểm tra hoạt tính kháng sinh theo phương pháp cục... hưởng của các nguồn dinh dưỡng và điều kiện lên men đến khả năng tạo kháng sinh Hình 2: Hoạt tính kháng sinh của chủng S orientalis 4912 Chủng S orientalis 4912 sử dụng tốt nguồn đường saccharose với hàm lượng thích hợp là 3%, cho hoạt tính kháng sinh cao Trong số các nguồn nitơ thử nghiệm thì bột đậu tương cho hoạt tính kháng sinh cao nhất, với hàm lượng 0,2% là thích hợp Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt... nhiều tác nhân gây bệnh có trong đất Không phải tất cả các xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm invitro đều thể hiện trong đất (khoảng 4 - 5%) nhưng chúng có vai trò quan trọng trong việc ức chế nấm gây bệnh và ngăn ngừa khả năng nhiễm bệnh cho cây Đây là quy luật cân bằng sinh học trong tự nhiên Nếu sự cân bằng mất đi, lập tức sẽ nảy sinh ra bệnh khi trong đất có mầm gây bệnh Xạ khuẩn chống nấm ngoài việc... quả Page 15 Khả năng kháng bệnh gây héo xanh của chủng xạ khuẩn L30 trên đất trồng lạc Số cây lạc sống sót Nhiễm P Tiêm P Mẫu solanacearum solanacearum vào Đối chứng vào đất cây lạc Không nhiễm xạ khuẩn 5 0 25 Nhiễm xạ khuẩn 25 25 25 Kết quả ghi ở bảng trên cho thấy khi nhiễm P solanacearum vào đất trồng lạc, hay tiêm trực tiếp vào thân cây trong điều kiện trước đó đã nhiễm chủng xạ khuẩn thì không có... xanh 3 Xạ khuẩn trong chế phẩm vi sinh Việc nghiên cứu ứng dụng các đặc điểm hữu ích của vi sinh vật ngày nay đã trở nên rất phổ biến; trong đó có lĩnh vực xử lý phế phẩm, chất thải trong quá trình sản xuất nông nghiệp Để xử lý các loại phế phẩm nông nghiệp, rác thải sinh hoạt thì có các chế phẩm như BIMA (Trichoderma), ACTIVE CLEANER (xạ khuẩn Streptomyces sp., nấm Trichoderma sp., vi khuẩn Bacillus... khuẩn Gram dương gây ra, đặc biệt là các vi khuẩn kháng lại kháng sinh methicillin và penicillin Kết quả nghiên cứu đã xây dựng được quy trình thích hợp để sản xuất vancomycin từ biến chủng nhận được cao hơn chủng gốc 344% Chất kháng sinh thu nhận được từ dịch lên men tương đương với vancomycin chuẩn (Merck) III Một số nghiên cứu liên quan đến xạ khuẩn 1 Xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật Các nhà bệnh ... bệnh Trong số tác nhân sinh học thường sử dụng để ức chế VSV gây bệnh, xạ khuẩn nhóm có nhiều tiềm tỷ lệ loài có khả sinh CKS cao, có nhiều CKS có khả chống nấm mạnh Page ỨNG DỤNG CỦA XẠ KHUẨN TRONG. .. loại sử dụng hàng loạt điều kiện khóa phân loại khác Một số ứng dụng xạ khuẩn Đặc tính xạ khuẩn khả tiết kháng sinh (antibiotic), dùng làm thuốc điều trị bệnh cho người gia súc trồng Xạ khuẩn có...  Chất kháng sinh chủng xạ khuẩn L30 sinh không ảnh hưởng đến khả nảy mầm hạt lạc  Khi nhiễm xạ khuẩn sinh chất kháng sinh vào đất không gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng lạc mà có tác dụng ức