Công nghệ sinh học vacxin

Vacxin Công nghệ sinh học Vacxin PGS.TS Lê Thanh Hòa Viện Công nghệ Sinh học 18 Đờng Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam ĐT: 7567297; 7564391; 0912336855 Fax: 8363144; Email: im-ibt@hn.vnn.vn I Phân loại vacxin Có thể phân định hớng chiến lợc tạo nên vacxin: vacxin tạo nên theo công nghệ cổ truyền, hay gọi vacxin cổ điển (traditional vaccine) vacxin tạo nên công nghệ sinh học phân tử, hay gọi vacxin hệ mới: vacxin CNG (genetically engineered vaccine) Có thể nói vacxin cổ điển đợc tạo cách gián tiếp, vacxin hệ đợc tạo cách trực tiếp tác động vào hệ gen đối tợng đợc chọn làm vacxin Về tính chất sinh học vacxin, phân biệt loại: vacxin vô hoạt (bằng yếu tố lí, hoá), vacxin sống (bao gồm vacxin vô độc nhợc độc), vacxin phân tử (bằng kỹ thuật gen) Hai loại đầu đợc tạo công nghệ cổ truyền chính; loại thứ 3, đợc tạo kỹ thuật gen Về nguồn cung cấp kháng nguyên, xét dới góc độ tạo miễn dịch cho thể, vacxin đợc gom vào số nhóm sau: Nhóm vacxin cung cấp kháng nguyên sống đợc nhân lên Vacxin sống vô độc Vacxin sống nguyên độc Vacxin sống nhợc độc Vacxin nhợc độc đợc tạo qua tác dụng lý - hoá Vacxin nhợc độc tạo phơng pháp tiếp truyền cổ điển Vacxin hệ công nghệ gen Vacxin tái tổ hợp có vectơ dẫn truyền Vacxin axit nucleic Vacxin phối hợp với công nghệ chuyển gen thực vật Vacxin nhợc độc nhân tạo di truyền ngợc Nhóm vacxin có nguồn kháng nguyên không nhân lên Vacxin vô hoạt Vacxin chứa protein kháng nguyên tinh chế Vacxin chứa kháng nguyên protein đợc sản xuất bằn công nghệ gen Vacxin tổng hợp Qua vật chủ không cảm thụ (host range mutants) Vacxin nhợc độc Vacxin sống Vacxin vô độc Vacxin ** nguyên độc Nhạy cảm nhiệt độ (temperature-sensitive mutants) Thích ứng nhiệt độ thấp (cold-adapted mutants) Xoá gen độc (deletion mutants) * Tái tổ hợp gen (vacxin vector * truyền vacxin axit nucleic) (recombinant vaccines) Vacxin Vacxin nguyên thể Vacxin di truyền ngợc* Tinh chế từ nguồn vi sinh vật chủ thiên nhiên Vacxin vô hoạt Vacxin phân tử Sản xuất, tinh chế kỹ thuật gen * Chứa protein kháng nguyên tổng hợp kỹ thuật gen * Hình 1: Sơ đồ phân loại vacxin dựa vào nguyên lý sản xuất hớng sử dụng loại vacxin Ghi chú: Dấu (*) giới thiệu loại hình vacxin mà trình tạo giống sản xuất có sử dụng kỹ thuật gen Dấu (**) loại vacxin cờng độc với loài nhng đợc sử dụng nh loại vacxin vô độc cho loài khác II Nhóm vacxin có nguồn kháng nguyên đợc nhân lên Vacxin sống theo nghĩa nó, chúng có khả nhân lên, tạo cho thể nguồn kháng nguyên tồn lâu bền thể Chủ yếu có loại vacxin chính: vacxin sống vô độc (live avirulent vaccine) vacxin sống nhợc độc (live attenuated vaccine) Vacxin sống vô độc: Đó chủng vi sinh vật vô độc đợc chọn lọc từ quần thể vi sinh vật có tự nhiên Chúng hoàn toàn không hay tính gây bệnh yếu đối tợng đợc hởng vacxin Có thể kể loại: Vacxin sống nguyên độc: Là loại hình vacxin đợc chọn lọc sử dụng lâu đời, tạm gọi vacxin nguyên độc, loại có độc lực với loài nhng an toàn loài khác Thực chất chúng đợc xếp vacxin vô độc loài đối tợng đợc hởng vacxin, chúng đợc phân lập từ loài khác hoàn toàn không hay có tính gây bệnh yếu Vacxin sống nhợc độc: Là tất loại, mà thực chất thân chúng có khả thích ứng nhân lên đối tợng hởng vacxin, cung cấp nguồn kháng nguyên lâu dài tạo miễn dịch vững bền cho thể Tính cờng độc (tức mức độ biểu khả gây bệnh) chúng bị giảm sút hẳn, trở nên yếu, đủ điều kiện để làm vacxin Ngời ta gọi chúng vacxin nhợc độc Quá trình đợc gọi nhợc độc hoá (attenuation) Vacxin nhợc độc đợc tạo qua tác dụng lí-hoá Vacxin nhợc độc tạo phơng pháp tiếp truyền cổ điển Vacxin sống, tái tổ hợp có vector dẫn truyền Vacxin axit nucleic III Nhóm vacxin có nguồn kháng nguyên không nhân lên Đó loại vacxin vô hoạt, vacxin chứa protein kháng nguyên tinh chế, vacxin chứa protein kháng nguyên sản xuất công nghệ gen, vacxin chứa nhóm định kháng nguyên tổng hợp nhân tạo Vacxin vô hoạt: Vacxin vô hoạt (inactivated vaccine) hay trớc gọi vacxin chết (killed vaccines), chế phẩm chứa tác nhân gây bệnh nhng đ bị vô hoạt (giết chết) phơng pháp khác nhau, chủ yếu lý học hóa học Vacxin chứa protein kháng nguyên tinh chế: Một số vi sinh vật, trình nhân lên gây bệnh có thải môi trờng số thành phần protein thu nhận để làm kháng nguyên vacxin, ví dụ nh kháng nguyên bề mặt HBsAg (Hepatitis B surface antigen) virut viêm gan B chẳng hạn Kháng nguyên bề mặt HBsAg HBsAg thể ngời bệnh HBsAg tái tổ hợp Vacxin chứa kháng nguyên protein đợc sản xuất công nghệ gen: Cũng tơng tự nh trên, thành phần vacxin protein kháng nguyên tinh chế, nhng từ nguồn cung cấp có tự nhiên, mà đợc sản xuất công nghệ gen Vacxin tổng hợp: (synthetic vaccine), loại chứa đoạn ngắn polypeptit kháng nguyên hay gọi nhóm định kháng nguyên Nhóm có thành phần vào khoảng 8-12 axit amin, nằm nơi bề mặt protein kháng nguyên Do nhóm đợc gọi epitope, có vai trò định tính kháng nguyên loại vacxin Sau đợc tổng hợp, muốn làm vacxin, chúng phải đợc gắn vào giá đỡ, hạt polyme có khả hấp phụ cao Ngoài chúng đợc sử dụng với loại chất bổ trợ tốt, có khả vacxin đợc Giới thiệu số loại vacxin hệ Vacxin hệ hay vacxin công nghệ gen chế phẩm đợc dùng làm vacxin, gây miễn dịch cho ngời động vật, đợc tạo sản xuất thông qua thao tác kỹ thuật gen Đó loại kỹ thuật liên quan đến cắt, ghép, nối, phân lập, dẫn truyền, biểu thị đoạn axit deoxyribonucleic, gen từ cá thể sang cá thể khác Vacxin tái tổ hợp có vectơ dẫn truyền: Đó loại vacxin đợc tạo kỹ thuật gen dựa vào loại vectơ đó, chủ yếu vi khuẩn virut thông dụng Tất nhiên, nguyên lý, loại vi sinh vật làm vectơ dẫn truyền phải loại thông dụng cho nhiều loài phải giảm độc vô độc cách cắt bỏ xóa hay nhiều gen độc kỹ thuật gen Vacxin tái tổ hợp vectơ dẫn truyền Salmonella Vacxin tái tổ hợp vectơ truyền sử dụng virut đậu Promoter A Plasmid gốc Gen kháng nguyên Cắt Plasmid thoi I Vị tri khởi phát nhân lên plasmid Nối Gen kháng nguyên Virus đậu bò (vaccinia virus) II Virus đậu ban đầu Plasmid tái tổ hợp ồng nhiễm Gen kháng kháng sinh III Tế bào đồng nhiễm Gây nhiễm Tế bào nuôi cấy tạo nên virus tái tổ hợp Chọn lọc BUdR (5-bromodeoxy-uridine) Gen kháng nguyên B Sản phẩm virus đậu vector tái tổ hợp Virus đậu tái tổ hợp (TK-) Sơ đồ vacxin tái tổ hợp vector dẫn truyền sử dụng virus đậu Vacxin axit nucleic (vacxin ADN) Khi đa axit deoxy-ribonucleic (ADN) loại plasmid vectơ có chứa gen kháng nguyên vào thể, kỳ lạ, gen kháng nguyên lại tổng hợp protein kháng nguyên kích thích thể sinh miễn dịch chống lại protein gen kháng nguyên kích thích sinh Vacxin ADN loại hình vacxin đặc biệt thuộc hệ nhất, axit deoxyribonucleic plasmid vectơ biểu hiện, đợc tái tổ hợp gen kháng nguyên với hệ thống promotor mạnh, đợc tạo công nghệ gen Vacxin ADN có u lớn gọn nhẹ phơng thức gây miễn dịch đơn giản vacxin chứa ADN khiết, nên bền với nhiệt độ Vacxin phối hợp với công nghệ chuyển gen thực vật: Công nghệ sinh học phân tử thực vật cho phép chuyển nhiều gen quý giá vào hệ gen thực vật, tạo nên hệ thực vật có u mang gen để sản xuất nhiều sản phẩm có lợi Các gen đợc phân lập, trì cắt -nối - ghép vào loại plasmid Ti, loại plasmid dẫn truyền gen thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens nhằm chuyển gen ngoại lai có giá trị vào thực vật Xuất phát từ nguyên lý trên, ý định gài hay nhiều gen kháng nguyên vacxin động vật ngời vào hệ thống plasmid Ti A tumefaciens đ đợc thực Sau chuyển gen, thực vật hệ đ tiếp nhận nguồn gen vacxin từ vi sinh vật nguồn gen sản xuất protein có hoạt tính sinh học Khi nuôi trồng, thực vật chuyển gen (transgenic plant) có mang gen vacxin hay gen sản xuất protein hoạt tính cao có nguồn gốc động vật, đ tiến hành sản xuất sản phẩm chứa thành phần thể chúng Nếu chắt lọc, tinh chế thu đợc sản phẩm protein Nếu sử dụng nguyên vẹn, động vật ngời ăn loại thực vật này, nguyên lý, tiếp nhận đợc nguồn vacxin có đợc miễn dịch Vacxin virus nhợc độc nhân tạo di truyền ngợc: Đây phơng pháp áp dụng với virus có hệ gen ARN sợi có nhiều phân đoạn, ví dụ virus cúm A H5N1 Các phân đoạn gen đợc gắn vào plasmid theo cách đặc biệt Plasmid phải chứa hai hệ thống biểu có tham gia promoter ARN polymerase I (ARN-pol I) ARN polymerase II (ARN-pol II) Đoạn ADN bổ sung (cDNA) phân đoạn gen đợc lắp vào nằm promoter I terminater I Cả đoạn đợc chèn vào promoter II polyadenylation A II Sau đa vào tế bào động vật, với ARN-pol I, có vARN (sợi âm) đợc biểu với ARN-pol II, có mRNA (sợi dơng) đợc biểu loại protein tơng ứng virus Sau có ribonucleoprotein, sợi vARN đợc nhân lên phiên m sợi ARN thông tin (sợi âm) Chúng kết hợp với tạo virus Đó virus nhợc độc nhân tạo làm vacxin Minh hoạ Chiến lợc thiết kế vacxin ADN cúm g ATG Ton phân đoạn 4: gen HA HA1 ATG pHA TGA; TAA HA2 gen NA TGA; TAA pNA ADN GEN KHáNG NGUYÊN (cần tái tổ hợp vào vectơ) pCUMGA (5,5kbp) Vacxin hệ Di truyền ngợc (reverse genetic technique) Vacxin hệ Túm tt cỏc bc di truyn ngc to ging vaccine NIBRG-14 (ti NIBSC) 1194 Gen H5 b c + gen N1 t chng A/Vietnam/1194/2004(H5N1) c a vo plasmid To plasmid cú gen khung t chng PR8/34 (H1N1) PR8/34 Gõy ng nhim t bo ng vt thớch ng Cỏc plasmid (8 plasmid cha gen) cựng tỏi t hp to chng virus cỳm lai gm cỏc gen khỏng nguyờn H5 (b c) v gen N1 t H5N1 chng Vietnam/1194 cựng vi b khung gen ly t H1N1 chng PR/8/34 Chng virus cỳm lai nhc c di truyn ngc c chn lc v nuụi cy thớch ng trờn phụi g 10 ngy tui lm chng gc vaccine Xoang ni? ni?u nang REVERSE GENETICS-BASED VACCINE CONSTRUCTION Hệ thống 12 plasmid (8 Pol I Pol II promoter plasmids) cho rg vaccine Phôi gà 10 ngày tuổi ADENOVIRUS v công nghệ adeno miễn dịch- liệu pháp gen PGS.TS Lê Thanh Hoà Viện Công nghệ Sinh học Virus Name Virus Genus Host human adenovirus Mastadenovirus Homo sapiens Adenovirus Mastadenovirus Vertebrata fowl adenovirus Aviadenovirus Gallus domesticus egg drop syndrome virus Aviadenovirus Gallus domesticus Adenovirus Adenoassociated virus Mastadenovirus Dependovirus Vertebrata Adenovirus Mastadenovirus Vertebrata ADENOVIRIDAE Aviadenovirus Mastadenovirus Atadenovirus Siadenovirus 10 Cấu trúc hình thái đơn giản hình khối đối xứng, đờng kính: 80-110nm, 252 capsomer: 12 penton, 240 hexon, cần angten, lõi, không vỏ, capsid cấu trúc lớp, kháng nguyên bề mặt nổi; phân tử lợng: 150-180 triệu Da Hệ gen dài 35800-36200 nucleotide, gồm sợi: hớng trái (L), hớng phải (R); có 10 protein cấu trúc, có DNA-polymerase, replicase, protease Có tợng cắt-nối-ghép gen Các gen: E1A, E1B, L1-5, E2A-B, E3, E4 11 Nhóm định miễn dịch tìm thấy capsid, hexon, sợi angten (fiber) Hầu hết thuộc đặc hiệu týp, nằm bề mặt, liên quan kháng thể trung hoà (hexon) ngng kết (fiber) 12 13 Hệ gen Adenovirus Gen muộn (gen cấu trúc) (L1-5) E1A E1B ITR Bản đồ gen E3 Promotor 10 20 ITR 30 40 50 60 70 80 90 100 E2 E4 IVa2 Các Hệ gen vector adenovirus v vùng xoá để mang gen kháng nguyên BAd3 Vùng E1A CAd2 Vùng E1A E1B SAd25 Vùng E1A E1B OAd7 Vùng E3 Vùng E3 Vị trí I Vị trí II Vị trí III PAd3 Vùng E1A E1B FAd1 Vị trí 6.12 Vùng E3 Vùng E4-ITR Vị trí gia 92-99 Interleukin Yếu tố hủy hoại khối u (TNF) Gen virus ly giải tế bào ung th Yếu tố sinh trởng Gen kháng nguyên ARN can thiệp (siRNA oligos) Liệu pháp gen trình thay gen hỏng/gây bệnh/thiểu gen chức có đầy đủ khả hoạt động Cụ thể ứng dụng công nghệ sinh học tạo nên vector chuyển gen để đa gen vào thể đối tợng Một phơng tiện chuyển gen linh hoạt đáp ứng yêu cầu loại virus vector tái tổ hợp phá bỏ ARN ADN virus gây ng th Cytokine kích ứng miễn dịch Ly giải tế bào Protein chức Đáp ứng miễn dịch Phá bỏ ARNtt gen đối ứng Liệu pháp gen miễn dịch dựa vào vector adenovirus có lợi gài vào đoạn ADN có độ dài đến kb chứa nhiều gen chức khác để gây hiệu ứng phá bỏ gen sản phẩm gen gây ung th mục đích khác Lợi sử dụng cho uống/ăn/tiêm Lợi bền nhiệt, dễ nuôi môi trờng tế bào Có tác dụng song giá/đa giá (gài nhiều gen khác vào vector) Miễn dịch triệt để đủ loại hình: dịch thể, trung gian tế bào, niêm mạc Chỉ gây nhiễm vật chủ Giá thành vacxin rẻ 14 Gn gen khỏng nguyờn PacI Tỏi t hp ng nhim vi khun PacI PacI GEN KHNG NGUYấN GEN INTERLEUKIN GEN HOI T KHI U GEN SINH TRNG OLIGO CA siRNA Chn khun lc trng Ct bng PacI PacI Gõy nhim HEK293 Adenovirus tỏi t hp c to HEK293 Gen khỏng nguyờn Adenovirus tỏi t hp c to HEK293 Vacxin poly-epitope chứa gen LMP phòng chống virus Ung th vòm họng (EBV) 15 Vacxin adenovirus tái tổ hợp chứa gen kháng nguyên: dịch hạch H5N1 ATTEMPT TO USE RNAi AGAINST INFLUENZA A VIRUS Tompkins et al., (2004) Protection against lethal influenza virus challenge by RNA interference in vivo PNAS 101(23): 86828686 Ge, Q., McManus, M., Nguyen, T., Shen, C.-H., Sharp, P A., Eisen, H N & Chen, J (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100, 27182723 Ge, Q., Filip, L., Bai, A., Nguyen, T., Eisen, H N & Chen, J (2004) Proc Natl.Acad Sci USA 101, 86768681 About siRNA RNAi (RNA interference) is a phenomenon that small double-stranded RNA (referred as small interference RNA or siRNA) can knock down the expression of its corresponding gene RNAi has been observed in plant, C.elegans and Drosophila long time ago It was until recently that RNAi was discovered to work in mammalian system First, the dsRNAs get processed into 20-25 nucleotide (nt) small interfering RNAs (siRNAs) by an RNase III-like enzyme called DICER (initiation step) Small interference RNA (siRNA) is 19-22 nt double-stranded RNA It works by cleaving and destroying its cognate RNA siRNA first assembles into RNA-induced silencing complexes (RISCs), and it then activates the complex by unwinding its RNA strands The unwound RNA strands subsequently guide the complex to the complementary RNA molecules, where the complex cleaves and destroys the cognate RNA, which results in RNAi phenomenon 16 Gen đặc hiệu Đơn loài/loại Không phân tán Chọn siRNA đặc hiệu VP2(IBDV) H5,N1(H5N1) EBNA1(EBV) VP1(FMD) GAG,ENV(HIV) 17 Xin cảm ơn anh chị v bạn! 18 [...]... gia 92-99 Interleukin Yếu tố hủy hoại khối u (TNF) Gen virus ly giải tế bào ung th Yếu tố sinh trởng Gen kháng nguyên ARN can thiệp (siRNA oligos) Liệu pháp gen là quá trình thay thế gen hỏng/gây bệnh/thiểu năng bằng gen chức năng có đầy đủ khả năng hoạt động Cụ thể đó là ứng dụng công nghệ sinh học tạo nên vector chuyển gen để đa gen vào cơ thể đối tợng Một trong những phơng tiện chuyển gen... Giá thành vacxin rất rẻ 14 Gn gen khỏng nguyờn PacI Tỏi t hp ng nhim trong vi khun PacI PacI GEN KHNG NGUYấN GEN INTERLEUKIN GEN HOI T KHI U GEN SINH TRNG OLIGO CA siRNA Chn khun lc trng Ct bng PacI PacI Gõy nhim HEK293 Adenovirus tỏi t hp c to ra trong HEK293 Gen khỏng nguyờn Adenovirus tỏi t hp c to ra trong HEK293 Vacxin poly-epitope chứa gen LMP phòng chống virus Ung th vòm họng (EBV) 15 Vacxin adenovirus ... tạo công nghệ gen Vacxin ADN có u lớn gọn nhẹ phơng thức gây miễn dịch đơn giản vacxin chứa ADN khiết, nên bền với nhiệt độ Vacxin phối hợp với công nghệ chuyển gen thực vật: Công nghệ sinh học. .. hoá Vacxin nhợc độc tạo phơng pháp tiếp truyền cổ điển Vacxin hệ công nghệ gen Vacxin tái tổ hợp có vectơ dẫn truyền Vacxin axit nucleic Vacxin phối hợp với công nghệ chuyển gen thực vật Vacxin. .. hợp gen (vacxin vector * truyền vacxin axit nucleic) (recombinant vaccines) Vacxin Vacxin nguyên thể Vacxin di truyền ngợc* Tinh chế từ nguồn vi sinh vật chủ thiên nhiên Vacxin vô hoạt Vacxin phân