Khả năng chịu hạn của đậu tương rau DT 02

Cần có những nghiên cứu tích cực, cải tiến kỹ thuật… Một trong những biện pháp để nâng cao năng suất là chọn tạo các giống đậu tương rau có khả năng chịu hạn tốt.. Nhu cầu xã hội về đậu

Lời cảm ơn

Sau quá trình theo học ngành Cử nhân Sinh học, thuộc Khoa sinh-KTNN, em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, cùng toàn thể các Thầy giáo, Cô giáo đã trực tiếp cũng như gián tiếp giảng dạy, hướng dẫn khóa luận, bạn bè

đã quan tâm chỉ bảo, giúp đỡ em trong những năm học vừa qua

Và đặc biệt là sự chỉ bảo tận tình của thầy: PGS TS Nguyễn văn mã

đã giúp em hoàn thành tốt khóa luận này

Trong quá trình làm khóa luận, em đã hết sức cố gắng hoàn thành tốt nhiệm vụ được giao, nhưng do kiến thức còn nhiều hạn chế, chưa có nhiều kinh nghiệm cũng như thời gian

có hạn, khóa luận chắc chắn sẽ còn nhiều thiếu sót, em rất mong được sự chỉ bảo, giúp đỡ của các Thầy, Cô để bổ sung vào vốn kiến thức nhỏ bé của mình

Em xin gửi đến các Thầy giáo, Cô giáo với tấm lòng biết ơn chân thành nhất

Hà Nội, ngày 04 tháng 05năm 2010

Sinh viên

Nguyễn Thị Huyền

Lời cam đoan

Em xin cam đoan những nội dung được trình bày trong khóa luận này là kết quả nghiên cứu của mình dưới sự hướng dẫn từ các Thầy giáo, Cô giáo, đặc biệt là PGS.TS Nguyễn Văn Mã Các số liệu trong khóa luận là trung thực không trùng lặp với bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác đã công bố

Bảng 4 Khả năng trao đổi nớc khi gây hạn

Bảng 5 Hàm lợng prolin giai đoạn ra hoa và ra quả

Bảng 6 Hàm lợn diệp lục

Hình 1 Chiều dài rễ mầm

Hình 2 Chiều dài thân mầm

Hình 3 Hàm lợng prolin trong mầm

Hình 4 Khả năng trao đổi nớc khi gây hạn

Hình 5 Hàm lợng prolin giai đoạn ra hoa và ra quả

Phần Mở ĐầU

1 Lý do chọn đề tài

Đậu tương rau DT 02 Tên tiếng Anh: Vegetable Soybean Varieties

DT02, còn được gọi là Edamame theo tiếng Nhật, thuộc họ Đậu (Fabaceae),

bộ Đậu (Fabales), là một loại rau có hàm lượng protein cao, rất được ưa

chuộng ở nhiều nước trên thế giới Đậu tương rau có hạt to gấp đôi so với đậu tương ăn hạt thường, có vị ngọt hơn Dinh dưỡng trong đậu tương rau rất tốt cho sức khỏe và có hương vị hấp dẫn, có đủ các loại amino axit thiết yếu cho con người, đó là điều hiếm thấy ở thực vật Hàm lượng protein chiếm 40%, lipid 20%, ngoài ra còn rất giàu vitamin A, vitamin C, vitamin E, canxi, sắt, kali, và phytoestogens Các isoflavon trong protein của đậu tương rau giúp giảm cholesterol trong máu, do đó góp phần giảm nguy cơ tắc động mạch, chống ung thư, giảm bệnh tiểu đường, làm giảm chứng loãng xương [19]

Đậu tương rau là giống ngắn ngày có thể trồng cả 3 vụ (xuân, hè, thu) trồng luân canh, xen canh với các cây trồng khác nâng cao hiệu suất sử dụng

đất Đậu tương rau là mặt hàng cao cấp có giá trị xuất khẩu cao đem lại thu nhập cho người nông dân

Đã có đến 74 nước, vùng lãnh thổ trên thế giới nghiên cứu, thử nghiệm

và buôn bán đậu tương rau Tập trung chủ yếu tại Nhật Bản, Đài Loan, Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan, Mỹ Tuy nhiên ở nước ta diện tích trồng đậu tương rau còn ở quy mô nhỏ, nguồn giống chủ yếu là nhập nội nên chi phí đầu vào lớn, năng suất thấp, điều đó đã làm cho giá thành sản phẩm cao do đó chưa được người tiêu dùng biết đến nhiều và khó cạnh tranh với đậu tương rau của Trung Quốc

Để đưa đậu tương rau tiếp cận được với người tiêu dùng thì cần phải mở rộng diện tích canh tác, nâng cao năng suất, chất lượng Cần có những nghiên cứu tích cực, cải tiến kỹ thuật… Một trong những biện pháp để nâng cao năng suất là chọn tạo các giống đậu tương rau có khả năng chịu hạn tốt Vấn đề này

đã thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học, có rất nhiều nghiên cứu về khả năng chịu hạn của cây họ Đậu [2], [4], [5], [10], [11], [14], [17] Tuy nhiên, nghiên cứu về đậu tương rau vẫn còn hạn chế

Gần đây các nghiên cứu đều tập trung vào việc chọn tạo giống đậu tương rau năng suất cao [19] Nhu cầu xã hội về đậu tương rau ngày càng cao đòi hỏi phải có những nghiên cứu sâu hơn theo hướng nâng cao năng suất, chất lượng, khả năng chống chịu của giống đậu tương rau

Nghiên cứu của chúng tôi nhằm tìm hiểu sâu hơn quá trình sinh lý, sinh hóa của cây đậu tương rau trong điều kiện gây hạn nhân tạo Từ đó góp phần tạo ra giống đậu tương rau có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện khí hậu thường khô hạn ở Việt Nam

2 Mục đích nghiên cứu

- Đánh giá khả năng nảy mầm của đậu tương rau DT 02 trong dung dịch

đường

- Tác động của hạn tới khả năng chống chịu của đậu tương rau DT 02 trong

điều kiện gây hạn nhân tạo

3 Phạm vi nghiên cứu

Tiến hành xác định chỉ tiêu nghiên cứu trên đối tượng đậu tương rau trong

điều kiện phòng thí nghiệm và vườn thực nghiệm dưới ảnh hưởng của điều kiện thiếu nước

4 ý nghĩa lý luận thực tiễn

- Nhằm tìm hiểu khả năng chống chịu của cây đậu tương rau DT 02 với những tác động của hạn hán

- Cung cấp tư liệu làm cơ sở khoa học cho việc chọn tạo các giống đậu tương rau có năng suất cao và có khả năng thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới ở nước ta

Phần Nội dung

CHƯƠNG 1: TổNG QUAN TàI LIệU 1.1 Vai trò của nước đối với thực vật nói chung và đậu tương rau nói riêng và tình hình gieo trồng đậu tương rau DT 02

1.1.1 Vai trò của nước đối với thực vật nói chung và đậu tương rau nói

riêng

Nước là nhân tố quan trọng bậc nhất đối với tất cả cơ thể sống trên trái

đất Thực vật không thể sống thiếu nước Chỉ cần giảm chút ít hàm lượng nước

trong tế bào đã gây ra sự kìm hãm đáng kể những chức năng sinh lý quan

trọng như quang hợp, hô hấp từ đó ảnh hưởng tới sự sinh trưởng phát triển của

cây

Nước tham gia vào quá trình trao đổi chất của thực vật, nó là dung môi

hòa tan được nhiều chất trong tế bào và hầu hết phản ứng hóa học trong tế bào

thực vật đều xảy ra trong môi trường nước, cụ thể: nước tham gia tích cực vào

các phản ứng sinh hóa, phản ứng thủy phân, và sự hidrat hoá Ngoài ra nước

còn là yếu tố quan trọng điều hòa nhiệt của lá, giúp cho quá trình trao đổi chất

diễn ra bình thường trong điều kiện nhiệt độ cao của môi trường Một số loài

cây có những thay đổi về hình thái giải phẫu để thích ứng với môi trường thiếu

nước Phản ứng thích nghi của thực vật đối với điều kiện khô hạn có ý nghĩa lí

luật và thực tiễn rất lớn

ở nước ta, nước là một trong những yếu tố chính làm ảnh hưởng đến thời

vụ và năng suất đậu tương rau Trong suốt quá trình sinh trưởng, từ khi gieo

tới lúc thu hoạch đậu tương rau cần thiết phải cung cấp đủ nước Giai đoạn

đầu, đất đủ ẩm thì hạt mới nảy mầm được Độ ẩm của đất khoảng 50% là

thích hợp, nếu thấp quá hạt không thể nảy mầm, nếu đất ướt quá sẽ làm thiếu

không khí, hạt cũng không nảy mầm và bị thối Nhu cầu về nước tăng dần

theo thời gian sinh trưởng của cây và thay đổi theo điều kiện thời tiết khí hậu,

đất đai và kỹ thuật canh tác Việc cung cấp nước cho thực vật nói chung và tương rau nói riêng đặc biệt quan trọng ở giai đoạn ra hoa, ra quả Hai giai

đoạn này nếu bị thiếu nước hoa có thể rụng, làm giảm số quả Nếu hạn kéo dài

sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới năng suất cây trồng ở giai đoạn quả vào mẩy,

đậu tương rau cần nhiều nước nhất, vì thế nếu gặp hạn vào lúc này năng suất

sẽ giảm mạnh hơn so với các giai đoạn trước đó

Mặc dù là rất cần nước như vậy nhưng đậu tương rau vẫn có khả năng chịu được hạn trong một thời gian nhất định Tuy nhiên muốn đạt năng suất cao cần đảm bảo thường xuyên cho cây đủ ẩm Nếu gặp hạn hán, đặc biệt vào các giai đoạn quan trọng thì phải tìm mọi cách khắc phục để đảm bảo năng suất ổn định

1.1.2 Tình hình gieo trồng đậu tương rau

Hội nghị đậu tương rau quốc tế II tổ chức tại Washington ngày 10- 12/8/2001 đã khẳng định: “ Có thể cải thiện chế độ dinh dưỡng con người, nâng cao thu nhập cho người nông dân, thúc đẩy công ăn việc làm và nghành nghề nông thôn’’ [19] Đậu tương rau có thời gian sinh trưởng ngắn, thích hợp

sắp xếp hệ thống cơ cấu cây trồng trong năm và duy trì độ màu mỡ của đất

Trên thế giới đã có tới 74 nước và vùng lãnh thổ nghiên cứu, thử nghiệm

và buôn bán đậu tương rau, tập trung chủ yếu tại Nhật Bản, Đài Loan, Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan, Mỹ Diện tích trồng đậu tương rau của Trung Quốc năm 2004 là 28.000 ha với sản lượng là 1,5-1,8 triệu tấn Tại Nhật Bản diện tích trồng đậu tương rau là 14.400 ha, sản lượng 100.000 tấn, tiêu thụ

đậu tương rau là 160.000 tấn Đài Loan hàng năm sản xuất 120.000 tấn, 80% dùng cho xuất khẩu với kinh ngạch 80 triệu USD/năm Tại Mỹ nhập khẩu đậu tương rau 300-500 tấn/năm trong thập kỷ 80 đã lên tới 10.000 tấn vào năm 2001

và năm 2005 là 25.000 tấn, kinh ngạch 100 triệu USD/năm [19]

Việt Nam cũng có nhiều vùng sinh thái và mùa vụ thích hợp trồng đậu tương rau cho hiệu quả kinh tế cao, với thời gian trung bình 80- 90 ngày, năng

suất 8 tấn/ha Trong những năm gần đây, vùng đồng bằng sông Hồng và các tỉnh phía Bắc đã phát huy lợi thế của vụ đông ấm, nhiều chủng loại rau được sản xuất, xuất khẩu sang Trung Quốc và thị trường khác với lợi thế cạnh tranh cao Đậu tương rau trở nên một mặt hàng có giá trị kinh tế cao, đã được bạn hàng đặt mua và kí kết hợp đồng Thấy rõ giá trị của đậu tương rau các cơ quan nghiên cứu của Bộ NN- PTNT đã có nhiều nghiên cứu về nó Từ năm

1990 đến nay, một số Viện phối hợp với Trung tâm Nghiên cứu Rau màu Châu Á (AVRDC) đã tiến hành nghiên cứu khảo nghiệm và tuyển chọn tập

đoàn đậu tương rau gồm 20 giống, kết quả năm 1999 đã được Bộ NN-PTNN công nhận một giống tạm thời là AGS 346 năng suất trong thí nghiệm đạt 12- 13,5 tấn/ha Nhược điểm của giống này là quả nhỏ, chịu nhiệt kém, chỉ sản xuất được vào vụ đông với năng suất thấp, dễ mất sức nảy mầm, khó để giống Vì vậy cho tới nay, đậu tương rau mới được trồng tại Việt Nam với quy mô nhỏ Diện tích trồng đậu tương rau ở các tỉnh phía Bắc mới chỉ dừng ở mức thử nghiệm một vài ha/năm, ở An Giang, Đà Lạt chỉ có 200 ha/năm, chủ yếu phục vụ xuất khẩu, giống chủ lực là những giống nhập nội giá thành cao, năng suất thấp, sản phẩm thu được bán với giá đắt đỏ nên chưa được người tiêu dùng biết đến Sản phẩm xuất khẩu giá thành cao nên khó cạnh tranh với đậu tương rau từ Trung Quốc Vì vậy để giải quyết khó khăn đưa ngành đậu tương rau của Việt Nam phát triển, rất cần thiết phải có các nghiên cứu về giống, cải thiện quy trình canh tác, nâng cao năng suất, chất lượng sản phẩm, chế biến, bảo quản, phát triển đa dạng các sản phẩm từ đậu tương rau 1.2 Hạn hán và tình hình nghiên cứu tính chịu hạn của cây họ Đậu nói chung và đậu tương rau DT 02 nói riêng

1.2.1 Hạn hán

Hạn đối với thực vật là sự thiếu nước của cây do môi trường gây nên

trong suốt quá trình hay trong từng giai đoạn làm ảnh hưởng tới sinh trưởng

phát triển Có hai loại hạn : Hạn trong đất và hạn không khí

Hạn trong đất thường xảy ra ở những vùng có điều kiện khí hậu, địa hình,

địa chất và thổ nhưỡng đặc thù Các yếu tố này chi phối mạnh mẽ mực nước ngầm và khả năng giữ nước của đất Mức độ khô hạn của đất tùy thuộc và sự bốc hơi nước trên bề mặt và khả năng giữ nước của đất Hạn trong đất làm cho

áp suất thẩm thấu của đất tăng lên đến mức cây không cạnh tranh được nước của đất để lấy nước vào cơ thể qua rễ Chính vì vậy, hạn đất thường gây ra hiện tượng héo lâu dài

Hạn không khí do độ ẩm quá thấp gây nên, hoặc cũng có thể do nhiệt độ cao, gió mạnh làm gia tăng gradient hơi nước giữa không gian bên dưới khí khổng và không gian ngay bên ngoài lá, thoát hơi nước tăng nhanh gây nên sự mất cân bằng nước trong mô cây

Nhiều khi hai hình thức hạn trên lại đồng thời xảy ra, gây nhiều tai họa cho cây trồng, cây không chỉ mất nước do thoát hơi nước ở lá tăng nhanh, mà

sự hút nước ở rễ cũng không thể diễn ra, do lượng nước trong đất cạn kiệt Thường thì ban ngày dưới ánh nắng mặt trời, cây thoát nhiều nước khiến

rễ không cung cấp nước kịp gây ra sự thiếu nước, nếu trong đất còn đủ nước thì sau một đêm sự cân bằng nước trong cây lại được phục hồi Trường hợp nếu trong đất thiếu nước thì sự thiếu hụt nước ban ngày tiếp tục sẽ dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng

Hạn hán trước tiên làm cho cây trồng thay đổi về hình thái: các mô mất sức căng, cây bị héo, sau đó gây ra những biến đổi bên trong tế bào, giảm lượng nước tự do, tăng nồng độ dịch bào, thay đổi tính thấm của màng tế bào, khả năng hút các chất khoáng của tế bào rễ bị giảm sút, hoạt động của enzim thủy phân tăng mạnh, sự tổng hợp ADN bị ngừng trệ và tăng cường sự phân giải axit nucleic Nhiều khi các phản ứng phân giải xảy ra trong kiều kiện thiếu oxy do lỗ khí đóng, dẫn tới việc hình thành nhiều sản phẩm độc như axit lactic, etanol, axetaldehyt…, và tế bào giảm khả năng tích lũy ATP

Các loài thực vật trải qua quá trình tiến hóa đã hình thành được những nhu

cầu xác định đối với môi trường sống, đồng thời mỗi cơ thể thực vật cũng tạo

được những khả năng thích nghi đối với các tác nhân của môi trường biến đổi, các tính chất này được củng cố và di truyền lại cho thế hệ sau Khả năng thích nghi của thực vật được thể hiện qua sự biến đổi cấu trúc và trao đổi chất phù hợp với điều kiện sống thay đổi Môi trường sống khô hạn đã làm cho các loài thực vật có nhiều biến đổi phù hợp với điều kiện mất nước như về hình thái: lá nhỏ hơn kích thước tế bào nhỏ hơn, số lượng khí khổng và gân lá tăng lên, kích thước khí khổng nhỏ, các loại mô phát triển Về sinh lý sự hình thành phức hệ protein- lipit trong chất nguyên sinh đã làm tăng khả năng giữ nước của tế bào, áp suất thẩm thấu của dịch bào tăng lên, giữ vững hệ thống tổng hợp protit đặc biệt là pilixom, tăng quá trình tạo ATP… Những cây trồng có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất tương đối ổn định trong điều

kiện khô hạn được gọi là cây chịu hạn và khả năng thực vật có thể giảm thiểu mức độ tổn thương do thiếu hụt nước gây ra gọi là tính chịu hạn

1.2.2 Tình hình nghiên cứu tính chịu hạn của cây họ Đậu nói chung và

đậu tương rau DT 02 nói riêng

Ngày nay sự thiếu hụt nước không những chỉ do các điều kiện khí hậu,

đất đai mà còn do con người sử dụng trong công nghiệp và hoạt động sống của mình, điều này gây khó khăn rất lớn cho việc đảm bảo năng suất cây trồng Trong khi đó, hạn hán chỉ một thời gian ngắn cũng đã để lại những hậu quả không lường hết được đối với cây trồng Do vậy đi đôi với việc điều chỉnh nước cho cây trồng bằng các phương tiện kỹ thuật tưới tiêu, cần thiết phải nghiên cứu sử dụng và tạo ra các giống cây trồng có khả năng chịu hạn cao Khả năng của cây vượt qua stress về thiếu nước càng lớn khi chúng có thể chống lại sự mất nước mà không để lại hậu quả xấu do chất nguyên sinh mất nước Những cây có khả năng chịu hạn thường có đặc tính giữ nước cao Tuy nhiên, điều nay cũng không phải tuyệt đối đúng, một số cây tuy khả năng giữ nước yếu song lại có thể hút nước mạnh từ các lớp đất sâu nên cũng ít bị

tổn hại khi mất nhiều nước Đặc tính hút nước phục hồi sức trương của tế bào

là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá khả năng chống chịu hạn hay mối quan

hệ giữa lượng nước dự trữ và áp suất trong mạch dẫn của lá

Nhu cầu về nước thường biến đổi theo quá trình sinh trưởng, vì thế biểu

hiện khả năng chống chịu hạn ở những thời điểm sinh trưởng khác nhau cũng

rất đa dạng, trong đó thời điểm hạt nảy mầm, ra hoa, ra quả cây thường rất

mẫn cảm đối với sự thiếu hụt nước Cũng chính vì thế, việc nghiên cứu khả

năng chịu hạn trong các thời điểm sinh trưởng nêu trên là hết sức cần thiết

[11], [12]

Trong tự nhiên hạt thường nảy mầm trong điều kiện khô hạn nên những

biểu hiện của hạt lúc này ảnh hưởng rất sâu sắc đến toàn bộ quá trình sinh

trưởng tiếp theo Vì thế nghiên cứu tìm hiểu bản chất tính chịu hạn và tác

động lên các quá trình sinh lý, trao đổi chất liên quan đến khả năng chịu hạn ở

thời kỳ hạt nảy mầm thường cho những thông tin khá rõ về khả năng chịu hạn

của cây [2],[4],[7] Ngoài ra nên đánh giá khả năng chịu hạn của cây trong

điều kiện thiếu nước, vì khả năng này thể hiện rõ nét trong hoàn cảnh cụ thể

ấy, bằng cách bố trí gây hạn nhân tạo rồi tiến hành đánh giá khả năng chịu

hạn của cây trồng nhờ vào sự thay đổi của một số chỉ tiêu như chế độ nước,

hàm lượng sắc tố, thành phần protein trước và sau khi gây hạn[2],[5], [12] Những năm gần đây các nghiên cứu về cây họ Đậu nói chung và đậu

tương rau nói riêng đã đi vào nhiều khía cạnh khác nhau Nguyễn Huy

Hoàng[7] đã nghiên cứu mối quan hệ giữa khả năng chịu hạn và một số đặc

tính giải phẫu hình thái lá, thời gian sinh trưởng , diện tích lá…Phạm Đình

Thái [18], Nguyễn Văn Mã [11] đã nghiên cứu tác động của phân vi lượng tới

một số chỉ tiêu trao đổi nước của cây lạc và cây đậu tương Điêu Mai Hoa và

CS [5] cũng nghiên cứu về vấn đề này ở đậu xanh Trần Thị Phương Liên và

CS [9] đã nghiên cứu mối quan hệ tính chịu hạn với thành phần điện di

protein…Tại Viện DTNN, trong 6 năm vừa qua, để đáp ứng nhu cầu của sản

xuất, hợp đồng của các doanh nghiệp về giống đậu tương rau cho sản xuất nội tiêu và xuất khẩu, Trung tâm Tư vấn và Chuyển giao công nghệ - Viện Di truyền Nông nghiệp đã có nhiều cố gắng nghiên cứu chọn tạo giống và hoàn thiện quy trình canh tác đậu tương Một số giống đậu tương rau mới chịu nhiệt, năng suất khá, thích ứng rộng, chất lượng tốt đã được nghiên cứu và đưa vào trồng thử nghiệm [19]

1.3 Axit amin prolin và vai trò của nó đối với tính chống chịu

Về khả năng chịu hạn của thực vật nói chung, nó có nhiều cơ chế giúp thực vật tăng cường tính chịu hạn như giảm diện tích lá và rút ngắn thời gian sinh trưởng, khả năng xuyên sâu lan rộng của hệ rễ để tìm nguồn nước, điều chỉnh áp suất thẩm thấu…, trong các công trình nghiên cứu tìm hiểu về cơ chế chịu hạn có nhiều công trình bàn đến vai trò của axit absicisic ( ABA ) [22] và vai trò của prolin [21], [22], [23] đối với khả năng chịu hạn của thực vật nói chung và cây họ Đậu nói riêng Nhìn chung, khi tế bào bị mất nước dần dần, chất hoà tan được tích lũy trong tế bào chất nhằm chống lại việc giảm tiềm năng nước và khả năng giữ nước của nguyên sinh chất

Prolin được tổng hợp từ Glutamin bởi enzim chìa khoá ( Key enzyme ) là deltal-pyroline-5- cacboxylat-Synthetase (P5CS) Prolin là thành phần chủ yếu trong cấu trúc của nhóm phân tử được biết đến như một tác nhân cạnh tranh thẩm thấu thuộc nhóm các axit amin tự do, những hợp chất amin bậc 4 và hợp chất hữu cơ lưu huỳnh bậc 3 [20], [25] Những chất này trung tính (pH = 7),

đóng vai trò chủ đạo trong sự thích ứng thẩm thấu của tế bào chất ở thực vật nhằm phản ứng với áp lực thẩm thấu

Sự tích lũy prolin và tập trung axit absicisic trong mô phân sinh đỉnh là một phản ứng chuyển hoá thông thường của thực vật bậc cao nhằm phản ứng lại sự thiếu hụt nước và áp lực muối cao Sự tập trung ABA còn dẫn tới sự tăng hàm lượng axit amin hòa tan trong lá của những loài thực vật sống ở nơi

có nồng độ muối cao Trong mô lá, mô phân sinh chồi của thực vật chịu áp lực

nước, vùng đỉnh rễ của thực vật là nơi có thế năng nước thấp và những tế bào thực vật được nuôi cấy treo trong môi trường áp suất thẩm thấu cao cũng thấy hiện tượng tương tự [20]

Nghiên cứu của Nanjo và cộng sự cho thấy: Những cây đột biến về hình dạng (có sự bất bình thường về biểu bì, tế bào mô mềm và hệ mạch) có hàm lượng P5CS thấp rất mẫn cảm với áp lực thẩm thấu Nhưng những biến đổi kiểu hình đó có thể ức chế bằng sự tăng cường L prolin ngoại bào

Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng sự thiếu hụt prolin ảnh hưởng lên cấu trúc của thành tế bào Prolin không chỉ là nhân tố chính bảo vệ thành tế bào và protein chống lại ảnh hưởng có hại bởi nồng độ cao và prolin ảnh hưởng gián tiếp lên sự tích lũy các chất hòa tan làm tăng thế năng thẩm thấu của tế bào

Sự tăng cường nồng độ của prolin trong cây chịu áp lực thẩm thấu có liên quan đến sự ức chế oxy hóa và thủy phân prolin hoặc do sự tăng cường khả năng tổng hợp prolin nhanh chóng ở thực vật

Những nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen với tính chống chịu các điều kiện bất lợi về nước đang tập trung vào nhóm gen thuộc chu trình tổng hợp prolin Các gen này mã hóa cho enzyme P5CS và P5CR (enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp prolin) đã được Kishor [22] chuyển thành công vào thuốc lá và nhận thấy kết quả tốt Lượng prolin tăng từ 8 đến 10 lần so với đối chứng

Bên cạnh đó có nhiều công trình nghiên cứu khác: Mối tương quan giữa hàm lượng prolin và tính chống chịu ở cây lúa của Nguyễn Hữu Cường và CS [1] Sự biến đổi hàm lượng axit amin prolin trong mầm và trong lá đậu xanh [4] ảnh hưởng của Mannitol đến tích lũy prolin và glucozo liên quan đến khả năng điều chỉnh thẩm thấu trong nuôi cấy mô sẹo cà chua [16]

Sự tăng cường hàm lượng prolin của thực vật chịu áp lực cao của nước không chỉ được sử dụng như một chỉ số của khả năng chịu hạn Mà nó còn là yếu tố chỉ định tốt cho thực vật sống trong môi trường khô hạn

CHƯƠNG 2: ĐốI TƯợNG Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên giống đậu tương rau DT 02 do Viện di truyền Nông nghiệp cung cấp được tuyển chọn từ nguồn gen nhập nội

có thời gian sinh trưởng từ 70 - 80 ngày cho thu quả non và từ 95- 100 ngày thu quả già Thời gian tiến hành thí nghiệm: Vụ xuân hè tháng 03/2009

2.2 Phương pháp thí nghiệm

2.2.1 Cách bố trí thí nghiệm

* Thí nghiệm 1: Thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật

Chọn hạt giống vừa được gieo trồng và thu hoạch trên cùng một nền đất thí nghiệm Gieo hạt trên khay được tưới bằng dung dịch đường theo phương pháp xác định khả năng chịu hạn của Volcova [26] : chọn hạt giống đều, khoẻ, có phôi sáng, không sâu mọt, không nấm mốc Khử trùng khay gieo bằng cồn, hạt được khử trùng bằng dung dịch KMnO4 1% Hạt sinh trưởng trong dung dịch đường dễ nhiễm nấm nên cần cho thêm kháng sinh nistatin 1/2 viên trong 1/2 lít

Sau đó chia hạt thành 2 phần gieo trên khay có giấy thấm: phần 1 được tưới bằng nước cất (lô đối chứng), phần 2 được tưới bằng dung dịch đường (lô thí nghiệm) Dung dịch saccarozơ cho hạt nảy mầm được chuẩn bị ở nồng độ 86,6 g/l tương đương với áp suất thẩm thấu 7 atmosphere (atm) Hàng ngày bổ sung lượng nước hoặc dung dịch đường tương ứng 40ml/1khay Thí nghiệm

được tiến hành trong 8 ngày

* Thí nghiệm 2 : Thực hiện tại khu thí nghiệm nhà lưới khoa Sinh - KTNN,

trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Gieo hạt đậu tương rau DT 02 vào các chậu, kích thước chậu: cao 45cm,

đường kính 35cm, giống được trồng trong 18 chậu, đến giai đoạn cây non chỉ

để lại 6 cây trong mỗi chậu, đảm bảo lượng đất, lượng phân bón, chế độ tưới tiêu nước, chế độ chăm sóc đồng đều giữa các chậu thí nghiệm theo kỹ thuật

thông thường sau đó chia số chậu thành 3 phần: phần 1 dùng làm lô đối chứng (được tưới đủ nước), phần 2 dùng làm lô gây hạn vào thời kì ra hoa, phần 3 tiếp tục được chăm sóc bình thường cho đến thời kì ra quả non thì tiến hành gây hạn Chúng tôi theo dõi sự biến động hàm lượng prolin, hàm lượng diệp lục, khả năng trao đổi nước ở hai thời kỳ trên

Phương pháp gây hạn: Gây hạn được tiến hành trong chậu, lô đối chứng vẫn được tưới nước bình thường và lô gây hạn không được tưới nước và che bằng nilon trắng sao cho ánh sáng vào được nhưng mưa không vào được, đến khi 2 lá dưới cùng có triệu chứng héo

Cách lấy mẫu : Trong quá trình gây hạn tiến hành thu mẫu lá và rễ,

vào buổi sáng 8giờ (thu lá thứ 3 tính từ đỉnh sinh trưởng, đây là lá trưởng thành của cây thực hiện đầy đủ các chức năng quang hợp, sinh tổng hợp và chuyển hóa các chất cho cây ) Cho ngay mẫu đã lấy vào túi nilon buộc kín và mang tới phòng thí nghiệm để phân tích các chỉ tiêu

2.2.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu

* Lí thuyết của máy đo quang phổ (Spectrophotometer)

Những hợp chất có màu là do trong phân tử chứa các nhóm mang màu đó

là các liên kết đôi, các liên kết ba như: C=C, C=O, C=N, N=N, CC, CN,

và nhóm trợ màu là các hệ liên hợp

Theo thuyết MO - Huckel (thuyết obitan phân tử - Theory of Molecular Orbitale): liên kết trong nhóm mang màu là kết quả của sự phân bố các electron vào các MO Phân tử sẽ hấp thụ photon có năng lượng Ep chuyển lên trạng thái kích thích:

electron của phân tử tức là phân tử chỉ hấp thụ tia sáng có bước sóng xác định,

đặc trưng cho phân tử

Khi đưa một dải photon trong vùng phổ tử ngoại khả kiến UV (Ultraviolet - visible spestre, UV-VIS) qua dung dịch chiết, sẽ cho ta một phổ UV-VIS đặc trưng cho cấu trúc của phân tử Do đó có thể sử dụng phổ UV-VIS để nghiên cứu về cấu trúc phân tử hữu cơ nói chung và các hợp chất màu nói riêng Dựa vào phổ UV của phân tử ta có thể biết bước sóng hấp thụ đặc trưng của phân tử đó tương ứng với các pick trên phổ UV Theo những nghiên cứu cho thấy phân tử prolin hấp thụ tia sáng có bước sóng 520 nm

- Nguyên tắc hoạt động của máy đo quang phổ (Spectrophotometer)

Nguồn sáng Bộ tách sóng Cuvet mẫu Bộ phân tích Bộ phận in

- Mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ dung dịch:

Dựa vào định luật Lambert-Beer:

Từ (*) ta thấy với d,   không đổi thì giá trị của D phụ thuộc vào nồng

độ C của dung dịch và bước sóng  khi đó (*) viết dưới dạng:

D= f( ), D=f(C)

2.2.2.1 Các chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh của giai đoạn nảy mầm

- Xác định tỷ lệ nảy mầm của hạt

Những hạt nảy mầm là hạt có chiều dài rễ đạt từ 3mm trở lên, tỷ lệ nảy

Trong đó:

P Khả năng nảy mầm của hạt

a Số hạt nảy mầm trong lô thí nghiệm

b Số hạt nảy mầm trong lô đối chứng

- Khả năng sinh trưởng của mầm

Chiều dài thân mầm (mm): Dùng thước chia đến mili mét để đo, đo chiều dài thân mầm từ cổ rễ tới chồi mầm Thời gian đo vào các ngày thứ 2, thứ 4, thứ 6, thứ 8 Tính từ ngày bắt đầu gieo 1 ngày

Chiều dài rễ mầm (mm): Dùng thước chia đến mili mét để đo, đo chiều dài rễ mầm từ cổ rễ đến chóp rễ Thời gian đo vào các ngày thứ 2, thứ 4, thứ 6, thứ 8 Tính từ ngày bắt đầu gieo 1 ngày

Khối lượng khô của mầm (mg/mầm): Rửa mầm bằng nước cất, sau đó sấy trong 3 giờ ở nhiệt độ 1050C Cân khối lượng khô vào ngày thứ 8

Khối lượng tươi của mầm (mg/mầm): Cân khối lượng tươi của mầm vào ngày thứ 8

Cân khối lượng khô, khối lượng tươi của mầm trên cân Sartorius

- Hàm lượng prolin theo phương pháp của Bates (1973) và cải tiến của

Đinh Thị Phòng (2001) [15]

Cân 0,5g mẫu nghiền kĩ, thêm 10 ml dung dịch axit sulfosalicylic 3%, ly tâm 7000 vòng/phút trong thời gian 20 phút, lọc lấy dịch lọc Lấy 2 ml dịch chiết cho vào bình, thêm 2 ml axit axetic và 2 ml dung dịch ninhydrin, ủ trong nước nóng 1000C trong thời gian 1 giờ sau đó ủ nước đá 5 phút Bổ sung vào bình phản ứng 4 ml toluen, lắc đều Lấy phần dịch màu hồng ở trên đem đo mật độ quang học (OD - Optical density) ở bước sóng  = 520 nm trên máy

UV-Visible-Spectrophotometer, UV-2450 do hãng SHIMADZU – Nhật sản xuất Hàm lượng axit amin prolin được tính theo công thức (công thức được suy ra từ việc lập đường chuẩn prolin):

Y = 1,4083 X + 0,014 Trong đó:

Y: hàm lượng prolin (mg/l)

X: giá trị OD đo được ở bước sóng  = 520 nm

Sau đó đổi ra mg/g theo công thức

1000

P

V Y

 =520nm

2.2.2.2 Các chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh giai đoạn cây ra hoa và ra quả

- Xác định hàm lượng prolin ở lá và rễ Cách tiến hành như ở giai đoạn nảy mầm

- Hàm lượng diệp lục tổng số của lá được xác định theo Nguyễn Duy Minh và Nguyễn như Khanh bằng phương pháp quang phổ theo phương trình của Mac – Kinney [13]

Nghiền 0,5g mẫu cho vào cối 1ml axeton 80%, thêm một ít bột CaCO3 và nghiền Thêm 5ml axeton tiếp tục nghiền Chuyển dịch nghiền vào phểu lọc xốp gắn với bình bun xen nối bình với máy hút chân không và hút Đổ 2ml axeton để tráng phễu Tiếp tục hút cho tới khi giọt axeton nhỏ xuống không

còn màu xanh Cho dung dịch vào bình định mức khác 10ml, đưa đến thể tích của bình

.

P

V C

Cân lá ngay sau khi hái, để héo sau 3- 4 giờ Điều kiện làm héo có thể

để ngoài không khí, sau thời gian đó cân lại mẫu, tiếp tục sấy khô ở nhiệt độ

1050C để xác định khối lượng khô của mẫu

Khi đó, lượng nước giữ được của lá khi bị héo được tính bằng phần trăm

so với tổng lượng nước theo công thức:

%100

V b

Trong đó:

K: khả năng giữ nước của lá

b : số lượng lá tươi sau khi héo

B : khối lượng lá tươi ban đầu

V: khối lượng khô của lá

+ Khả năng hút nước

Lấy lá cho hút nước trong 3 giờ cho tới khi bão hòa, lau lá bằng giấy thấm phần cuống lá, đem cân ta được khối lượng lá bão hòa nước Sau đó để héo rồi đưa vào cốc cho lá hút nước trong 3 giờ lau cuống lá, cân khối lượng Mức độ giảm sút khối lượng là lượng nước lá không thể hút sau thời gian để héo do bị tổn thương

Lượng nước không hút được của lá được tính bằng phần trăm so với khối lượng lá tươi bão hòa nước theo công thức:

%1001

Trong đó:

a : khả năng hút nước của lá

A1 : khối lượng tươi của lá sau lần bão hòa nước đầu tiên

A2 : khối lượng tươi của lá bão hòa nước sau khi bị héo

+ Độ hụt nước “còn lại”

Cân lá sau khi hái, sau đó cho vào hút nước, cắm cuống lá trong cốc miệng cốc đậy kín trong 3 giờ sau đó đem cân Mức độ gia tăng khối lượng là

do bão hòa nước tương đương với khối lượng nước thiếu trong một đêm

Độ hụt nước “còn lại” được tính bằng phần trăm của lượng nước còn thiếu hụt so với khối lượng lá tươi bão hòa nước, theo công thức:

  100%

A

B A

Trong đó:

d : độ hụt nước “còn lại”

A: khối lượng tươi của lá bão hòa nước

B: khối lượng tươi ban đầu của lá

2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả thí nghiệm được tổng hợp và xử lý bằng phần mềm Microsoft

Office Excel 2003 Theo các tham số: trung bình số học ( X ), độ lệch chuẩn

( ), sai số trung bình (m), hệ số biến động (CV), độ chính xác của thí nghiệm (m%), tiêu chuẩn độ tin của hiệu (t d)

1

N i i

X X

m



CHƯƠNG 3: KếT QUả Và THảO LUậN 3.1 Đánh giá khả năng nảy mầm của đậu tương rau DT 02 trong điều kiện phòng thí nghiệm

Một trong những bước quan trọng của quá trình chọn giống là đánh giá ban đầu về khả năng chịu hạn của giống, dòng để tạo vật liệu khởi đầu cho quá trình này Khả năng thực vật sử dụng nước ở những giai đoạn đầu tiên của quá trình phát triển cá thể trong điều kiện thiếu nước và nồng độ dịch môi trường cao là những dấu hiệu sinh học, nông học vô cùng quý giá Trong giai

đoạn này thực vật rất mẫn cảm với sự thiếu nước Vì thế để khảo sát khả năng chịu hạn của các mẫu giống khác nhau, người ta đã cho chúng nảy mầm trong dung dịch sacaroza Giống nảy mầm được là do chúng tạo được sức hút nước lớn hơn lực hút của môi trường Tỷ lệ nảy mầm cao sẽ phản ánh được khả năng giống có thể sử dụng một lượng nước ít ỏi từ môi trường và do đó nói lên khả năng chịu hạn của chúng

3.1.1 Sự nảy mầm của hạt đậu tương rau DT 02 trong dung dịch sacaroza