Quy trình sản xuất penicillin

Cơ chế sinh tổng hợp penicillin nấm mốc P chrysogenum : Từ ba tiền chất ban đầu α-aminoadipic, cystein valin tổng hợp lại thành tripeptit δ -(αaminoadipyl) - cysteinyl - valin Tiếp theo trình khép mạch tạo vòng β-lactam vòng thiazolidin để tạo thành izopenicillin-N Rồi trao đổi nhóm α-aminoadipyl với phenylacetic (hay phenooxyacetic) tạo thành sản phẩm penicillin G (hay penicillin V., Có phương pháp chủ yếu: 1.Phương pháp lên men bề mặt: Áp dụng từ lâu, không triển khai sản xuất lớn Gồm phương pháp: Lên men nguyên liệu rắn (cám mì, cám ngô có bổ sung đường lactose) Lên men bề mặt môi trường lỏng tĩnh (phổ biến sử dụng môi trường lactose - nước chiết ngô) Quá trình sản xuất chung Nguyên liệu: Cám hạt ngũ cốc loại thường sử dụng nguyên liệu sản xuất Penicilin phương pháp bề mặt Nguyên liệu bổ sung nước cho độ ẩm khối nguyên liệu đạt 50% đến 60% Sau trùng 121oC, 0,5at 30 đến 45 phút Ngay sau kết thúc trùng, người ta rải chúng khay hình chữ nhật có kích thước dài 1-1,2m, rộng 0,6-0,8m, cao 56cm lớp môi trường cho vào dày 2-3 cm để đảm bảo thoáng khí mặt môi trường Trường hợp sử dụng cám mịn, người ta phải độn thêm trấu xay nhỏ cùi bắp xay nhỏ trước trùng Nguồn thức ăn cacbon thường lựa chọn là: loại bột hạt ngũ cốc, cám mỳ, cám gạo, vỏ khoai tây, rỉ đường, loại đường ( glucoza, fructoza, maltoza, lactoza …) dextrin, glycerin, axit axetic, manit, loại rượu, dịch thủy phân gỗ, nước thải hồ sunfit… Nguồn thức ăn nitơ là: bột đậu tương, nước chiết ngô, cao nấm men, nước chiết nấm nem, pepton, muối NO3-, NH4+… Các nguyên tố khoáng đa lượng thường gặp như: photpho, lưu huỳnh, ma nhê, sắt, canxi, kali, natri; nguyên tố vi lượng như: đồng, kẽm, coban, molipden… chất sinh trưởng Môi trường lên men : Cao ngô (loại đậm đặc) : 3.5% Lactose : 3.5% Glucose : 1.0% Canxicabonat :1.0% KH2PO4 : 0.4% pH sau trùng : Quá trình nhân giống: Quá trình nhân giống giống có ống nghiệm Trong nhà máy, lần cấy chuyền giống, người ta thường cấy làm ống: - ống dùng kiểm tra trước sản xuất, - ống dùng để sản xuất - Một ống dùng để bảo quản Để làm môi trường nhân giống người ta làm giống Chỉ có điều khác sau làm ấm môi trường đến độ ấn định, người ta phân phối chúng vào dụng cụ thủy tinh với khối luợng 1/5 hay 1/6 với dung tích dụng cụ, đậy nút đem trùng 121oC 0,5at 30 phút, sau để nguội cấy giống vào Đổ 10ml nước trùng làm nguội vào ống giống, lắc cho thật chuyển chúng sang tủ ấm 30-37oC nuôi đến bào tử xuất vá phát triển khắp môi trường, gọi trình nhân giống cấp Cứ thực tiếp ta có giống cầp 2, cấp 3…… có đủ 5-10% giống cho sản xuất Quá trình lên men Nấm Penicilin trình phát triển thường tạo nhiệt nấm Aspergillus Tuy nhiên người ta thường thổi khí quạt gió có lấp hệ thống làm để tăng cường khả phát triển sinh tổng hợp Quá trình lên men kéo dài 6-7 ngày nhiệt độ 24-28oC Váng nấm sợi giữ lại sau rút hết dịch lên men, tiếp tục sử dụng cho lần lên men lần lên men ta việc đổ thêm dịch lên men vào Các thí nghiêm cho thấy nên tái xử dụng váng nấm sợi 3-4 lần, lần sau hiệu suất thu nhận kháng sinh giảm dần 2.Phương pháp lên men chìm Sơ đồ công nghệ lên men sản xuất kháng sinh Kỹ thuật lên men chìm Kỹ thuật len men chìm kỹ thuật áp dụng hầu hết cở sản xuất penicillin công nghiệp Được vận hành theo phương pháp lên men bán liên tục, gồm phương án lên men gián đoạn theo mẻ có bổ sung liên tục (hay bán liên tục) hay vài cấu tử kết hợp với phương án tuần hoàn lại phần hệ sợi mẻ lên men trước (hoặc không) Quá trình nhân giống: Trong phương pháp lên men chìm, ngừơi ta thường sử dụng môi trường lỏng Để làm môi trường lỏng người ta sử dụng cao ngô, glucose, hydro, lactose, muối amon, thiosunfat, photphat kali natri, Quá trình lên men chìm người ta nhân giống môi trường lỏng, mục tiêu thu số lượng tế bào cao Môi trường nhân giống lên men penicillin khác với môi trường sản xuất chúng không chứa lactose, số kháng chất tiền chất Môi trường: Môi trường trùng 121 thời gian 30 phút, để nguội nhân giống Nhiệt độ trình nhân giống trì nhiệt độ 26_+1 thời gian cấp độ khoảng 72 Trong hầu hết trường hợp, lên men, người ta thay phần lớn (hoặc hoàn toàn) đường lactose đường glucose Lượng glucose bổ sung liên tục hay bán liên tục phải giám sát chặt chẽ nồng độ glucose suốt trình vận hành pha để trì nồng độ glucose mức thích hợp nhằm vừa giữ khối lượng hệ sợi ổn định, vừa đảm bảo sinh tổng hợp nhiều penicillin Trong thực tiễn, để tránh xảy thiếu hụt thời glucose , người ta kết hợp bổ sung lượng nhỏ đường lactose (khi đó, chưa bổ sung kịp glucose nấm mốc tự điều chỉnh để sử dụng đường lactose nên không xảy tượng tự phân hệ sợi) Ngoài nguồn nitơ nước chiết ngô, người ta thường sử dụng phối hợp (NH4)2SO4 để vừa cung cấp thức ăn N S, vừa sử dụng để điều chỉnh pH trình lên men (pH dịch len men ban đầu thường điều chỉnh khoảng pH = 6,5 – 6,8 dung dịch NaOH H3PO4); nồng độ NH4 + thường khống chế khoảng 0,3 – 0,4 kg/m3 dịch lên men Chất phá bọt thường sử dụng loại dầu béo như: mỡ lợn, dầu đậu tương, dầu vừng, dầu cám… Tiền chất tạo nhánh phenylacetic lên men sản xuất penicillin G (hoặc phenooxyacetic lên men sản xuất penicillin V) bổ sung liên tục (hoặc bổ sung gián đoạn làm nhiều lần) suốt thời gian pha lên men penicillin, để trì nồng độ khoảng 0,1 – 1,0 kg/m3 dịch (nếu nấm mốc tổng hợp đồng thời nhiều penicillin khác, nhiều gây độc cho nấm tăng cường thúc đẩy trình hydroxyl hóa sản phẩm penicillin) Sơ đồ hệ lên men dùng cho sản xuất penicillin Seed tank Fermentor Sơ đồ dây chuyền sản xuất penicillin Sơ đồ tóm tắt công đoạn xử lý dịch lên men thu penicillin tự nhiên Quá trình lên men Gồm hai pha: Pha thứ nhất: pha sinh khối Tốc độ sinh sản nấm xảy nhanh Sự tạo thành penicillin bắt đầu Pha thứ 2: hệ sợi phát triển chậm lại, pha penicillin tạo với mức độ cực đại Càng nhiều sinh khối hàm lượng penicillin nhiều Do cung cấp đầy đủ dinh dưỡng oxi Song sinh khối cao không cho nhiều penicillin Nhiệt độ: 26oC, pH: 7-7.5, thổi khí 1.2-1.5 thể tích/lít/phút Sự tích tụ penicillin thường xảy mạnh mẽ hệ sợi phát triển đạt trạng thái cân Trạng thái xác lập cung cấp vừa đủ liên tục lượng thức ăn tối thiểu cho nấm mốc Thiếu thức ăn, hệ sợi nấm tự phân, cung cấp nhu cầu trên, hệ sợi phát triển, không tích tụ mạnh penicillin mà tích tụ nhiều axit gluconic axit malic Trong sản xuất penicillin, cần xem xét thông số sau : tốc độ sinh trưởng vi sinh vật, nhu cầu trì thể (g glucose/ g tế bào/ h), tốc độ sản sinh penicillin riêng phần (q pen) thể (mg penicillin /g tế bào/ h) suất penicillin g glucose Ngoài ra, thời gian lưu nồi lên men, dung tích bể, thời gian chế biến, môi trường chi phí nhân công nhân tố bổ sung có quan trọng công nghiệp Khi lên men kết thúc, toàn môi trường lên men lọc sợi nấm chất rắn khác loại bỏ Dịch lọc acid hóa đến khoảng pH penicillin chiết loại dung môi butyl acetate Sau penicillin kết tủa khỏi dung môi nhờ bổ sung acetate kali thú hồi nhờ biện pháp lọc Ở bước tiếp theo, kết tinh lại từ isopropanol Nhân giống lên men ngày pH 6.8-7.4 25oC 8-10 ngày pH butyl axetat axetat kali isopropanol Lọc dịch lên men : Mục đích: Penicillin sản phẩm lên men ngoại bào Vì vậy, sau kết thúc trình lên men người ta thường tiến hành lọc để giảm tổn hao phân huỷ penicillin giảm bớt khó khăn tinh chế, tạp chất tạo hệ sợi nấm tự phân Thiết bị lọc: phổ biến thiết bị lọc hút kiểu băng tải kiểu thùng dịch để chuyển sang công đoạn Chỉ trường hợp đặc biệt cần phải xử lý kết tủa phần protein lọc lại dịch lần quay Thông thường, người ta cần lọc lần làm lạnh thứ hai Hiện tượng tự phân hệ sợi nấm thường kéo theo hậu làm cho dịch khó lọc Thu hồi sinh khối nấm: Phần sinh khối nấm rửa sạch, sấy khô sử dụng để chế biến thức ăn gia súc Thu nhận tinh chế kháng sinh Xử lý dịch lên men tinh chế thu penicillin tự nhiên Có ba phương pháp thu nhận tinh chế penicillin từ môi trường nuôi cấy, là: · Trích ly dung môi hữu · Hấp phụ · Trao đổi ion Trong ba phương pháp phương pháp trích ly dung môi hữu sử dụng nhiều Thu nhận tinh chế penicillin dung môi Quá trình chiết dung môi hữu thực hiệ qua hai giai đoạn : Giai đoạn :Trộn nước dung môi để tăng bề mặt tiếp xúc.làm để phần tử kháng sinh tiếp xúc chặt chẽ với dung môi.Tiến hành khấy lien tục để đảm bảo trình tiếp xúc đạt mức độ cao Giai đoạn 2:Sau tiếp xúc kháng sinh dung môi tạo kết tủa Những dung môi sau dùng để kết tủa kháng sinh: -các ancol:butanol,isopropanol,propanol -Các ester :actete etyl,butyl,amyl -Các ceton:metyl etyl acetone,metyl butyl ceton -Các ete: ete isopropylic,dioxin -benzen,phenol,pyridine,dicloetan,clorofoc Để tách kết tủa khỏi dung dịch người ta tiến hành ly tâm.Phương pháp ly tâm vừa nhanh vừa có hiệu Quá trình chiết dung môi hữu thực qua giai đoạn: Giai đoạn thứ nhất: trộn nước dung môi để tăng bề mặt tiếp xúc Giai đoạn thứ hai: sau trộn dung môi kháng sinh taọ kết tủa để tách kết tủa khỏi dung dịch người ta tiến hành ly tâm Trong phòng thí nghiệm sản xuất công nghiệp, người ta thường dùng dung môi sau để tiến hành thu nhận kháng sinh: Các ancol: butanol, isopropanol, propanol Các ester: acetate etyl, butyl, amyl Các ceton: metyl etyl aceton, metyl butyl ceton Các ete:ete isopropylic,dioxan Benzen, phenol, pyridin, dicloetan, lorofoc Một phương pháp sử dụng co hiệu để thu nhận kháng sinh phương pháp phân tán tĩnh điện phương pháp thay cho phương pháp trích ly dung môi Nguyên tắc phương pháp sử dụng hiệu điện cao để tạo vi giọt dung dịch chứa penicillin Một số lượng lớn vi giọt chuyển động nhanh Kết tạo vận tốc chuyển động vật chất tốc độ trích ly tăng nhanh Phương pháp có ưu điểm sau: Do thời gian thực ngắn nên không làm thay đổi hoạt chất sinh học vật chất cấn thu nhận  ... nhiều penicillin khác, nhiều gây độc cho nấm tăng cường thúc đẩy trình hydroxyl hóa sản phẩm penicillin) Sơ đồ hệ lên men dùng cho sản xuất penicillin Seed tank Fermentor Sơ đồ dây chuyền sản xuất. .. phenylacetic lên men sản xuất penicillin G (hoặc phenooxyacetic lên men sản xuất penicillin V) bổ sung liên tục (hoặc bổ sung gián đoạn làm nhiều lần) suốt thời gian pha lên men penicillin, để trì... nuôi đến bào tử xuất vá phát triển khắp môi trường, gọi trình nhân giống cấp Cứ thực tiếp ta có giống cầp 2, cấp 3…… có đủ 5-10% giống cho sản xuất Quá trình lên men Nấm Penicilin trình phát triển