INTERACTION OF MITOCHONDRIAL SSC1 DOMAINS WITH n TERMINAL DOMAIN OF TIM44

  INTERACTION OF MITOCHONDRIAL SSC1  DOMAINS WITH N‐TERMINAL DOMAIN OF  TIM44          LIANG CHEN  (B.Sc., Tsinghua University)        A THESIS SUBMITTED FOR THE DEGREE OF  MASTER OF SCIENCE    DEPARTMENT OF BIOLOGICAL SCIENCES  NATIONAL UNIVERSITY OF SINGAPORE    2015   i     D Declaratio on    I hereby declarre that this tthesis is myy original wo ork and it has been wrritten by me e in  urces of info ormation w which have  its eentirety. I haave duly acknowledgedd all the sou beeen used in th he thesis.     Thiss thesis has also not be een submittted for any d degree in an ny universitty previously.                ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐  Liang Chen n    2  2015/1/22         ii     Acknowledgement    Foremost, I would like to express my sincere gratitude to my advisor Prof. Yang  Daiwen for the continuous support of my study and research, for his patience,  motivation, enthusiasm, and immense knowledge. His guidance helped me in all the  time of research and writing of this thesis. His encouragement and tolerance warmed  my heart with selfless love during the most difficult time in my study.    In addition, I would like to thank Prof. Henry Mok for his encouragement, insightful  comments, and hard questions during my research.    My special thanks go to Dr. Fan jingsong for his help of the NMR structure calculation  of Ssc1 LID sub‐domain.    I am grateful my fellow labmates in NUS Structural biology labs: Dr. Lin Zhi, Dr. Zhang  jingfeng, Dr. Lim Jack Wee, Dr. Tan Kang Wei, Dr. Wang shujing, etc. for their  guidance, discussion and help on my study and research.    Last but not the least; I would like to thank my parents, my wilfe and my son for  supporting me spiritually throughout my life.        iii     Table of Contents    Title page  i  Declaration  ii  Acknowledgements  iii  Table of Contents  iv  Summary  vi  List of Figures  vii  List of Tables  viii  Chapter 1     Background and Objectives  1  1.1 Protein import into the yeast mitochondria   1  1.2 The pathway of mitochondrial matrix protein translocation  2  1.3 The regulated cycling of Ssc1 by its interaction with Tim44  6  1.4 LID sub‐domain  9  1.5 Objective  10  Chapter 2    Study of the interaction of Tim44 N‐terminal domain and different     Ssc1 domains  11  2.1 Materials and Methods  11                   2.1.1 Media: LB broth, LB agar and M9 minimal media  11                  2.1.2 Purification and characterization of Tim44 N terminal segment  11   iv     2.1.3 Purification and characterization of Ssc1 NBD, PBD and PBD   12  LID sub‐domain                   2.1.4 Testing the interaction of Tim44N with both NBD and PBD   of Ssc1 by His‐Tag pull down method  13    2.1.5 Testing the interaction of Tim44N with both NBD and PBD   13  of Ssc1 by NMR titration method    2.1.6 NMR spectroscopy  14  2.1.7 NMR data analysis  14  2.1.8 Structure calculation  14  2.1.9 Circular dichroism spectroscopy  15  2.2 Results and Discussion  15  2.2.1 Purification of the N‐terminal domain of Tim44  15  2.2.2 Structure of the N‐terminal domain of Tim44  16  2.2.3 Purification of the NBD and PBD of Ssc1  18  2.2.4 Secondary structure of the NBD and PBD of Ssc1  19  2.2.5 Interaction of Tim44N with the NBD and PBD of Ssc1  20  2.2.6 NMR structure of LID sub‐domain in Yeast SSC1  24  Chapter 3     Conclusion and Future works  29  3.1 Conclusion  29  3.2 Future work  29  References    31  v     Summary    Ssc1 is a heat shock protein 70 in the mitochondrial matrix of yeast and is essential  for cell viability. It is recruited by Tim44 under the TIM23 channel. Ssc1 can bind to  the presequence or N‐terminal signal sequence and then dissociate from Tim44.  Although the interaction of Tim44 and Ssc1 is important for the function, how they  interact still remains unknown. In this thesis, we used NMR spectroscopy and other  biochemical and biophysical techniques to characterize the structures of Ssc1  domains and N‐terminal domain of Tim44 and study their interactions. We found  that the N‐terminal domain of Tim44 adopts a disordered structure and the  nucleotide binding domain and peptide binding domain of Ssc1 adopt well folded  structures. The peptide binding domain can be divided into two sub‐domains: BETA  and LID. We solved the three‐dimensional structure of the LID –domain by NMR.  Although it shares low sequence identity with the LID domain of E. coli heat shock  protein 70, their structures are highly similar. Interestingly, the disordered N‐terminal  domain of Tim44 interacts with both the nucleotide and peptide binding domains of  Ssc1. However, the LID sub‐domain and BETA‐domain with an extra short helix from  the LID domain could not interact with Tim44. Because the interaction significantly  reduces NMR signal intensities, we are unable to determine the exact binding sites.  On the basis of our results, we propose that the overall conformation of the full‐ length peptide binding domain is required for binding Tim44, which may involve  special orientation of the BETA and LID sub‐domains.     vi     List of Tables  Table 1  NMR data and structure determination details for LID sub‐domain in  Yeast SSC1   vii     List of Figures  Figure 1  Overview of mitochondrial protein import pathways.  Figure 2  Model of mitochondrial matrix protein translocation Figure 3  The solution structure of ADP and substrate‐bound DnaK, an Hsp70  homolog in E.coli.  Figure 4  SDS PAGE of Purified Tim44N Figure 5  Circular dichroism spectrum of Tim44N in 20 m phosphate (pH 7.0)  Figure 6  1D 1H NMR spectrum of Tim44N in 20 m phosphate (pH 7.0)  Figure 7  2D 1H‐15N HSQC NMR spectrum of Tim44N in 20 m phosphate (pH 7.0).  Figure 8  SDS PAGE of Purified Ssc1 NBD, PBD, PBDmin‐YE Figure 9  Figure 10  Circular dichroism spectra of Ssc1 NBD and PBD in 20 m phosphate   (pH 7.0)    H 1D NMR of Ssc1 PBD Figure 11  His‐Tag Pull‐down of Tim44N with NBD and PBD  Figure 12  Comparison of HSQC spectra of Tim44N in the free formand complex  form   Figure 13  Comparison of HSQC spectra of PBD in the free form  and mixture form Figure 14  Comparison of 1H‐15N HSQC spectra of PBD Lid sub‐domain in the free  form and mixture form   Figure 15  Comparison of 1H‐15N HSQC spectra of PBDmin‐YE domain: free form  and mixture form (red)  Figure 16  The stereo‐view of the superposition of 20 energy‐minimized  conformers representing the 3‐D NMR structure for LID sub‐domain in  Yeast Ssc1  Figure 17  Ribbon diagram of the lowest‐energy conformer representing the 3‐D  NMR structure of LID sub‐domain in Yeast SSC1  Figure 18  Sequence alignment for LID sub‐domain in yeast SSC1, E. Coli DNAK and  human HSP110   viii     Chapter 1   Background and Objectives    1.1 Protein import into the yeast mitochondria   Yeast  mitochondria  contain  about  800~1000  kinds  of  proteins,  but  only  a  small fractions of them are made in situ. The rest (about 99%) are encoded by  the genome in the nucleus, synthesized in the cytosolic ribosomes.[1] These  mitochondrial  proteins  are  then  recognized  by  the  receptors  on  the  outer  membrane of mitochondria, and delivered into one of the four mitochondrial  compartments:  outer  membrane,  inner  membrane,  inter  membrane  space  and the matrix. These four protein translocation pathways leading to different  destinations  are  accomplished  by  the  coordinated  actions  of  several  machineries  located  in  both  outer  and  inner  mitochondrial  membranes  (Figure  1).  The  TOM  (translocase  of  the  outer  membrane)  complex  is  the  major gateway for protein import. It recognizes the precursor mitochondrial  proteins  by  their  signal  sequences  and  then  collaborates  with  other  mitochondrial  translocases  (SAM  (sorting  and  assembly  machinery),  MIA  (mitochondrial  intermembrane  space  import  and  assembly),  TIM22  (carrier  translocase  of  the  inner  mitochondrial  membrane),  TIM23  (presequence  translocase  of  the  inner  mitochondrial  membrane),  OXA  (insert/export  machinery  of  the  inner  membrane),  PAM  (presequence  translocase  associated motor)) for further sorting and delivery. [2‐3]    1      Figure  1.  Overview  O off  mitochonddrial  protein n  import  pa athways.  Itt  is  adapted d  ffrom [3].    1.2 The patthway of mitochondriaal matrix prrotein transslocation  One important pathway to impo rt preprote eins into the e mitochon drial matrixx  involves  delicate  coo operation  oof  TOM  co omplex,  TIM23  compplex  at  the e  brane,  and  PAM  (pressequence‐asssociated  motor)  m com mplex  in  the e  innermemb matrix  (Figgure  2).[2‐3 3]  The  mattrix‐destine ed  proteins contain  aa  positively‐ charged  N‐‐terminal  signal  sequeence  (preseq quence),  fo orming  an  aamphipathicc  helix. [4] W When the prresequencee emerges aat the outlett of the TO M complexx,  it  is  recoggnized  by  Tim50,  T a  TTIM23  complex  compo onent  that  t  exposes  a  a hydrophilicc  domain  to o  the  interm membrane  space.  Tim50  then  intteracts  with h  the  intermembrane  space  domaain  of  Tim23,  leading  to  the  opeening  of  the e  TIM23  translocation  channel  aat  the  inn ner  membrrane.  [5‐6]   After  the e  presequencce enters th his channel,  it is driven by the inne er membranne potentiaal  △ψ  to  reaach  the  miitochondriaal  matrix.  The  T final  translocationn  process  iss    2  implies that the interaction may bbe not stron ng because exchange bbetween the e  bound  and d  unbound d  forms  in   an  interm mediate  NM MR  time  rregime  can n  significantlyy broaden tthe NMR siggnals. In this case, we a are unable tto use NMR R  to determin ne the binding sites.      Figure  12.  Comparison n  of  HSQC  spectra  of  Tim44N  in  the  free  foorm  (green)  and compleex form (red d). Red: HSSQC of the m mixture of  15 N‐labled TTim44N and d  unlabled PB BD (molar ratio 1:3)    We  also  trried  to  add d  un‐labeledd  Tim44N  into  15N‐lab beled  PBD.   Under  the e  condition  of  o 1:1  ratio  of  Tim4 4N  to  PBD D,  many  HSQC  peakss  from  PBD D  disappeareed (Figure 1 13). In addittion, severaal cross pea aks shifted ssignificantlyy  (Figure  13),  further  sh howing  the  interaction n  of  the  two o  proteins.  Due  to  the e  disappearance  of  maany  peaks,  we  are  cu urrently  nott  able  to  aanalyze  the e  spectra to ffind out which residuess are involvved in the biinding sites      21 1    rred: 15N‐PBD   15 g green:  N‐PB BD:Tim44N=11:1    Figure  13.  Comparison  of  HSQC  C spectra  off  PBD  in  th he  free  form m  (red)  and d  15 mixture  forrm  (green).  Green:  HS HSQC  of  thee  mixture  of  o N‐lableed  PBD  and d  unlabled Tiim44N (mollar ratio 1:11).    In  order  to o  know  if  th he  LID‐subddomain  in  PBD  P is  involved  in  the   interaction n  with  Tim44 4N,  we  carrried  out  ttitration  exxperiments  by  adding  un‐labeled d  Tim44N  intto  15N‐labelled  LID.  Diffferent  from m  PBD,  the  HSQC  specttrum of  LID D  was  not  influenced  by  Tim44N N  (Figure  even  when n  the  mol ar  ratio  of  LID:Tim44N N reached 2 2:1. The ressult shows tthat the LID D sub‐domaain does nott  interact witth Tim44N.     22 2  Green: 15N‐LID   Red: 15N‐LID: Tim m44N=1:1    Figure 14.  Comparison n of  H‐ N  HSQC specctra of PBD  Lid sub‐doomain in thee  ffree  form  (green)  ( and d  mixture  foorm  (red).  Red:  R HSQC  of  the  mixtture  of  15N‐ labled LID a and un‐labeeled Tim44N N (molar rattio 1:1).  15   In  addition n,  PBDmin‐‐YE,  a  PBD   truncated mutant  which  w lacks  the  last  3  predicted  helix  h and  exxists  as  a  m monomer  in n  high  prote ein  concenttration,  wass  found  not  to  interact  with  Tim444N  either  (Figure  ( 15).  Since  Tim444N  cannott  bind eitherr the LID subdomain o r the PBD ttruncated m mutant (whiich containss  the BETA su ub‐domain and the firsst short helix in the LID D domain), w we propose e  that  the  ovverall  confo ormation  off  full‐length  PBD  in  the e  apo‐form   is  required d  for  Tim44N N  binding,  which  w may  involve  spe ecial  orientation  of  th e  BETA  and d  LID  sub‐do omain.  Whe en  the  subbstrate  bind ds  to  the  BETA  B sub‐ddomain,  the e  conformational change e of the PBD D domain w will be trigge ered, whichh lead to the e  dissociation n  of  the  Tim m44‐Ssc1  coomplex,  an nd  cause  the  leaving  oof  Ssc1  from m    23 3  the TIM23 complex.     Grreen: 15N‐PBD Dmin‐YE   15 Re ed:  N‐PBDm min‐YE: Tim444N=1:2    Figure  15.  Comparison  of  H‐ N N  HSQC  speectra  of  PB BDmin‐YE  doomain:  freee  fform (green n) and mixtture form (rred). Red: H HSQC of the e mixture of of  15N‐labled d  PBDmin‐YEE and un‐lab beled Tim444N (molar ra atio of PBD‐‐YE:Tim44N N is 1:2)  15   of LID sub‐ddomain in Ye Yeast SSC1  2.2.6 NMR structure o ertiary fold of LID sub‐ domain, we e  In order to gain structural insightss into the te solved the solution NM MR structurre. The NMR R structure of LID sub‐ddomain wass  refined to ffinal RMSD of 0.92 ±  0.19 Å (baackbone) (Ta able 1) for  the 20 bestt  structures  (Figure  16  and  Figure   17).  The  NMR  N structu ure  of  LID  ssub‐domain n  revealed  a  monomeric  fold,  com mprising  thrree  anti‐parrallel  arrangged  helixess.  dle  structu re  is  very  similar  to o  the  LID  ssub‐domain n  This  three‐‐helix  bund structures  in  E.  coli  homologues h s  Dnak  solvved  by  NM MR  [23]  andd  X‐ray  [24]  thought thee sequence homogeneeity is very lo ow (Figure 18).    24 4  Table 1. NMR data and structure determination details for LID sub‐domain in Yeast SSC1  Parameters  a All NOE distance restraints    Intra‐residue Inter‐residue   997  261              Sequential (‫׀‬i–j‫׀‬ = 1)  313            Medium‐range ( 1 [...]... dissociation  upon    6  signal peptide addition.   (1) Domains of Ssc1 and Tim44 that participate in their interaction Tim44 can  co‐immunoprecipitate  with individual  NBD  and  PBD  of Ssc1. [16]  In  contrast,  only  the  N terminal segment  of Tim44 can  form  stable  complex  with the  full  length  Ssc1.   The  interaction between  Ssc1 and the well‐folded C terminal domain of Tim44 is very weak. [14] ... beads in 0.5mL PBS buffer. The boiled solution was analyzed by SDS‐PAGE.    2.1.5 Testing the interaction of Tim4 4N with both NBD and PBD of Ssc1 by  NMR titration method  2D  1H‐1 5N HSQC  comparison  was  used  to  confirm  the  interaction between  Tim4 4N and Ssc1 PBD and between Tim4 4N and LID sub domain.   1 5N labled  protein  was  synthesized  by  bacteria  grown  in  M9  media  with 1g/L  15NH4Cl,  and then purified according to the same protocol as the unlabled protein. 1H‐... Based on the discoveries mentioned above, we propose the following model  about the structure of the complex of Tim44 Ssc1:  The N terminal of Tim44 has its binding sites on both NBD and PBD of Ssc1,  probably in a way that the  N terminal region of Tim4 4N binds to NBD and its C terminal region binds to  PBD.  When  Ssc1 is  in  the  ATP  state  without  the  presequence  (substrate),  Tim44 can  interact ... mutation in Tim4 4N s second half region was also reported to weaken its  interaction with Ssc1. [17]  (3) Domains of Ssc1 that are required to cause the dissociation of Tim44 Ssc1 complex upon presequence addition  The binding of the signal peptide to the PBD causes quick dissociation of Tim44 Ssc1 complex. However, in the absence of the NBD, Tim44 can be  co‐immunoprecipitated with the Ssc1 PBD after signal peptide addition,  indicating that NBD is involved in this dissociation process.[16] ... His‐Tag Pull‐down of TTim4 4N with NBD (leftt) and PBD ((right). S /N N:  the superna atant after incubation  of NBD or PBD with im mmobilized  Tim4 4N via a  a His‐tag; W W1‐W3: Wa ash of the N Ni‐NTA agarrose; E: the e elution of TTim4 4N with h  its binding partners.    We  furtherr  tried  to  identify  wh ich  residue es  in  Tim44 4N are  invoolved  in  the e  interaction with PBD.  Thus  NMR R  titration ... N terminal domains of Tim44 (Tim4 4N) .  As  the  first  step,  I  aim  to  characterize  interactions  of Tm4 4N and  different  domains of Ssc1 in  this  thesis. In addition, I also aim to solve the three‐dimensional structure of the  LID  domain since  it  is  critical  for  the  function  and  understanding  of the  structural characters.          10    Chapter 2   Study of the interaction of Tim44 N terminal domain and ... Mutations of Ssc1 and Tim44 which weaken their interaction Co‐immunoprecipitation  studies  showed  Ssc1 2  (P442S  mutant  of Ssc1)   has  decreased  interaction with Tim44,   but  a  second  mutation  of Ssc1 (D519E or V524I) can restore the reduced interaction to a normal level.  These  mutated  residues  are  located  in  PBD  of Ssc1.   [16]  An  E67A  mutation in Tim4 4N s second half region was also reported to weaken its ... and an extended α‐helical LID sub domain that covers the substrate binding  site. Generally, the two domains of Hsp70 protein are closely interrelated in  function and structure. When ATP is bound to the NBD, the PBD is in the open  conformation  with high  on  and  off  substrate  binding  rates.  In  contrast,  the  ADP state of NBD corresponds to a close state of PBD with high affinity to the  substrate  and  low  on  and  off ... implies that the interaction may bbe not stron ng because exchange bbetween the e  bound  and d  unbound d  forms  in   an  interm mediate  NM MR  time  rregime  can n significantlyy broaden tthe NMR siggnals. In this case, we a are unable tto use NMR R  to determin ne the binding sites.      Figure  12.  Comparison n of HSQC  spectra  of Tim4 4N in  the  free  foorm  (green)  1 and compleex form (red... 2.2.5 Intera action of Tim m4 4N withh the NBD and PBD of S Ssc1 In  order  to o  determine e  if  Tim4 4N N  interacts  with Ssc1 PBD  and  N NBD,  His‐tagg  pull‐down eexperimentts were perfformed.  Th he results (FFigure 11) inndicate thatt  Tim4 4N intteracts with NBD and PPBD, respecttively.           S /N  W1  W2  W3  E          S /N   W1  W2  W W3   E  NBD         Tim4 4N          PBD      Tim4 4N ... 2.2.1 Purification of the N‐terminal domain of Tim44 15  2.2.2 Structure of the N‐terminal domain of Tim44 16  2.2.3 Purification of the NBD and PBD of Ssc1 18  2.2.4 Secondary structure of the NBD and PBD of Ssc1 ... biochemical and biophysical techniques to characterize the structures of Ssc1 domains and N‐terminal domain of Tim44 and study their interactions. We found  that the N‐terminal domain of Tim44 adopts a disordered structure and the  nucleotide binding domain and peptide binding domain of Ssc1 adopt well folded ... out the structure and dynamics of the complex between the full length Ssc1 and  the  N‐terminal  domains of Tim44 (Tim44N).  As  the  first  step,  I  aim  to  characterize  interactions  of Tm44N  and  different  domains of Ssc1 in  this