Ứng dụng các kỹ thuật array trong lĩnh vực môi trường

Còn quá sớm để nói về lịch sử của DNA array vì kỹ thuật này tương đối mới và thuộc về tương lai hơn là quá khứ. Đầu tiên có thể kể đến các mô tả đầu tiên về cấu trúc DNA của Watson & Crick (1953), cho thấy có thể tách DNA thành hai mạch đơn (biến tính) khi xử lý nhiệt hoặc dung dịch kiềm

Ứng dụng các kỹ thuật array trong lĩnh vực môi trường

Nguyễn Xuân Hưng

MỤC LỤC

Mở đầu

PHẦN I_ KỸ THUẬT DNA ARRAY

1 Lịch sử ra đời

2 Kỹ thuật DNA array

2.1 Cấu trúc và chức năng của DNA array

2.2 Quá trình thực hiện DNA array

2.2.1 Chế tạo mảng

2.2.2 Tiến hành thí nghiệm

3 Các vấn đề tồn tại trong kỹ thuật DNA array khi áp dụng trong lĩnh vực môi trường PHẦN II_ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT DNA ARRAY TRONG QUẢN LÝ MÔI TRƯỜNG 1 Các cải tiến loại một

1.1 Cải tiến mẫu dò

1.2 Cải tiến mảng

2 Các cải tiến loại hai

2.1 PNA array

2.2 Nanowire array

2.3 Peptide array

2.4 Glycan array

2.5 Array hoá học (Chemical array)

2.6 Protein array

PHẦN III_ KẾT LUẬN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHẦN I_ KỸ THUẬT DNA ARRAY

1 Lịch sử ra đời

Còn quá sớm để nói về lịch sử của DNA array vì kỹ thuật này tương đối mới và thuộc về tương lai hơn là quá khứ Đầu tiên

có thể kể đến các mô tả đầu tiên về cấu trúc DNA của Watson & Crick (1953), cho thấy có thể tách DNA thành hai mạch đơn (biến tính) khi xử lý nhiệt hoặc dung dịch kiềm Năm 1961, Marmur & Doty mô tả quá trình ngược lại, hồi tính, cơ sở của tất cả các phương pháp PCR và lai phân tử Các nghiên cứu này gợi ra cách phân tích axit nucleotide dựa trên mối liên

hệ trình tự giữa chúng và các phương pháp lai phân tử phát triển nhanh chóng [1]

Vào cuối những năm 1960, Pardue & Gall; Jones & Roberson tìm ra phương pháp lai in situ (sau này kết hợp với mẫu dò đánh dấu huỳnh quang gọi là FISH) Phương pháp cố định các nhiễm sắc thể và nhân trên phiến kính, sao cho DNA tạo thành mạch kép với mẫu dò, ngày nay được sử dụng để đặt DNA lên phiến kính trong phương pháp microarray Vào thời gian này, hoá học hữu cơ cũng phát triển, cho phép tổng hợp tự động các mẫu dò oligonucleotide vào năm 1979 [1]

Kỹ thuật phân tích sử dụng phương pháp gắn đồng thời nhiều trình tự đích lên một màng lọc theo thứ tự, phương pháp thấm điểm (dot blot), được Kafatos và cộng sự (1979) đưa ra Trong kỹ thuật này, các trình tự đích được cố định trên giá thể và lai với mẫu dò (thường là trình tự axit nucleic đã đánh dấu) Saiki và cộng sự (1989) đưa ra một cách khác, dot blot ngược, trong đó gắn nhiều mẫu dò theo thứ tự trên màng và đích để phân tích được đánh dấu Cùng thời gian này, các array đầu tiên với giá thể không thấm nước được tạo ra trong phòng thí nghiệm của Maskos (1991) Đầu những năm 1990,

kỹ thuật đánh dấu phát huỳnh quang đa màu được Ried và cộng sự; Balding & Ward giới thiệu để phân tích nhiều loại mẫu

dò với phương pháp FISH Hiện nay, phương pháp này được sử dụng để phân tích so sánh mRNA từ những nguồn khác nhau [1]

Vào năm 1993, array chứa các oligonucleotide ngắn, dưới 19 nucleotide được tổng hợp in situ Năm 1994, Hoheisel và cộng

sự tăng mật độ chấm (spot) bằng cách dùng robot để lấy và đặt mẫu dò lên giá thể giúp tăng tốc độ quá trình, giảm sai sót chắc chắn mắc phải khi thực hiện những thủ tục có tính lặp lại cao bằng tay, và tăng tính chính xác vị trí [1]

Tất cả các thí nghiệm tiên phong ở trên là cơ sở của kỹ thuật array hiện nay Kỹ thuật này phát triển đến mức chỉ vài năm nữa có thể so sánh nó với kỹ thuật PCR không thể thiếu trong sinh học hiện nay.

2 Kỹ thuật DNA array

2 Kỹ thuật DNA array

DNA microarray đầu tiên được thiết kế khám phá các loại thuốc mới [2], phân tích biểu hiện gen [3], tái giải trình tự DNA [4] Kỹ thuật này mới được ứng dụng trong lĩnh vực vi sinh môi trường trong vài năm gần đây [5] nhưng đã cho thấy những tiềm năng vô cùng to lớn trong phân tích quần xã vi sinh vật, xác định sinh vật gây bệnh cũng như kiểm soát các quá trình trong cả khoa học cơ bản và khoa học ứng dụng về môi trường [6].

2.1

Cấu trúc và chức năng của DNA array

Trong kỹ thuật DNA array, người ta cố định các axit nucleic có trình tự xác định (mẫu dò) trên giá thể (mảng) thích hợp theo thứ tự Axit nucleic cần nghiên cứu (đích) được đánh dấu sau đó lai với mẫu dò trên mảng Ở những điều kiện lý tưởng, các axit nucleic có trình tự bổ sung bắt cặp chính xác với nhau Hơn nữa dưới các điều kiện này, cường độ phát hiện tín hiệu tỷ lệ trực tiếp với lượng mẫu dò nên có thể định lượng các loại axit nucleic trong mẫu ban đầu [7]

Đường kính chấm (mỗi chấm đại diện cho một loại mẫu dò) trên macroarray thường ≥ 300 µm và có thể được hiện hình bằng kỹ thuật gel thông thường hoặc máy quét dùng trong những kỹ thuật blot trước đây.Ngược lại, các chấm trên microarray thường có đường kính 200 µm và cần thiết bị hiện ảnh đặc biệt nhưmáy quét laser tiêu điểm (confocal laser scanner) [8; 9] Các phương pháp mới đây có thể tạo ra đường kính chấm 100 µm và nếu dùng phương pháp in quang hoạt (photolitho-graphy) để tổng hợp mẫu dò oligonucleotide in situ thì có thể tạo ra chấm có đường kính 20 µm [8]

Microarray m t ật độ thấp độ thấp ấp th p

Trong ứng dụng này, axit nucleic gắn chặt với màng nylon hoặc phiến kính

đã biến đổi hoá học Nếu cần, có thể sử dụng tia cực tím để tạo liên kết đồng hoá trị giữa mẫu dò với màng nilon Plasmid và các sản phẩm của phản ứng PCR thường được đặt trên màng hoặc phiến kính với mật độ 80 -

200 chấm/cm 2 với microarray mật độ thấp và 500 - 10.000 chấm/cm 2 với microarray mật độ trung bình [10]

Microarray mật độ cao

Đó là microarray có trên 10.000 mẫu dò/cm 2 Ngày nay người ta đã tạo ra các DNA microarray với hơn 250.000 mẫu dò/cm 2

gọi là DNA chip Giá thể thường dùng là thuỷ tinh hoặc silicon Trên chip có thể chứa các oligonucleotide dài từ 25 đến 60 base, sản phẩm PCR hoặc đôi khi là các plasmid lớn từ 500 đến 5.000 base [7].

2.2 Quá trình thực hiện DNA array

Về cơ bản, quá trình thực hiện thí nghiệm DNA array gồm hai bước: (i) chế tạo mảng và (ii) tiến hành thí nghiệm [1].

▲Hình 1: Sơ đồ thực hiện kỹ thuật microarray

2.2.1 Chế tạo mảng

Cơ chất dùng để chế tạo mảng cần có các tính chất sau: gắn ổn định với mẫu dò, tín hiệu nền gây nhiễu thấp, tính chất hoá học bề mặt đồng nhất và chất lượng dữ liệu cao [11] Một số chất đáp ứng được những điều kiện này và thường được sử dụng là thuỷ tinh, polypropylene, hoặc silicon [1], trong đó thuỷ tinh thường được dùng nhất [11] Giá thể thường được biến đổi hoá học để dễ dàng gắn với mẫu dò Trong trường hợp cơ chất thuỷ tinh, người ta phủ lên đó polymerase-lysine, amino silance hoặc silance

có gốc amin hoạt hoá [3] để tăng tính kỵ nước và khả năng bám dính của mẫu dò [12]

Thành phần thứ hai của mảng là mẫu dò Mẫu dò để gắn trên mảng cần được lựa chọn kỹ theo đích sử dụng Hiện đã có nhiều phần mềm cũng như cơ sở dữ liệu giúp đơn giản hoá công đoạn này Tuỳ mục đích sử dụng, mẫu dò có thể là oligonucleotide ngắn (15-25 nucleotide), oligonucleotide dài (50-120 nucleotide) hoặc cDNA (dài 100-3000 bp) [11]

Sau khi chọn được mẫu dò, gắn (hay còn gọi là in) chúng trên bề mặt mảng bằng hai cách: (i) cố định (cDNA) (ii) tổng hợp in situ (oligonucleotide) Cách thứ nhất thường sử dụng robot với các kỹ thuật in kim

(contact-tip deposition printing), in vi tiếp xúc (micro-contact printing (µCP)), in vi kênh (micro-fluidics networks (µFN)) và in mạ (electro capture) để đặt mẫu dò đã tổng hợp từ trước lên mảng Kỹ thuật in quang hoạt (photolithographic) được dùng cho các ứng dụng cách hai Ngoài ra, in áp điện (piezoelectric printing) và in vi lỏng (micro wet printing (µWP)) có thể sử dụng cho cả cố định và tổng hợp in situ [7]

In kim (Contact-tip deposition printing)

Kỹ thuật này có giá trị thương mại vào năm 1997 bởi công ty Synteni, được nhiều nhóm nghiên cứu sử dụng để chế tự tạo mảng DNA Đầu tiên người ta hoà tan axit nucleic sau đó nhúng kim nhọn vào để lấy

ra một lượng dung dịch xác định tại đầu của nó Sau đó gắn dung dịch này lên bề mặt của cơ chất (Hình 2) Trong thực nghiệm, dùng nhiều đầu kim cùng lúc [13]

▲Hình 2: Sản xuất DNA microarray sử dụng contact tip deposition printing [Theo 7]

Trong hầu hết các trường hợp, kim nhọn có rãnh giống như bút mực để giữ dung dịch Phương pháp này

có thể tạo ra các mảng mật độ cao chứa khoảng 10.000 cDNA khác nhau có kích thước từ 500 đến 5.000 base trên bề mặt thuỷ tinh 3,6 cm2 [7]

In vi tiếp xúc (µCP- Micro-contact printing)

Phương pháp µCP có nguyên lý tương tự in kim Trong đó, dùng “con dấu” polydimethysilane (PDMS) đểchuyển axit nucleic lên bề mặt giá thể (Hình 3) Trên thực tế, kỹ thuật này không sản xuất thành công cácmảng mật độ cao [7]

▲Hình 3: Sản xuất DNA array sử dụng micro-contact printing [Theo 7]

In vi kênh (µFN- Micro-fluidics network)

µFN là kỹ thuật µCP cải tiến Trong đó, con dấu PDMS có các kênh nhỏ được đặt trên thuỷ tinh, vàng, polystyrene hoặc bề mặt silicone/silicone dioxide Dung dịch cơ chất chứa đầy trong những kênh này được gắn lên bề mặt mảng bởi sức hút mao quản (Hình 4)

▲Hình 4: Sản xuất mảng bằng kỹ thuật µFN [Theo 7]

Giống như µCP, tính khả thi của µFN để sản xuất các DNA array đang được chứng minh [7]

In mạ (Electro capture)

Các array này giống như một con chip silicon Giá thể ở đây là silicon có lớp bề mặt bị ôxi hoá bởi nhiệt

Ở những vị trí xác định trên bề mặt này có các điện cực platin dày 500 nm Sau đó tiến hành một loạt cácbiến đổi hoá học có thứ tự để tạo ra chip gồm nhiều lớp Toàn bộ chip trừ phần không gian của điện cực platin được phủ lớp lưỡng điện (dielectric) Si3N4 dày 2 mm, bằng cách này có thể thao tác với điện cực

từ trên xuống trong khi xung quanh nó được bảo vệ bởi lớp Si3N4 Trên cùng của chip là lớp agarose giúp cố định các phân tử axit nucleic đã biotin hoá (Hình 5)

streptavidin-▲Hình 5: In mạ [Theo 7]

Gắn mẫu dò lên chip bằng cách phủ lên bề mặt dung dịch chứa các oligonucleotide đã biotin hoá [7] Chúng được vận chuyển đặc hiệu tới các chấm chứa strepta-vidin bằng cách cho dòng điện lần lượt chạy qua mỗi điện cực (Hình 6) Hiện tại, chip với trên 400 điện cực đang phát triển trong các phân tích

di truyền (http://www.nanogen.com)

▲Hình 6: Sơ đồ chip electric silicon (A) Sơ đồ chip có 25 điện cực platin, chiều dài mỗi cạnh 1 cm Phần ngoại biên của chip có các điện cực platin (ô vuông màu sáng) để nối chip với nguồn điện Khi có dòng điện sẽ xuất hiện các đường sáng chạy giữa điện cực ngoại biên và điện cực nhỏ hơn ở trung tâm (B) Mặt cắt vùng điện cực trong trung tâm Vùng này chứa điện cực đường kính 160 µm tại bốn góc và 25 điện cực khác xếp thành hình vuông (C) Vùng điện cực [Theo 7].

In quang hoạt (Photolithography)

Công ty Affymetrix đã phát triển phương pháp in quang hoạt để tổng hợp oligonu-cleotide in situ trên giá thể rắn [14] Quá trình này dựa trên các kỹ thuật công nghiệp bán dẫn [15]

Đầu tiên, gắn các phân tử có nhóm bảo vệ dễ phân huỷ bởi tia cực tím trên bề mặt giá thể rắn Dùng mặt

nạ để hoạt hoá chọn lọc các vị trí trên bề mặt bằng tia cực tím nhằm loại trừ nhóm bảo vệ nhạy sáng tại

đó Sau đó ủ với các nucleotide để chúng phản ứng với nhóm OH tự do tại bề mặt những vùng đã hoạt hoá, kết thúc một chu kỳ (Hình 7) Lặp lại chu kỳ trên với mặt nạ và nucleotide khác sẽ tạo ra một “bãi chông dày đặc các oligonucleotide có trình tự bất kỳ” tại những vị trí xác định trên cơ chất [14] Hiện tại,

có thể gắn hơn 500.000 oligonucleotide khác nhau trên diện tích 1,28x1,28 cm

(http://www.affymetrix.com)

In áp điện (Piezoelectric printing)

In áp điện sử dụng công nghệ được phát triển cho các máy in đen trắng để phân phối lượng nhỏ dung dịch DNA thay vì mực in như bình thường [16] Đầu áp điện tạo ra các giọt nhỏ trên đầu phân phối (hình 8) Hiện tại có thể dùng phương pháp này để tạo ra các mảng có trên 10.000 chấm/cm2

Cũng có thể dùng kỹ thuật này để chế tạo các mảng oligonucleotide bằng cách dùng 5 đầu phân phối áp điện khác nhau (mỗi đầu chứa một loại phân tử phosphoramidite nucleotide cần để tổng hợp

oligonucleotide, đầu thứ năm chứa chất khử trityn hoá, hình 9) [16]

▲Hình 7: Sơ đồ phương pháp in quang hoạt [Theo 16]

▲Hình 8: Sơ đồ ống phun áp điện Đơn vị sử dụng trong hình.|U|: giá trị tuyệt đối của điện áp [Theo 7]

▲Hình 9: Tổng hợp oligonucleotide in situ sử dụng ống phân phối áp điện Thủ tục nhiều ống phun DMTr: nhóm phát hiện

dimethoxytrityl, DTR: chất khử trityl hoá [Theo 7]

In vi lỏng (µWP - Micro wet printing)

Kỹ thuật này được Ermantraut và cộng sự (1998) phát triển, dùng hộp mực in khung silicon để định vị mặt nạ chắn trên bề mặt mảng Khung silicon kết hợp với đường ống phân phối thuỷ tinh tạo thành hệ thống kênh Kênh này sẽ liên kết các đường vào riêng biệt với mặt nạ trong hộp mực Mặt nạ đóng vai trògiao tuyến của hộp mực và bề mặt mảng đảm bảo chỉ một số vùng nhất định được tiếp xúc với hộp mực chứa chất khử nhóm bảo vệ Khi dung dịch oligonucleotide và dung dịch rửa đi qua chỗ khử nhóm bảo

vệ trên bề mặt, mặt nạ bị tách đi kết thúc một chu kỳ (hình 10) Tiếp tục chu kỳ mới ở đó thay đổi các nucleotide thêm vào và vị trí mặt nạ, ta sẽ tổng hợp được các oligonucleotide ngắn tại những vị trí xác định trên cơ chất Hệ thống này cũng có thể được sử dụng để cố định các oligonucleotide và các chất khác như protein hoặc kháng thể

▲Hình 10: Sơ đồ nguyên lý của kỹ thuật in vi lỏng [Theo 7]

2.2.2 Tiến hành thí nghiệm

Về cơ bản, các bước tiến hành thí nghiệm với microarray là như nhau và gồm 3 bước: (i) chuẩn bị mẫu; (ii) tiến hành lai; (iii) xác định tín hiệu và chuẩn hoá dữ liệu

Chuẩn bị mẫu

Hiệu quả phân tích bằng microarray phụ thuộc đáng kể vào khâu chuẩn bị mẫu Mẫu để lai (đích) có thể

là RNA hoặc DNA được đánh dấu nhằm mục đích phát hiện trực tiếp chúng sau khi lai Cho đến nay đã

có rất nhiều phương pháp đánh dấu khác nhau được phát triển nhằm tăng độ nhạy và tính đặc hiệu của thí nghiệm Các phương pháp đánh dấu bao gồm gắn trực tiếp chất đánh dấu vào đích bằng phản ứng của các nhóm hoạt động hoá học, PCR với mồi đánh dấu hoặc dùng enzyme biến đổi trực tiếp trình tự đích Các chất chỉ thị phát hiện có thể là chất phát huỳnh quang (Cy3/Cy5, streptavidin /phycoerythrin), chất phóng xạ (32P, 33P, 35S), chất phát quang hoá học (Chemilumi-nescent) như digoxigenein, biotin; và nhuộm vàng/bạc [7] Trong đó, Cy3/Cy5 được sử dụng rộng rãi nhất [17]

▲Hình 11: Sơ đồ đánh dấu mẫu dò dùng Cy3/Cy5 [Theo Yu et al., 2002]

Xác định và phân tích tín hiệu lai

Sau khi lai, tiến hành rửa để loại bỏ đích không bắt cặp hoặc bắt cặp không đặc hiệu với mẫu dò [9] Tiếp

đó dùng thiết bị hiện ảnh xác định tín hiệu lai do chất đánh dấu trên đích phát ra Cường độ tín hiệu cho phép đánh giá tương đối hiệu quả bắt cặp giữa đích và mẫu dò (hình 12) Điều đáng nói ở đây là lượng

dữ liệu cần phân tích trong thí nghiệm microarray rất lớn do trên một mảng có thể đặt hàng chục ngàn mẫu dò, tương ứng với nó là hàng chục ngàn tín hiệu, trong đó lại có những tín hiệu nhiễu vì nhiều nguyên nhân Do đó cần có các phần mềm máy tính để chuẩn hoá dữ liệu, đơn giản hoá quá trình phân tích nhằm đưa ra các kết luận nhanh và chính xác

Các bước chung khi tiến hành kỹ thuật microarray là như vậy, nhưng vì có hai loại mảng ứng với mẫu dò

là cDNA và oligonucleotide nên có đôi chút khác nhau khi sử dụng chúng

▲Hình 12: Hiệu quả lai khác nhau tạo ra các tín hiệu màu khác nhau trên mảng

Mảng chứa mẫu dò cDNA

Trong hầu hết các thí nghiệm microarray thông thường, mảng được tạo ra từ mẫu dò cDNA có kích

thước tương đối lớn sẽ lai với mRNA từ hai mẫu khác nhau Mỗi mẫu được đánh dấu một loại thuốc nhuộm phát huỳnh quang có màu khác nhau (hình 13) Sau khi lai, tỷ lệ tín hiệu phát huỳnh quang của mỗi chấm sẽ phản ánh mức độ chiếm ưu thế của sản phẩm phiên mã, trực tiếp nói lên các đáp ứng liên quan tới điều kiện nghiên cứu [18].

Nhược điểm: (i) Tính tái sử dụng kém - mỗi phiến kính là duy nhất, luôn phải có mẫu đối chứng cho mỗi

phiến kính (ii) Cấu trúc bậc hai của cDNA làm giảm hiệu quả lai hoặc gây ra hiện tượng lai chéo [19] (iii)Không phân biệt được các gene liên quan gần và các gene khác nhau một nucleotide (iv) Sự đan xen giữa hai kênh màu tạo ra nhiễu Hơn nữa, hai loại chất phát huỳnh quang khác nhau sẽ luôn tạo ra hiệu quả lai khác nhau (cho dù là nhỏ) Do đó, cần phải chuẩn hoá dữ liệu [20] (v) Không có khả năng định lượng (vi) Cần lượng lớn đích [9]

Ưu điểm: (i) Rẻ, có thể tự chế tạo (ii) Cho kết quả tốt với những gen chưa biết trình tự [9] (iii) Độ dài

mẫu dò lớn (xấp xỉ 2x103 bp) xuất phát từ mẫu tham khảo thực tế nên tăng tính đặc hiệu [21] (iv) Tính đặc hiệu cao [21]

▲Hình 13: Thủ tục lai sử dụng mẫu dò cDNA

Mảng chứa mẫu dò oligonucleotide

Các chip tổng hợp in situ này có thể chứa đến 6.500 gene khác nhau, mỗi gene được đại diện bởi ít nhất một tập hợp của xấp xỉ 20 “cặp mẫu dò” khác nhau [22] Do phương pháp này không sử dụng mẫu đối chứng và mẫu dò có trình tự ngắn (25-60 base) nên để tăng tính chính xác và loại bỏ các tín hiệu nhiễu người ta đã nghĩ ra mô mẫu dò bắt cặp không hoàn hảo/hoàn hảo (MM/PM) Oligonucleotide bắt cặp hoàn hảo khác oligonucleotide bắt cặp không hoàn hảo chỉ một base chính giữa (hình 15) So sánh cường độ dấu hiệu MM/PM để quyết định tính đặc hiệu gắn Ô đầu tiên trong hình cho thấy hiệu quả lai của các mẫu dò MM/PM như nhau nên không được dùng để đánh giá Tương tự, vùng 3 không được đánh giá vì cường độ tín hiệu lai MM/PM như nhau, cho thấy kết quả lai không đặc hiệu Tất cả các vùng khác có kết quả lai đặc hiệu và là đối tượng phân tích

Ưu điểm: (i) Các điều kiện được điều khiển chính xác, chip có chất lượng đồng nhất và có thể so sánh

hiệu quả (ii) Có thể xác định các gene liên quan gần (iii) Có khả năng định lượng (iv) Cần lượng nhỏ đích [9] (v) Mật độ mẫu dò lớn cho phép phân tích nhiều gen hơn trên một array [21] (vi) Chỉ dựa trên thông tin trình tự tức chỉ việc dựa trên các trình tự đã biết và tổng hợp mẫu dò rồi gắn trên mảng mà không phụ thuộc vào bất cứ một phương pháp nào khác như PCR, tách dòng… do đó tránh được sai số

thực nghiệm cũng như lãng phí nếu xác định sai dòng, cDNA hoặc chấm từ những công việc này như gặp phải với phương pháp blot [14].

▲Hình 14: Thủ tục lai dùng mẫu dò tổng hợp in situ

Nhược điểm: (i) Các trình tự được chọn dựa ngân hàng gene nên có thể phải chỉnh sửa (ii) Mẫu dò

ngắn làm giảm độ nhạy và tính đặc hiệu (iii) Không thể so sánh đồng thời sự biểu hiện gene của hai mẫuthí nghiệm liên quan trên cùng một mảng [21; 23]

▲Hình 15: Sơ đồ nguyên lý hệ thống MM/PM [Theo 14]

3 Các vấn đề tồn tại trong kỹ thuật DNA array khi áp dụng trong lĩnh vực môi trường

3 Các vấn đề tồn tại trong kỹ thuật DNA array khi áp dụng trong lĩnh vực môi trường

Mặc dù microarray ra đời mở ra một kỷ nguyên mới trong rất nhiều lĩnh vực, song khi ứng dụng trong môitrường nó gặp phải một số vấn đề

Vấn đề kỹ thuật

Tồn tại cố hữu của phương pháp microarray là các điều kiện lai (nhiệt độ, nồng độ muối…) không bao giờ tối ưu cho mọi phân tử, dẫn đến hiệu quả lai không đặc hiệu hoặc không hoàn toàn và kết quả sẽ thiếu chính xác

Vấn đề quan trọng khi áp dụng kỹ thuật microarray với mẫu môi trường liên quan đến các biến đổi khác nhau của dấu hiệu lai do mật độ và trình tự khác nhau [24] Tính đa dạng di truyền rất lớn trong môi trường tác động đến cả việc chế tạo mảng và giải thích dữ liệu Tính đa dạng trình tự gene cấu trúc trongcác quần thể liên quan về mặt chức năng (như vi khuẩn cố định nitơ, khử sulfate hay nitrat hoá) lớn làm khả năng tính toán của máy tính hiện khó đáp ứng nổi, đặc biệt khi sử dụng các mẫu dò oligonucleotide ngắn [25] Hơn nữa, hiệu quả của microarray với các mẫu môi trường khác nhau có tương tự với mẫu chủng đơn hay không là một vấn đề khó đánh giá [6; 26]

Một điều đặc biệt quan trọng là khi lai cùng lúc hàng trăm hoặc hàng ngàn mẫu dò trên mảng sẽ làm tăngkhả năng lai chéo giữa các trình tự không liên quan [27] Tín hiệu lai khác nhau phản ánh khá xác thực

độ khác nhau giữa các mẫu tuy nhiên, khi kết quả lai giống nhau không có nghĩa là những mẫu này giốngnhau Vì có thể tồn tại các trình tự khác biệt nhưng chúng không được đặt thành mẫu dò trên mảng [24] Tính nhạy và đặc hiệu cũng là một tham số rất quan trọng khi sử dụng microarray để nghiên cứu với các mẫu môi trường Ở đó, sinh khối hay nồng độ đích thấp và nhiều chất ô nhiễm làm giảm giới hạn phát hiện [6; 26; 25] Do đó, một số nhà nghiên cứu đã làm giàu mẫu hoặc sử dụng PCR để thu được đủ đích

đã đánh dấu [27] Điều này chắc chắn làm thay đổi các điều kiện môi trường in situ và có thể tác động sâu xa tới biểu hiện gene, thành phần quần xã và cản trở việc định lượng các quần thể tự nhiên [28] Tính đặc hiệu và độ nhạy cả hai phụ thuộc vào các yếu tố thí nghiệm liên quan đến việc chế tạo mảng vàlai Tất cả các yếu tố như bề mặt hoá học của phiến kính, hình thái chấm, khả năng gắn mẫu dò và các điều kiện lai cũng như rửa đều ảnh hưởng đến tính đặc hiệu và độ nhạy [29]

Ngoài ra, các cấu trúc bậc hai nội phân tử như cấu trúc kẹp tóc ảnh hưởng lớn đến hiệu quả lai và gây rasai số [4]

Vấn đề phân tích

Các vấn đề phân tích liên quan đến việc thu nhận và giải thích dữ liệu từ các thí nghiệm mảng rất đáng chú ý Việc giải thích dữ liệu rất khó do luôn tồn tại các khác nhau cố hữu trong thí nghiệm mảng, một phần do các yếu tố thực nghiệm đã đề cập ở trên Ngoài ra, do thiếu sự lặp lại và định lượng của một số lớn dữ liệu thu được nên làm cản trở việc phân tách các dữ liệu thích đáng Trừ một số ngoại lệ [30-32], thậm chí hầu hết sự chú ý nhỏ nhất với các tiêu chuẩn phân tích bị bỏ qua trong những nghiên cứu môi trường Điều này làm phần lớn các kỹ thuật mảng dùng cho môi trường hiện vẫn đang trong giai đoạn phát triển [25]

Tuy còn khá nhiều vấn đề song nếu so sánh với các kỹ thuật trước đây thì những hạn chế của microarraykhông đáng kể và hoàn toàn có thể bù đắp bởi lợi ích của nó mang lại Hơn nữa, các hạn chế này đa phần đều có thể khắc phục bằng những cải tiến, phát triển mới trong kỹ thuật

PHẦN II_ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT DNA ARRAY TRONG QUẢN LÝ MÔI TRƯỜNG

PHẦN II_ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT DNA ARRAY TRONG QUẢN LÝ MÔI TRƯỜNG

Vi sinh vật đóng vai trò độc nhất vô nhị trong chức năng cũng như trong việc duy trì hệ sinh thái Mới đây,

đã có bằng chứng cho thấy rằng hoạt tính của vi sinh vật là thiết yếu cho tính ổn định của sinh quyển [33] Trạng thái tồn tại, phân bố của vi sinh vật hoặc quần xã vi sinh vật chỉ thị có thể báo trước các hiệu ứng môi trường trong một thời gian dài Hầu như mọi thay đổi môi trường đều làm thay đổi thành phần quần xã vi khuẩn Do đó, có thể phát hiện sớm các yếu tố biến đổi không biết trước bằng cách phân tích

biến thiên quần thể hay nói cách khác, có thể sử dụng vi sinh vật để giám sát trạng thái và các biến đổi môi trường [34] Tuy nhiên, để có thể quản lý môi trường trên diện rộng, cần phân tích một lượng mẫu sinh học khổng lồ, điều này không thể đạt được với các kỹ thuật trước đây [35]

Ngày nay, trong lĩnh vực quản lý môi trường cần phát triển những phương pháp mới để đánh giá tốc độ phân huỷ sinh học, quá trình chuyển hoá sinh học và động học quần xã vi sinh với mục tiêu xác định quần xã, giám sát quá trình và xác định điểm kết thúc phân huỷ sinh học Trong thực nghiệm, để đạt được những điều trên đòi hỏi phải: (i) xác định đồng thời nhiều loại vi sinh vật, (ii) sử dụng phương pháp phân tích có thể tự động hoá, (iii) giám sát RNA như chỉ thị định tính hoạt tính vi sinh vật và (iv) định lượng mức độ RNA và/hoặc hoạt tính vi sinh vật Microarray là kỹ thuật thoả mãn các yêu cầu này [6] Nómang lại những hứa hẹn trong sinh thái vi sinh vật như phát hiện và định lượng các họ gen liên quan đếncác chu trình sinh địa hoá học, phân huỷ sinh học và vi sinh vật gây bệnh với hiệu suất cực cao [31] Với tập hợp mẫu dò được thiết kế thích hợp, chỉ cần một thí nghiệm để phát hiện vài ngàn chủng vi khuẩn thuộc các loài, giống hoặc phân ngành khác nhau Điều này có nghĩa là trong các lĩnh vực y học, vi sinh thực vật, vi sinh động vật động vật, quản lý chất lượng thực phẩm, nước chỉ cần một kiểm tra để phát hiện tất cả các vi khuẩn gây bệnh/có lợi/nhiễm tạp có thể có trong mẫu nghiên cứu [36]

Kỹ thuật microarray mới ra đời vào đầu những năm 1990, thực sự phát triển từ năm 1995 và mới được ứng dụng trong lĩnh vực môi trường chỉ vài năm gần đây [6] nhưng đã phát triển rất mạnh mẽ Một trong các ứng dụng nổi bất nhất của microarray trong quản lý môi trường là xác định vi sinh vật (bảng 1) Các microarray này chứa hàng trăm mẫu dò oligonucleotide, mỗi mẫu dò đại diện cho các chủng/loài/giống vi sinh vật khác nhau cho phép phát hiện nhanh với hiệu suất cao nhiều vi sinh vật từ hầu như bất cứ loại mẫu nào Khả năng sử dụng các mảng chuẩn đoán vi sinh vật bao phủ hầu như toàn bộ các lĩnh vực khoa học sự sống bao gồm các chuẩn đoán người, thú y, thực vật và động vật, vi sinh môi trường, kiểm tra chất lượng nước… Có thể xác định vi sinh vật gây bệnh cho người từ các mẫu thử nghiệm một cách hoàn hảo với khả năng thiết kế mảng xác định nhanh, không qua nuôi cấy, chỉ trong vài giờ và hầu như bảo trì được thông tin tự nhiên của nó Cũng có thể dùng microarray để phát hiện thực phẩm nhiễm khuẩn, vi sinh vật gây bệnh cho động, thực vật trên quy mô lớn Ngoài ra còn có thể sử dụng để nghiên cứu mức đa dạng vi sinh vật đất đối với tính chống chịu và độ màu mỡ của đất cũng như biến thiên độ đadạng theo hoạt động nông nghiệp [33]

Bảng 1: Các ứng dụng nổi bất nhất của microarray trong xác định vi sinh vật