Quy trình sản xuất enzym amilase

Ngoài số enzyme đã được sử dụng rộng rãi và lâu đời amylaza, prôteeaza…, còn có hàng chục loại enzyme khác đã được nghiên cứu và áp dụng vào thực tế.Trước đây, các enzyme dung nghiên cứu

Bài thảo luận công nghệ sinh học đại cương:

QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE

Nhóm:

1. Trịnh Thành Công 1021010050

2. Nguyễn Văn Tùng 1021010405

3. Nguyễn Trọng Hoàng 1021010142

4. Lê Tuấn Thành 1021010309

5. Đỗ Tất Quang 1021010275

Mục lục:

Ph

ầ n 1 : Giới Thiệu

 Enzyme amylase là gì?

 Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzyme α- amylase

Ph

ầ n 2 :Quy trình sản xuất enzym α amylase

 Môi trường sản xuất enzyme amylase

 Nguyên liệu sản xuất enzyme amylase

 Quy trình sản xuất nấm mốc giống

 Phương pháp sản xuất

 Quy trình lên men công nghiệp tạo enzyme amylase

Ph

ầ n 3 : Ứng dụng

Phần 4:Kết luận

ENZYME α AMYLASE

Phần 1: Giới thiệu

Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống là một vấn đề được các nhà khoa học và

kỹ thuật chú ý từ lâu Ngày nay, việc sử dụng này đã trở thành phổ biến ở nhiều nước

và đã mang lại nhiều lợi ích kinh tế khá lớn

Ngoài số enzyme đã được sử dụng rộng rãi và lâu đời( amylaza, prôteeaza…), còn có hàng chục loại enzyme khác đã được nghiên cứu và áp dụng vào thực tế.Trước đây, các enzyme dung nghiên cứu hoặc áp dụng trong sản xuất, thường thu nhận từ động vật, thực vật Nhưng vài chục năm gần đây, người ta đã chú ý đến một nguồn enzyme vô cùng phong phú và rẻ tiền, đó là nguồn enzyme từ vi sinh vật Thực ra đây là một nguồn enzyme rất quen thuộc đối với một số nước phương đông( Trung Quốc, Nhật Bản….)

Để mở rộng việc sử dụng các enzyme vào thực tế ở nước ta và đáp ứng yêu cầu của một số cơ sở sản xuất trong những năm qua, các nhà khoa học đã tiến hành

nghiên cứu tách và chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao, nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho việc tổng hợp mạnh mẽ enzyme của chúng, thu nhận chế phẩm enzyme

Như chúng ta đã biết, tinh bột là sản phẩm tự nhiên quan trọng nhất có nhiều ứng dụng trong kỹ thuật và trong đời sống con người Nhiều nước trên thế giới sử dụng nguồn tinh bột từ khoai tây, lúa mì, ngô, sắn, còn riêng nước ta thì sử dụng gạo

và khoai mì là nguồn tinh bột chủ yếu Trong chế biến tinh bột và đường, công đoạn quan trọng nhất là thủy phân tinh bột về các đường đơn giản Sau đó, chủ yếu trên cơ

sở đường đơn giản nhờ lên men, người ta sẽ nhận được rất nhiều sản phẩm quan trọng như: rượu cồn, rượu vang, bia, các loại acid hữu cơ, amino acid…

Quá trình thủy phân tinh bột gồm hai công đoạn chủ yếu là giai đoạn hồ hóa và gian đoạn đường hóa Để thực hiện hai công đoạn công nghệ nói trên, trong thực tế sản xuất ta áp dụng hai cách: Thủy phân tinh bột bằng acid và bằng enzyme Để thủy phân tinh bột từ lâu người ta đã sử dụng acid vô cơ như HCl và H2SO4 Nhưng kết quả cho thấy, thủy phân bằng acid rất khó kiểm soát và thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn và không đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm Do vậy, việc thay thế và ứng dụng enzyme để thủy phân tinh bột là một kết quả tất yêu của lịch sử phát triển

Enzyme amylase đã được tìm ra đã góp phần quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp chế biến thực phẩm Enzyme amylase có thể tìm thấy ở nhiều nguồn khác nhau như amylase từ thực vật, động vật, vi sinh vật Enzyme amylase càng ngày càng được thay thế acid trong sản xuất ở quy mô công nghiệp Hiện nay, các nhà sản xuất

có thể sử dụng amylase có khả năng chụi nhiệt cao mà không bị mất hoạt tính, chẳng hạn amylase được chiết tách từ vi sinh vật, cụ thể là các chủng vi khuẩn chịu nhiệt được phân lập từ những suối nước nóng Ngoài ra, amylase còn có nhiều ưu điểm hơn khi sử dụng acid để thủy phân tinh bột: Năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao

về thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho quá trình tinh sạch dịch đường

Nguồn amylase có thể lấy từ mầm thóc, mầm đại mạch, hạt bắp nản mầm, hay

từ nấm mốc,… Nguyên liệu cho sản xuất là gạo, bắt, khoai mì,… đây là những nguồn nguyên liệu dễ tìm, rẻ tiền có thể tìm thấy dễ dàng ở nước ta Do đó, đây là một lợi thế và hướng phát triển mạnh làm cơ sở cho nhiều ngành khác phát triển Ví dụ: sản xuất bánh kẹo, bia, cồn, sirô và làm mềm vải…

I.Tổng quan về enzyme amylase

Enzyme amylase là gì?

Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến

trong thế giới sinh vật Các enzyme này thuộc

nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên

kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với

sự tham gia của nước:

RR’ + H-OH RH + R’OH

Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm:

*Endoamylase( enzyme nội bào)

*Exoamylase( enzyme ngoại bào)

 Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme

khử nhánh Nhóm enzyme khử nhánh này được

chia thành 2 loại: Khử trực tiếp là

Pullulanase( hay α-dextrin 6 – glucosidase): khử

gián tiếp là Transglucosylase( hay

oligo-1,6-glucosidase) và maylo-1,6-glucosidase Các

enzyme này thủy phân liên kết bên trong của mỗi polysaccharide

 Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen

Tinh bột là nhóm carbohydrate ở thực vật, có chủ yếu trong các củ như khoai lang, khoai tây, khoai mì…, trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt và có công thức tổng quát là (C6H12O6)n Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều có cấu tạo từ amylase và amylopectin (Meyer, 1940) Các loại tinh bột đều có 20-30% amylase và 70-80% amylopectin Trong thực vật, tinh bột được xem là chất dự trữ năng lương quan trọng -Amylase có trọng lượng phân tử từ 50.000 – 160.000 Da, được cấu tạo từ 200-1000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α – 1,4-glucoside tạo thành một mạch xoắn dài không phân nhánh

-Amylopectin có trọng lượng phân tử từ 400.000 đến hang chục triệu Da, được cấu tạo từ 600 – 6000 phân tử D-glucose, nối với nhau bởi liên kết α – 1,4-

glucoside và α – 1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng khi hỗn dịch bị đun nóng( 60-85ºC) thì tinh bột sẽ bị hồ hóa và được gọi là hồ tinh bột Dưới tác dụng của enzyme amylase tinh bột sẽ bị thủy phân

do các liên kết glucoside bị phân căt Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy

ra theo 2 mức độ: Dịch hóa và Đường hóa Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi dextrin tiếp tục bị đường hóa thì sản phẩm là maltose và glucose

-Carbohydrate trong thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng quan trọng trong cơ thể con người Rau và quả cũng là nguồn cung cấp tinh bột và tinh bột này một phần đã được chuyển hóa thành disaccharide và glucose

Carbohydrate có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm nhưng nguồn cung cấp chủ yếu

ở trong khoảng 2 triệu – 3 triệu Da Glycogen dễ tan trong nước, nếu như chúng ta ăn quá nhiều Carbohydrate thì cơ thể chúng ta sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ Ở động vật và người, glycogen tập trung chủ yếu ở trong gan

I.Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzyme α- amylase

I.1.Đặc tính của enzyme α- amylase

α- amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α- amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng α- amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng khối lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme:

• α- amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine

• Trọng lượng phân tử của α- amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da( Knir 1956; Fisher, Stein, 1960)

• Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng

• Protein của các α- amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline

• Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH= 4,2-5,7( Bernfeld P, 1951)

• α- amylase là một metaloenzyme Mỗi phân tử α- amylase đều có chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam Ca/mol tham gia vào

sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt độ của

enzyme( Modolova, 1965) Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi

bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein Nếu phân tử α- amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất α- amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca trong phân tử và nồng độ Mg2+ Tất cả các amylase đều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+ Một số kim loại khác như: Li+, Na+ , Cr³+, Mn²+, Zn²+, Co²+, Sn²+ không có ảnh hưởng mấy đến α- amylase

Không giống các α- amylase khác, amylase của Asp.oryzae có chứa phần phi protein là polysaccharide Polyose này bao gồm 8 mol maltose, 1 mol glucose, 2 mol hexozamin trên 1 mol enzyme (Akabori et amiloza, 1965) Vai trò của polyose này vẫn chưa rõ, song đã biết được rằng nó không tham gia vào thành phần của trung tâm hoạt động và nằm ở phía trong phân tử enzyme

trytophan 4,0 trionin 10,7

Bảng: Thành phần amino acid của α- amylase ở nấm mốc Aspergillus

α- amylase của nấm mốc chỉ tấn công những hạt tinh bột bị thương tổn Sản phẩm cuối cùng của thủy phân amylase và glucose và maltose Đối với nấm sợi tỉ lệ là 1:3,79 (Hanrahan, Caldwell, 1953) Fenikxova và Eromsina (1991) cho biết rằng các maltopentose và maltohexose bị thủy phân theo sơ đồ sau: G5→G4 + G1; G6 → G2 + G4 hay 2G3 (chính) hoặc G5 + G1 (ít)

α- amylase của nấm sợi không tấn công liên kết α- 1,6 glucoside của

amylopectin nên khi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh Đây là một cấu trúc phân tử tinh bột do enzyme α- amylase phân cắt tạo thành dextrin tới hạn phân nhánh

Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của amylase nấm sợi chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotrioxe Khi dùng nồng độ α- amylase VSV tương đối lớn có thể chuyển hóa 70-85% tinh bột thành đường lên men Còn các α- amylase của nấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể lên tới 84-87%

Điều kiện hoạt động của α- amylase từ các nguồn khác thường không giống nhau pH tối thích cho hoạt động của α- amylase từ nấm sợi là 4,0-4,8 ( có thể hoạt động tốt trong vung pH từ 4,5-5,8 ) Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylase từ Asp.oryzae trong vùng 5,6-6,2 Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó

là 6,0-7,0

Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác nhau α- amylase của Asp.oryzae bền vững đối với acid hơn là α- amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis Ở pH = 3,6 và 0°C, α- amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15-30 phút; α- amylase vi khuẩn bị bất hoại đến 50%, trong khi đó hoạt lực α- amylase của nấm sợi hình như không giảm bao nhiêu ( Fenilxova, Rmoshinoi 1989 ) Trong dung dịch α- amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH = 5,0 – 5,5; α- amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu được pH từ 2,5 – 2,8 Ở 0ºC và pH=2,5 nó chỉ bị bất hoại hoàn toàn sau 1 giờ

Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α- amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α- amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt Nhiệt độ tối thích của nó là 50ºC và bị vô hoạt ở 70ºC (Kozmina, 1991 )

Trong dung dịch đệm pH = 4,7, α- amylase của Asp.oryzae rất nhạy với tác động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 40ºC trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22 – 29%, hoạt lực đường hóa còn 27 –85% Ở 50ºC trong 2 giờ α- amylase của nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn (Miller và cộng sự).

I.2 Cơ chế tác dụng của enzyme α- amylase

α- amylase ( 1,4 α- glucan – glucanhydrolase ) α- amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điểm rất giống nhau α- amylase có khả năng phân tách các liên kết α – 1,4glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên không theo một trật tự nào cả α- amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột

mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc độ rất chậm

 Quá trình thủy phân tinh bột bởi α- amylase là quá trình đa giai đoạn:

Ở giai đoạn đầu ( giai đoạn dextrin hóa ): Chỉ một số phân tử cơ chất nị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh ( các amylase và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh)

Sang giai đoạn 2 ( giai đoạn đường hóa ): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra – trimaltose không cho màu với iodine Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α- amylase cho tới disaccharide và

monosaccharide gồm 6-7 gốc glucose ( vì vậy, người ta cho rằng α- amylase luôn phân cắt amylase thành từng đoạn 6 – 7 gốc glucopiranose 1 )

Sau đó, các poliglucose này bị phân tách tiếp tạo nên các mạch polyglucose collagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và moltotriose và

maltose Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylase chứa 13% glucose và 87% maltose Tác dụng của α- amylase lên amylosepectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α- 1,6 – glycoside ) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%

Tóm lại, dưới tác dụng của α- amylase, tinh bột có thể chuyển thành

maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường α- amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu dextrin phân tử thấp không cho màu với iodine và một ít maltose Khả năng dextrin hóa cao của α- amylase là tính chất đặc chưng cảu nó Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hay amylase dịch hóa

Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-amylase:

 Giai đoạn dextrin hóa:

Tinh bột -> dextrin phân tử lượng thấp

 Giai đoạn đường hóa:

Dextrin -> tetre và trimaltose -> di & monosaccgaride

Amylase -> oligosaccharide -> poliglucose

Maltose -> maltotrioso -> maltotetrose

Phần 2.Quy trình sản xuất enzym α amilase

I.Môi trường sản xuất enzyme amylase

I.1.Môi trường lỏng

Ở môi trường lỏng,

VSV sẽ phát triển trên bề

mặt môi trường, tạo thành

khuẩn lạc ngăn cách pha

lỏng ( môi trường ) và pha

khí ( không khí ) Ở đây,

VSV sẽ sử dụng chất dinh

dưỡng từ dung dịch môi

trường, O2 từ không khí, tiến

hành quá trình tổng hợp

enzyme Enzyme ngoại bào

sẽ được tách ra từ sinh khối

và hòa tan vào dung dịch

môi trường Enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối VSV

Hình 1: Lên men trong môi trường lỏng ở quy mô phòng thí nghiệm

Nuôi cấy VSV thu nhận enzyme trên môi trường lỏng theo phương pháp cấy

bề mặt thường được tiến hành trong các khay có chiều cao khoảng 12-15 cm, chiều rộng và chiều dài được thiết kế tùy theo kích thước phòng nuôi sao cho thuận tiện trong thao tác

Ở đây người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trường lỏng Nếu chiều cao môi trường lỏng quá lớn, VSV sẽ không có khả năng đồng hóa hết các chất dinh dưỡng ở phía đáy khay nuôi cấy Nếu chiều cao môi trường nhỏ, sẽ thiếu thành phần chất dinh dưỡng, hiệu suất thu nhận enzyme sẽ không cao

Trong nghiều nhà máy, người ta thường tạo môi trường trong kháy nuôi cấy có chiều cao môi trường từ 5-7 cm là hợp lý.

I.2.Môi trường đặc(bán rắn)

Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuôi cấy VSV thu nhận enzyme, người ta thường sử dụng môi trường đặc Để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào trong lòng môi trường, người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường.Trong trường hợp này, VSV phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng

từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoại bào Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, còn các enzyme nội bào nằm trong sinh khối VSV

VSV không chỉ phá triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn ( môi

trường ) và pha khí ( không khí ) mà còn phát triển trên bề mặt của các hạt môi trường nằm hẳn trong lòng môi trường Môi trường nuôi cấy vừa có độ xốp cao và vừa phải

có độ ẩm thích hợp Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm bết môi trường lại , không khí không thể xâm nhập vào trong lòng môi trường, nếu có độ ẩm thấp quá sẽ không thuận lợi cho VSV phát triển Thông thường người ta thường tạo độ ẩm khoảng 55-65% W là hợp lý

Nếu sử dụng cám làm nguyên liệu chính để nuôi cấu VSV thu nhận enzyme, người ta phải cho thêm 20-25% trấu để làm xốp môi trường, tạo điều kiện thuận lợi không khí

dễ xâm nhập vào lòng môi trường Phương pháp nuôi cấy bề mặt bán rắn(môi trường đặc ) này rất thích hợp cho len men ở nấm mốc Asp.oryzae

A B

H ì n h 2 : L ê n m e n t r ê n m ô i trường rắn.

A: lên men kỵ khí t r o n g n ồ i b ằ n g đ ấ t n u n g , B : lên men hiếu khí

II Nguyên liệu sản xuất enzyme amylase

II.1 Nguyên liệu tạo môi trường nuôi cấy.

Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thường là những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốckhác.Trong các loại nguyên liệu trên, cám gạo, cám mì được sử dụng nhiều hơn cả.Hai loại này có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV phát triển Mặt kháckhi tạo môi trường, chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảokhối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối nguyênliệu

Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề sâu (Sử dụng môi trường hoàn toàn lỏng): Nguyên liệu nuôi cấy phổ biến là dịch đường như glucose, fructose, sacarose, pepton,… nồng độ thích hợp khoảng 10 - 15%

II.2 Chủng vi sinh vật dùng trong sản xuất amylase

•Chủng nấm mốc Asp Oryzae, Asp.niger…

-Enzyme chiết xuất từ nấm mốc: dễ dàng loại bỏ các khuẩn ty của nấmtrong môi trường sản xuất enzyme

-Enzyme amylase thô nằm trong dung dịch lọc

•Các chủng vi khuẩn là Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus

Bảng 1: Tính chất của amylase thu nhận từ các nguồn khác nhau.(Nguyễn Tiến

Thắng, Gíao trình công nghệ enzyme 2008)

Nguồn thu nhận Giới hạn pH(pH tối

ưu) Khối luợng phântử (Dalton) Nhiệt độ tốiưu (oC)

Malt 4,5 – 9,5 (5,5) 52.000 70

III Quy trình sản xuất nấm mốc giống

III.1.Nguyên liệu cho sản xuất mốc giống

Gạo nếp:Nước 14% ,Glucid 79,4%, Lipid 1,5% và protein 8,2% trong đó Protein của gạo nếp chủ yếu là glutein(oryzaine)và glubuline ngoài ra còn một ít lẫn Cozine và Prolamin

Glucid của gạo nếp chủ yếu là tinh bột, đường, cellulose và

hemicellulose.Trong tinh bột chủ yếu là amylopectin.Ngoài ra còn chứa một số vitamin như B1,B2,B6,PP và E

Gạo tẻ:Nước 13,84%; Glucid 77,55%; Protein 7,35%; Lipid 0,52%; cellulose 0,18% và muối khoáng :0,54%

Bột Mì:Nước 11,6%; Glucid 72%; Lipid 4,8%,Protein 9%; cellulose 1,5% và muối khoáng 1,2%

Bắp mảnh:Nước 11,4%; Glucid 78,9%; Lipid0,8%; Protein8,5%,cellulose 0,4% và muối khoáng 0,4%

III.2.Chuẩn bị mốc giống

Nuôi cấy giồng bao gồm:

-Trong ống thạch nghiêng hay giữ giống trong ống nghiệm

-Trong bình tam giác (nhân giống nhỏ)

-Trên sàng, khay (nhân giống lớn)

III.2.1.Nuôi cấy trong ống thạch nghiêng

Sau khi phân lập thành công trên môi trường chọn lọc từ đĩa petri cấy chuyển những mốc sợi sang (hay lấy nấm mốc từ ống giống) ống thạch khác.Yêu cầu ống giống phải tuyệt đối đảm bảo thuần khiết, không được lẫn lộn bất kỳ một loài VSV nào khác.Môi trường thạch nghiêng phải đảm bảo đầy đủ dinh dưỡng

III.2.2.Nuôi cấy giống trong bình tam giác

Cách làm môi trường trong bình tam giác:

-Môi trường gạo:gạo tẻ loại tốt, nấu cơm như nấu bình thường, hạt cơm chín đều không qúa nhão và không qúa khô.Độ ẩm khoảng 45% để nguội bớp rời thành từng hạt cho vào bình tam giác thành lớp dày khoảng 1cm Đậy nút bình tam giác bằng giấy chống ẩm Hấp thanh trùng ở P = 1atm trong vòng 30-45 phút

-Môi trường ngô mảnh: Ngô mảnh có kích thước khoảng 0,2-0,5 mm cho nước vào theo tỷ lệ 90% trọng lượng so với ngô, trộn đều trong khay để 1-2 giờ cho ngấm nước đều Bóp tơi cho vào bình tam giác khác thành lớp dày 1cm Đậy nút bình bằng giấy chống ẩm Hấp thanh trùng đồng thời làm chín ở P = 1atm, 1200C, trong thời gian 60 phút, lấy ra để nguội lắc cho khỏi vón cục

-Môi trường cám: Chọn cám tốt, mới nhưng loại thô không cần mịn hạt, sau đó làm tương tự như đối với ngô mảnh

Thường sử dụng các bình tam giác dung tích 0,3-0,5 lít hay 1 lít có cổ rộng Sau khi chuẩn bị môi ttrường trong bình thuỷ tinh ta tiến hành nuôi cấy nấm mốc Trước tiên cần phải chuẩn bị lấy 5ml nước vô trùng cho vào các ống nghiệm Sau đó,

đổ nước vô trùng cho bào tử hoà vào trong nước đồng thời cấy chuyển chúng sang bình tam giác Trung bình cứ một ống nghiệm có thể cấy chuyển sang 2-3 bình tam giác có dung tích 1 lít, lắc cho giống phân bố đều trong môi trường và tiến hành nuôi cấy chúng trong điều kiện thích ứng Thường nuôi khoảng 5-6 ngày là được Yêu cầu

cơ bản trong giai đoạn này là làm sao tạo được nhiều bào tử mạnh khoẻ Trường hợp nào thấy bình bị nhiễm thì phải loại bỏ ngay

III.2.3.Nuôi cấy mốc trên khay

Chuẩn bị môi trường làm mốc trên khay: Nguyên liệu thường dùng là ngô mảnh có kích thước 0,2-0,5mm Trộn với nước theo tỷ lệ 80-90% trọng lượng so với ngô nếu hấp dưới áp lực cao Trộn xong để khoảng 3-4 giờ cho ngô ngấm nước đều rồi hấp chín Thời gian hấp khoảng 3-4 giờ, dài hơn so với thời gian hấp cám hay gạo Nguyên liệu sau khi hấp phải chín đều, không được quá bết hoặc quá khô Độ ẩm còn lại 45-50% là vừa

Cách gieo cấy và nuôi mốc trên khay: Nguyên liệu dỡ ra, làm nguội nhanh Nếu ít có thể bóp bằng tay cho tơi ra, nếu nhiều cho qua máy đánh tơi và dùng quạt thổi Sau khi làm nguội đến 26-280C thì trộn nước giống từ bình tam giác vào với tỷ

lệ 0,5-1% hoặc với tỷ lệ cao hơn

Sau khi trộn giống, ủ môi trường vào khay thành luống cao (0,3m) Đặt ở nhiệt

độ 30-320C, độ ẩm 85-100% Thời gian ủ 6-8 giờ, nhiệt độ khối môi trường lên tới 34-360C và bào tử đã nảy mầm gần hết nhưng chưa thành sợi dài Lúc này cần rải môi trường thành lớp mỏng 2-3cm cần giữ cho nhiệt độ môi trường không vượt quá 360C Lượng nhiệt tỏa ra nhiều nhất ở khoảng 10-14 giờ sau khi trộn giống Sau khi nuôi 34-36 giờ, nhiệt độ khối môi trường bắt đầu giảm, cần phải điều chỉnh nhiệt độ lên 34-350C, để duy trì sự hình thành bào tử của nấm mốc

Thời gian nuôi mốc giống trên khay thường vào khoảng 60 giờ Nếu thấy hình thành bào tử chậm thì có thể kéo dài đến 70-72 giờ Mốc giống khi lấy ra thường có

độ ẩm 32-35 % có thể dùng ngay làm giống cho công đoạn sản xuất Nếu không dùng ngay thì phải đem sấy khô đến độ ẩm 8%, giữ dùng dần hoặc là cung cấp giống cho các nơi sản xuất Nhiệt độ phòng sấy không được quá 400C Các bao mốc giống cần được bảo quản nơi thoáng, mát ( có thể bảo quản lạnh 4-50C ) tránh ánh nắng Thời gian bảo quản tùy điều kiện có thể, từ 1-2 tháng hoặc lâu hơn

IV.Phương pháp sản xuất

IV.1 Theo phương pháp nuôi cấy bề mặt

IV.1.1 Quy trình công nghệ :

Vi sinh vật Môi trường

cám mỳ Trích ly bằng nước

Thấm tích

Kết tủa amylase

Ly tâm

Sấy kết tủa

Hấp thanh trùng: dưới áp suất hơi 1-1,5 atm trong thời gian 45-60 phút.

Trộn giống vi sinh vật: Sau khi làm nguội, tiến hành cấy giống hoặc rắc bào tử

vàomôi trường đã thanh trùng, ủ thành đống vài giờ Khi cấy vào môi trường

dinhdưỡng, bào tử sẽ phát triển thành tế bào nấm mốc và tạo ra các loại enzyme mà ta mong muốn

Kỹ thuật nuôi cấy: Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các khay

vớichiều dài 2-3cm, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy ở 28-32oC, không cần điều chỉnh pH Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ Quá trình pháttriển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt nàytrải qua các giai đoạn sau:

•Giai đoạn 1: giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôicấy

- Nhiệt độ tăng rất chậm.oSợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa.-Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi.oKhối môi trường còn rời

rạc.oEnzyme mới bắt đầu đươc hình thành.•Giai đoạn 2: giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ.oToàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm có màu trắng xámoMôi trường được kết lại khá chặt.oĐộ ẩm môi trường giảm dần

-Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-45oC.oCác chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá mạnh của nấmsợi

-Enzyme amylase được tổng hợp mạnh

-Lượng O2trong không khí giảm và CO2sẽ tăng dần

•Giai đoạn 3: giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ

-Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽchậm lại.-Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môitrường xuống 20-25 thể tích không khí /thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ

Chế phẩm amylase

Nghiền,bảo quản

IV.1.2 Thu nhận sản phẩm

Để sản xuất enzym tinh khiết người ta phả tiến hành như sau:

•Toàn bộ khối lượng enzym thô amylase được đem đi nghiền nhỏ để phá vỡ thành tế bào và làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô

•Sử dụng những chất trợ nghiền (cát thạch anh và bột thủy tinh) khi nghiền.Trước khi

sử dụng cát thạch anh và bột thủy tinh phải được rửa sạch, sấy khôở nhiệt độ lớn hơn 1000C để loại bỏ nước và tiêu diệt VSV.Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào

để trích ly enzymα-amylase Cứ một phần chế phẩm enzym thô, người ta cho 4-5 phần nước,khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực phẩm giasúc (chú ý cần loại bỏ cát thạch anh và bột thủy tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồimới cho gia súc ăn).Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzym thô vìtrong đó có chứa nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy.Dùng cồn và sunfat amon để kết tủa enzyme.Trong khi tiến hành kết tủa,người ta phải làm lạnh cả dung dịch

enzym thô và cả những tác nhân kết tủađể tránh làm mất hoạt tính enzyme

•Khi cho chất kết tủa vào dung dich enzyme thô, người ta tiến hành khuấy nhẹ, sau đó

để yên trong điều kiện nhiệt độ 4-70C Theo thời gian, cácenzyme sẽ được tạo kết tủa

và lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn và lọcthu nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm

> 70%W)

IV.1.3 Ưu và nhược điểm

Ưu điểm :

• Nuôi cấy bề mặt rất dễ thực hiện Quy trình công nghệ thường không phức tạp

•Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiềuso với nuôi cấy chìm

•Chế phẩm enzyme thô (bao gồm thành phần môi trường sinh khối vi sinhvật, enzyme

và nước) Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản

• Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp.•Trong trường hợp bị nhiễm các vi sinh vật lạ, ta rất dễ dàng xử lý Môitrường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bịnhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy Những khuvực khác sẽ hoàn toàn được an toàn

Nhược điểm :

•Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy

•Trong phương pháp này vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường (môi trường lỏng hoặc môitrường bán rắn) nên rất cần nhiều diện tích

IV.2 Theo phương pháp nuôi cấy bề sâu:

IV.2.1 Quy trình công nghệ

Vi sinh vật

Hấp khử trùng ở nhiệt độ 118 – 1250C, thời gian 40 – 60 phút, để nguội dến nhiệtđộ bình thường và tiếp giống vi sinh vật vào môi trường, tỷ lệ giống đưa vào là 2 – 2,5

% Sau đó quá trình nuôi cấy được thực hiện theo 2 phương pháp: nuôi cấy theochu

kỳ hay nuôi cấy liên tục

• Nuôi cấy theo chu kỳ là phương pháp nuôi cấy trong 1 thiết bị lên men Sau1 chu kỳ nuôi từ 2 – 4 ngày ở 28 – 320C người ta thu nhận toàn bộ dịch nuôicấy như là 1 loại chế phẩm enzyme thô Phương pháp này không đòi hỏi kỹthuật cao nhưng năng suất thấp

• Nuôi cấy liên tục là để khắc phục tình trạng trên Quá trình nuôi cấy liên tụccó thể nuôi cấy trong 1 thiết bị, cũng có thể thực hiện trong nhiều thiết bị.Phương pháp này

có lợi là nếu chất lượng sản phẩm ra cuối cùng ra ta thunhận đuợc chưa đạt yêu cầu đặt ra ta có thể khắc phục bằng hai cách

Dich nuôi cấy Mất rỉ đường

Hấp thanh trùng

Trộn giống vi sinh vât

Nuôi cấy

Amylase thô

-Cách thứ nhất: làm cho thời gian lưu của dung dịch và tế bào vi sinhvật trong thiết bị lâu hơn.

-Cách thứ hai là: ta tiến hành hoàn lưu dịch lên men hòa chung vớidòng môi trường

để tái lên men

IV.2.2 Thu nhận sản phẩm

Dung dịch sau khi nuôi cấy theo phương pháp bề sâu được tách khỏi sinh khối vàcác thành phần không hòa tan bằng phương pháp ly tâm Dịch thu thường chứa 2 – 3% chất khô hòa tan Hàm lượng chất này rất nhỏ, do đó ta cần phải cô đặc chúngcho đến khi khối lượng dịch giảm đi 5 – 10 lần ở điều kiện chân không

IV.2.3 Ưu và nhược điểm

Ưu điểm:

•Phương pháp nuôi cấy hiện đại dễ cơ khí hoá, tự động hoá, năng suất cao

•Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến có khả năng sinh tổnghợp enzyme cao và lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các điều kiệnnuôi cấy, enzyme thu được tinh khiết hơn, đảm bảo vô trùng

Nhược điểm:

•Đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanhtrùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy, không khí cung cấp cho quátrình nuôi cấy

•Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô trùng sẽ bị nhiễm hàng

loạt,toàn bộ gây tổn thương lớn và thu hồi enzyme sẽ có giá thành cao

V.Quy trình lên men công nghiệp tạo enzyme amylase

V.1 Nguyên liệu

Nguồn tinh bột: Ở nước ta nguồn nguyên liệu chứa tinh bột thì vô cùng đa dạng và phong phú.Ví dụ tinh bột từ gạo ( gạo tẻ, gạo nếp), ngô (bắp), sắn, …Nhưng để phù hợp cho sản xuất enzym amylase ở quy mô công nghiệp thì cần phải tính đến chi phí cho giá thành sản phẩm Do vậy, nguồn nguyên liệu cần được quan tâm và chú trọng

về mức độ rẻ tiền và dể kiếm Đây là một lợi thế rất quan trọng cho nhà sản xuất và cho cả người tiêu dùng để có giá thành thấp và được sản xuất đại trà.Sau đây, giới thiệu một số nguồn nguyên liệu dễ tìm: