Dinh dưỡng ở vi sinh vật

các chất hữu cơ như cao nấm men, cao thịt, dịch đun động thực vật nhộng, giá đỗ… là có thể đáp ứng được nhu cầu về nhân tố sinh trưởng.Nhân tố sinh trưởng đối với một loại vi sinh vật nà

Nội dung chuyên đề: Dinh dưỡng ở vi sinh vật Người viết: Ngô Thị Phương Thanh – Chuyên Yên Bái.

I Các chất dinh dưỡng của vi sinh vật

1 Các chất dinh dưỡng cần thiết

1.1 Nguyên tố đa lượng

C, H, O, N, P, S và K Các nguyên tố này có mặt trong tất cả các hợp chất (như protein, axit nucleic…) cấu tạo nên tế bào, cơ thể vi sinh vật Riêng các nguyên tố C, H, O, N chiếm tới 90% đến 96% toàn bộ chất khô của tế bào

1.2 Nguyên tố vi lượng

Gồm các nguyên tố mà vi sinh vật cần với hàm lượng rất nhỏ nhưng không thể thiếu cho sự tăng trưởng, sinh sản của vi sinh vật Các nguyên tố đó tham gia vào cấu tạo enzim, hoạt hóa enzim…đóng vai trò quan trọng trong các quá trình chuyển hóa Ví dụ như: Mo, Mn

Lượng các nguyên tố cần ở các vi sinh vật khác nhau là không giống nhau Trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau, tương ứng với các giai đoạn phát triển khác nhau, lượng các nguyên tố cần trong cùng một loài vi sinh vật cũng không giống nhau

1.3 Nhu cầu về chất sinh trưởng của vi sinh vật

Một số vi sinh vật muốn phát triển cần phải được cung cấp những chất sinh trưởng nhất định gọi là nhân tố sinh trưởng Nhân tố sinh trưởng là những chất hữu

cơ cần thiết cho hoạt động sống của một loài vi sinh vật nào đó mà chúng không tự tổng hợp được từ các chất khác Như vậy những chất được coi là nhân tố sinh trưởng của loại vi sinh vật này hoàn toàn có thể không phải là nhân tố sinh trưởng đối với một loại vi sinh vật khác

Vi sinh vật tự dưỡng và một số vi sinh vật dị dưỡng (như Escherichia coli)

thậm chí có thể sinh trưởng mà không cần bất kỳ nhân tố sinh trưởng nào Mặt khác, cùng một loài vi sinh vật nhưng nhu cầu đối với nhân tố sinh trưởng cũng

thay đổi tuỳ theo điều kiện môi trường Ví dụ Mucor rouxii khi sinh trưởng trong

điều kiện kị khí thì cần thiamin (B1) và biotin (H), nhưng trong điều kiện hiếu khí thì lại tự tổng hợp được các vitamin này Thông thường, bổ sung vào môi trường

các chất hữu cơ như cao nấm men, cao thịt, dịch đun động thực vật (nhộng, giá đỗ…) là có thể đáp ứng được nhu cầu về nhân tố sinh trưởng.

Nhân tố sinh trưởng đối với một loại vi sinh vật nào đó có thể là một trong các chất sau đây: các gốc kiềm purin, pirimidin và các dẫn xuất của chúng, các axit béo và các thành phần của màng tế bào, các vitamin thông thường

Câu hỏi vận dụng Câu 1: Nêu khái niệm vi sinh vật nguyên dưỡng, vi sinh vật khuyết dưỡng Làm

thế nào để nhận ra được vi sinh vật khuyết dưỡng Hiểu về vi sinh vật khuyết dưỡng có ứng dụng gì trong thực tiễn

Trả lời:

- Khái niệm

+ Vi sinh vật nguyên dưỡng là vi sinh vật có khả năng tự tổng hợp các nhân tố sinh trưởng cho chu kỳ sống của chúng

+ Vi sinh vật khuyết dưỡng là vi sinh vật không có khả năng tổng hợp được nhân

tố sinh trưởng (1 hoặc nhiều) cho chu trình sống của chúng

- Phương pháp

+ Tạo các môi trường nuôi cấy trong đó mỗi môi trường nuôi cấy thiếu một nhân

tố sinh trưởng Ở những môi trường nuôi cấy mà không thấy xuất hiện khuẩn lạc của vi sinh vật thì sẽ biết được vi sinh vật khuyết dưỡng về nhân tố sinh trưởng đó

Câu 2 Nuôi vi khuẩn lactic trên các môi trường tổng hợp khác nhau chứa một

dung dịch cơ sở (CS), rồi bổ sung thêm các thành phần, người ta thu được các kết quả sau:

Môi trường 1: CS + axit folic + piridoxin: không mọc

Môi trường 2: CS + riboflavin + piridoxin: không mọc

Môi trường 3: CS + axit folic + riboflavin + piridoxin: mọc

Môi trường 4: CS + axit folic + riboflavin: không mọc

a.Cho biết các chất thêm vào môi trường cơ sở có vai trò như thế nào với vi khuẩn

lactic?

b Người ta muốn định lượng hàm lượng axit folic trong cao nấm men bằng cách

sử dụng chủng vi khuẩn trên Có thể sử dụng môi trường nào?

Câu 3 Để nghiên cứu tác động của tryptophan lên sinh trưởng của vi trùng thương

hàn, người ta cấy song song dịch huyền phù vi sinh vật này lên môi trường dinh dưỡng không chứa tryptophan và môi trường dinh dưỡng có chứa 30mg/l tryptophan Sau 24 giờ nuôi ở nhiệt độ phù hợp người ta chỉ thấy có sự sinh trưởng của vi khuẩn trên môi trường có chứa tryptophan

a Tryptophan là loại hợp chất gì đối với trùng thương hàn?

b Từ vi khuẩn thương hàn bằng cách chiếu tia tử ngoại (UV) với liều lượng hạn chế người ta thu được chủng 2 có khả năng tự tổng hợp được tryptophan Vì sao?

c Để xác định nhu cầu tryptophan đối với vi trùng thương hàn có người nói nên sử dụng chủng 2 có đúng không?

Trả lời:

a Tryptophan là nhân tố sinh trưởng của vi trùng thương hàn, vì thiếu hợp chất này chúng không phát triển được

b Đã tạo chủng đột biến có khả năng tự tổng hợp được tryptophan

c Không nên sử dụng chủng 2 mà phải dùng chủng 1 là chủng khuyết dưỡng với tryptophan

Câu 4

a Vi khuẩn lactic chủng 1 tự tổng hợp được axit folic và không tự tổng hợp được

pheninalanin, còn vi khuẩn lactic chủng 2 thì ngược lại Có thể nuôi 2 chủng này trên môi trường thiếu axit folic và pheninalanin nhưng đủ các chất dinh dưỡng khác được không? vì sao?

b Để vi khuẩn của chủng tụ cầu vàng sinh trưởng phát triển bình thường cần có

nhân tố sinh trưởng là tiamin (VTM B1) Khi nuôi chủng tụ cầu vàng trong môi trường gồm nước, muối khoáng và nước thịt, chúng vẫn sống được Hãy cho biết môi trường trên là môi trường gì? Giải thích tại sao chủng tụ cầu vàng lại sống được trên môi trường đó

Trả lời:

a Hai chủng vi khuẩn lactic 1 và 2 là chủng vi khuẩn khuyết dưỡng Khi nuôi

trong cùng một môi trường không có nhân tố sinh trưởng là axit foclic và pheninalanin, chúng có thể phát triển được

b Môi trường nuôi chủng tụ cầu vàng là môi trường bán tổng hợp vì thành phần

của môi trường này gồm có muối khoáng và nước thịt

- Tiamin là nhân tố sinh trưởng của tụ cầu vàng, tuy nhiên trong nước thịt đã có nhân tố sinh trưởng nên chủng tụ cầu vàng này vẫn sống được trong môi trường gồm có muối khoáng và nước thịt

2 Các nguồn dinh dưỡng thường sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật.

2.1 Nguồn thức ăn cacbon của vi sinh vật

Căn cứ vào nguồn thức ăn cacbon người ta chia sinh vật thành các nhóm tự dưỡng và dị dưỡng Tuỳ nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp có thể

là các chất vô cơ (CO2 ) hoặc chất hữu cơ (C6H12O6…)

Thường sử dụng cacbohydrat làm nguồn cacbon khi nuôi cấy phần lớn các

vi sinh vật dị dưỡng

Ví dụ: Xenlulo được đưa vào các môi trường nuôi cấy vi sinh vật phân giải xenlulo dưới dạng giấy lọc, bông hoặc các dạng xenlulo; Trong công nghiệp lên men, rỉ đường là nguồn cacbon rẻ tiền và rất thích hợp cho sự phát triển của nhiều loại vi sinh vật khác nhau

Ngoài ra, người ta có thể sử dụng các nguồn hữu cơ khác như lipit, protein làm nguồn cacbon

Ví dụ: Khi sử dụng lipit, parafin, dầu mỏ làm nguồn cacbon nuôi cấy một

số loài vi sinh vật, phải thông khí mạnh để tạo từng giọt nhỏ có thể tiếp xúc được với thành tế bào của vi sinh vật

Các hợp chất hữu cơ chứa cả C và N (pepton, nước thịt, nước chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch, nước chiết giá đậu ) có thể sử dụng vừa làm nguồn C vừa làm nguồn N đối với vi sinh vật.

2.2 Nguồn thức ăn nitơ của vi sinh vật

Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NO3- và NH 4+ NH4+ sau khi được tế bào hấp thu có thể được trực tiếp sử dụng, còn NO3- sau khi được hấp thụ cần khử thành NH4+ rồi mới được vi sinh vật sử dụng

Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp đối với nhiều loại tảo, nấm sợi

và xạ khuẩn nhưng ít thích hợp đối với nhiều loại nấm men và vi khuẩn Thường

sử dụng muối NH4NO3 để làm nguồn nitơ cho nhiều loại vi sinh vật

Nguồn nitơ dự trữ nhiều nhất trong tự nhiên chính là nguồn khí nitơ tự do (N2) trong khí quyển

Vi sinh vật còn có khả năng đồng hoá rất tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ

Nguồn nitơ hữu cơ thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật là pepton loại chế phẩm thuỷ phân không triệt để của một nguồn protein nào đấy

2.3 Nguồn thức ăn khoáng của vi sinh vật

Khi tạo các môi trường tổng hợp (dùng nguyên liệu là hoá chất) bắt buộc phải bổ sung đủ các nguyên tố khoáng cần thiết Nhu cầu khoáng của vi sinh vật cũng không giống nhau đối với từng loài, từng giai đoạn phát triển

II Phân loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Kiểu nuôi cấy chỉ chứa một loại vi sinh vật được gọi là nuôi cấy thuần khiết, còn nuôi cấy hỗn hợp là kiểu nuôi cấy chứa nhiều hơn một loại vi sinh vật Các bước cần thiết cho nuôi cấy vi sinh vật như sau:

- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy phù hợp với vi sinh vật, giúp cho sự sinh trưởng tốt nhất

- Tiệt trùng môi trường nuôi trước đó để loại bỏ các sinh vật sống không mong muốn có sẵn trong môi trường nuôi cấy

- Cấy vi sinh vật vào môi trường đã chuẩn bị

Thông thường môi trường nuôi cấy được chuẩn bị trong các bình nuôi phổ biến như ống nghiệm, bình tam giác, đĩa petri, nồi lên men… Môi trường dinh dưỡng thường khác nhau về tỷ lệ thành phần các chất dinh dưỡng Ngoài ra về

trạng thái môi trường nuôi cấy có hai dạng phổ biến là dạng rắn và dạng lỏng, dạng lỏng thường được áp dụng cho hệ thống nuôi cấy liên tục trong công nghiệp.

* Căn cứ vào thành phần môi trường ta có 4 loại môi trường nuôi cấy: môi trường tự nhiên, môi trường tổng hợp, môi trường bán tổng hợp và môi trường sống Các loại môi trường này khác nhau rất nhiều về hình thức và thành phần tùy theo loài vi sinh vật cần nuôi cấy cũng như tùy thuộc vào mục đích của công tác nuôi cấy

1 Môi trường nuôi cấy tự nhiên

Môi trường thuộc nhóm này được phân lập ra dựa trên kinh nghiệm hơn là dựa vào sự hiểu biết về thành phần dinh dưỡng đối với vi sinh vật nuôi cấy Các môi trường tự nhiên được dùng phổ biến là: sữa, nước thịt bò, nước các loại rau củ hoặc ngũ cốc … Các loại môi trường này thường chứa đựng nhiều chất hữu cơ và

vô cơ tan trong nước có thể đáp ứng yêu cầu về dưỡng chất của một số lớn vi sinh vật (không phải là tất cả)

Ưu điểm: Dễ chuẩn bị và có thể sử dụng cho nhiều mục đích thông thường trong nghiên cứu vi sinh vật

Nhược điểm của loại môi trường tự nhiên là không biết chính xác thành phần dinh dưỡng cũng như thành phần dinh dưỡng của những lần chuẩn bị khác nhau sẽ rất khác nhau Do đó kết quả nuôi cấy của các lần chuẩn bị môi trường khác nhau có thể sẽ không giống nhau

2 Môi trường nuôi cấy tổng hợp

Để khắc phục nhược điểm của môi trường nuôi cấy tự nhiên, người ta đã thiết lập các môi trường nuôi cấy tổng hợp, trong đó các thành phần dinh dưỡng của môi trường được xác định rõ về số lượng và chất lượng

Ưu điểm của các loại môi trường nuôi cấy tổng hợp là ta có thể biết rõ cũng như điều khiển thành phần dinh dưỡng của môi trường một cách dễ dàng Với biện pháp tăng thêm hoặc bỏ bớt chất dinh dưỡng trong môi trường, chúng ta có thể biết

rõ tác động của chất dinh dưỡng đối với vi sinh vật Ngoài ra, đây là loại môi trường rất chính xác nhờ đó tránh được sự thay đổi trong các lần chuẩn bị môi trường, cũng như sẽ là môi trường rất tốt cho các loại vi sinh vật đã được biết rõ nhu cầu dinh dưỡng của chúng

Nhược điểm của môi trường tổng hợp là giá thành cao, chuẩn bị khá phức tạp và mất thời gian hơn đối với môi trường tự nhiên và chỉ sử dụng cho từng loài

vi sinh vật xác định được nhu cầu dinh dưỡng Trường hợp vi sinh vật chưa xác định, không thể nuôi cấy trên môi trường loại này một cách bảo đảm

Kiểu môi trường này thích hợp sử dụng trong phạm vi phòng thí nghiệm

3 Môi trường nuôi cấy bán tổng hợp

Môi trường nuôi cấy bán tổng hợp là môi trường nuôi cấy tự nhiên được bổ sung thêm với một số chất dinh dưỡng được xác định

Ví dụ: khi nuôi cấy vi khuẩn Xanthomonas campestris pv oryzae người ta thường dùng môi trường tự nhiên Tuy nhiên trong lúc cần phân lập và tách dòng

vi khuẩn từ một tế bào thì vi khuẩn này mọc không được tốt trên môi trường đó

Để thực hiện công tác này người ta phải thêm vào môi trường một số lượng rất nhỏ

Fe Vi khuẩn sẽ mọc thành các khuẩn lạc rất tốt trên môi trường mới này

4 Môi trường nuôi cấy sống

Dùng để nuôi cấy một số vi sinh vật đặc biệt có tính kí sinh bắt buộc Ví dụ: Virut không nuôi cấy được trên môi trường nuôi cấy nhân tạo, do đó cần nuôi cấy chúng trên sinh vật đang sống

Ví dụ: đối với virut gây bệnh đậu mùa, người ta nuôi cấy chúng trên con bò còn sống và sau đó thu thập virut trên con bò ấy để làm vacxin chủng bệnh đậu mùa Phần lớn các virut ký sinh trên động vật chúng ta phải nuôi cấy trong phôi của trứng gà lộn hoặc trên chuột, thỏ…

* Các loại môi trường chuyên dụng dùng cho các mục đích khác nhau như:

- Môi trường chọn lọc: dùng cho sinh trưởng của một loại vi sinh vật bởi vì

có chứa hóa chất ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật khác

Ví dụ: đưa bicromat kali vào môi trường để ức chế vi khuẩn nhằm phân lập

xạ khuẩn dễ dàng hơn

- Môi trường làm giàu: Dùng cho sinh trưởng của một loại vi sinh vật, vì

có chứa hóa chất rất cần cho sự sinh trưởng của vi sinh vật ấy Vi sinh vật này có thể rất hiếm trong tự nhiên Việc sử dụng môi trường này có thể tạo điều kiện cho chúng sinh trưởng tốt hơn lấn át các vi sinh vật khác, tới nồng độ quan sát được hoặc có thể phân lập được

Ví dụ: trong cát có rất ít vi sinh vật phân giải dầu mỏ so với các vi sinh vật khác Để phân lập, người ta dùng dầu mỏ là nguồn cacbon duy nhất Sau một thời gian ủ, số lượng các vi sinh vật phân giải dầu mỏ sẽ tăng lên.

- Môi trường phân hóa: Môi trường có chứa thuốc nhuộm hoặc các hợp

chất khác có thể tác động khi vi sinh vật thực hiện quá trình trao đổi chất, làm nổi bật đặc điểm đặc trưng giúp chúng ta định loại được vi sinh vật đó một cách dễ dàng

Ví dụ: một loại thuốc nhuộm hydrocacbon nhạy cảm với pH sẽ làm đổi màu khi vi khuẩn chuyển hóa đường sản sinh ra các sản phẩm thải có tính axit

* Căn cứ vào trạng thái của môi trường, người ta chia thành môi trường đặc

Câu hỏi vận dụng Câu 5 Làm thế nào để nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường đặc?

- Để nuôi cấy VSV trên môi trường đặc, người ta thêm vào môi trường lỏng 1.52% thạch – aga Đây là loại polisaccarit phức tạp chiết rút từ tảo đỏ ở biển và

có một số ưu điểm phù hợp với việc nuôi cấy VSV

- Thạch không bị VSV phân giải, nóng chảy ở 100oC, đông đặc khi để nguội 40- 40oC

Câu 6 Người ta cấy vi khuẩn Proteus vulgaris trên các môi trường lỏng có thành

phần tính theo đơn vị g/l:

NH4Cl – 1; FeSO4.7H2O - 0,01 ; K2HPO4 – 1; CaCl2 - 0,01; MgSO4.7H2O - 0,2; H2O - 1 lít; Các nguyên tố vi lượng (Mn, Mo,Cu, Zn): mỗi loại 2 10-5

Bổ sung thêm vào mỗi loại môi trường:

Chất bổ sung Các loại môi trường

- Các môi trường M1, M2, M3 và M4 thuộc loại môi trường gì?

- Nêu vai trò của axit nicotinic đối với vi khuẩn Proteus vulgaris?

- Vai trò của cao nấm men trong môi trường nuôi cấy là gì?

III Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật

1 Phương pháp nghiên cứu virut.

* Môi trường nuôi cấy virut

- Nuôi cấy trong cơ thể sinh vật là vật chủ của virut

- VR không nuôi cấy được ở trong các môi trường khác: vì virut thiếu các enzim dành cho chuyển hóa vật chất, không có riboxom và các thành phần khác của bộ máy tổng hợp protein, nên phải dựa hoàn toàn vào tế bào chủ => VR sống kí sinh nội bào bắt buộc

* Ứng dụng:

- Nuôi cấy virut nhằm phục vụ các công tác như nghiên cứu để sản xuất vacxin, sử dụng virut trong kĩ thuật di truyền với vai trò là vectơ chuyển gen…

* Chu trình nhân lên của virut: Gồm 5 giai đoạn: Hấp phụ, xâm nhập, sinh tổng

hợp, lắp ráp và phóng thích

Câu hỏi vận dụng Câu 7 Năm 1957, Franken và Conrat đã tiến hành thí nghiệm chứng minh vật chất

di truyền của virut là axit nucleic như thế nào?

Trả lời:

- Thí nghiệm của franken và conrat:

+ Chọn 2 chủng virut A và B đều có khả năng gây bệnh khảm thuốc lá, nhưng khác nhau ở các vết tổn thương trên lá

+ Tách lõi ARN ra khỏi vỏ protein của hai chủng virut A và B

+ Lấy axit nucleic của chủng A trộn với protein của chủng B →virut lai

+ Cho nhiễm chủng virut lai vào cây → cây bị bệnh

+ Phân lập từ lá cây bị bệnh sẽ được chủng virut A

Câu 8 Có một loài virut gây bệnh mới được phát hiện, virut này có thể nuôi cấy

trong phòng thí nghiệm bằng cách cho lây nhiễm vào các tế bào vi khuẩn Hãy mô

tả thí nghiệm dùng để xác định xem virut này có vật chất di truyền là ADN hay ARN trên cơ sở sử dụng phương pháp dùng đồng vị phóng xạ

Trả lời:

- Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên hai môi trường:

+ Môi trường 1: được bổ sung uracil (U) đánh dấu phóng xạ

+ Môi trường 2: được bổ sung thymine (T) đánh dấu phóng xạ

- Rồi cho virut lây nhiễm vào vi khuẩn ở hai môi trường Sau khi virut đã lây nhiễm vào tế bào vi khuẩn và tạo ra các hạt virut mới, thu các hạt virut được tổng hợp mới (từ các vết tan)

- Xác định xem mẻ nuôi cấy trong môi trường nào phát xạ Nếu virut chứa ARN thì các virut thu được tử mẻ nuôi cấy trong môi trường 1 sẽ phát phóng xạ, trong khi các virut thu được ở môi trường 2 thì không Nếu virut chứa ADN thì virut thu được từ mẻ nuôi cấy trong môi trường 2 sẽ phát phóng xạ, trong khi các virut thu được từ môi trường 1 thì không

Câu 9 Chứng minh phagơ chỉ đưa axit nucleic vào mà không đưa vỏ protein.

Trả lời:

Sử dụng phương pháp đánh dấu phóng xạ, dùng virut có lõi axit nucleic P32,

vỏ S35 cho tấn công Ecoli Khi virut nhân lên trong tế bào chủ thì thế hệ virut con mang vỏ protein mới không chứa chất đồng vị phóng xạ => chỉ có axit nucleic P32 trong tế bào vi khuẩn, vỏ nằm ngoài thành tế bào chủ

Câu 10 Bằng cách gây đột biến, người ta có thể tạo ra các tế bào hồng cầu của

người mang thụ thể CD4 trên bề mặt Điều gì sẽ xảy ra nếu đưa các tế bào này vào bệnh nhân nhiễm HIV?

Trả lời:

- Virut chỉ xâm nhập vào tế bào nếu chúng tìm được thụ thể phù hợp Trong quá trình biệt hoá từ tế bào gốc, tế bào hồng cầu bị mất nhân, tức là không có ADN Nếu virut xâm nhập vào tế bào hồng cầu thì không nhân lên được Đây có thể là một giải pháp chống HIV trong tương lai

Câu 11 Vacxin là gì? Cơ chế tác động của vacxin.

+ Vacxin là những vi sinh vật gây bệnh đã được làm suy yếu, tiêm vào cơ thể, vacxin đóng vai trò kháng nguyên kích thích các tế bào tủy xương tăng cường sản xuất bạch cầu limpho Các bạch cầu có chức năng sản xuất kháng thể đặc hiệu chống lại kháng nguyên gây bệnh Phản ứng được ghi nhớ trong tế bào tủy xương.+ Khi có vi sinh vật thực sự xâm nhập vào cơ thể thì tế bào nhớ nhanh chóng sản xuất ra một số lượng lớn bạch cầu limpho → sản xuất ra nhiều kháng thể tiêu diệt kháng nguyên gây bệnh

Kháng nguyên + kháng thể → phản ứng miễn dịch đặc trưng

2 Phương pháp nghiên cứu các vi sinh vật khác

a Phương pháp tạo chủng vi sinh vật thuần khiết

- Để tách một tế bào vi sinh vật ra và nuôi cấy thành một chủng thuần khiết hiện

nay người ta sử dụng phương pháp Roberkoch

- Roberkoch là người sáng lập ra phương pháp tách biệt vi khuẩn bằng cách dùng

môi trường đặc

- Các bước:

Bước 1: Chế tạo môi trường dinh dưỡng thích hợp: môi trường có pha thêm thạch

hoặc gelatin

Bước 2: Pha loãng mẫu trong nước vô trùng rồi cấy lên môi trường đặc.

Bước 3: Nuôi cấy mẫu ở nhiệt độ thích hợp từ một tế bào sinh sản tạo khuẩn lạc là

những đốm nhỏ, mỗi khuẩn lạc gồm nhiều cá thể bắt đầu từ một tế bào ban đầu

- Dựa vào khuẩn lạc người ta có thể:

+ Đếm khuẩn lạc xác định số lượng vi khuẩn ban đầu

+ Tách biệt từng loại vi khuẩn để nghiên cứu riêng

Bước 4: Dùng đũa cấy vô trùng cấy khuẩn lạc sang môi trường mới là ống thạch

để nghiêng được chủng vi sinh vật thuần khiết

trung bình 50 tế bào nấm men Sau 4 giờ dung dịch được pha loãng 10 lần Người

ta lại làm tiêu bản hiển vi như cách làm ban đầu Lần này trên 1 đơn vị diện tích trung bình có 80 tế bào Hãy cho biết thời gian thế hệ là bao nhiêu giờ? (nguồn: đề Yên Bái 2010 – 2011)

Trả lời:

Áp dụng công thức: Nt = N0 2x

 Dung dịch pha loãng 10 lần => số tế bào sau 4 giờ trên 1 đơn vị diện tích là:

Nt = 80 x 10 = 800 =>50 2x = 800 => x = 4 (thế hệ)

Thời gian thế hệ là: 4 giờ : 4 = 1 giờ

Từ 5 tấn tôm nguyên liệu mới nhập về, nhân viên phòng TN đã lấy 1 kg mẫu đem xác định vi sinh vật.

Câu 13 Có 250 g nguyên liệu được đem nghiền nát trong máy chuyên dụng sau đó

được bổ sung nước cất vô trùng cho đủ 500 ml

Nhân viên phòng thí nghiệm chuẩn bị 5 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml nước cất

vô trùng

Lấy 1ml dịch nghiền cho vào ống nghiệm thứ nhất rồi lắc đều ống nghiệm, sau đó lại hút 1 ml huyền phù từ ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm 2 và tiếp tục làm như thế cho tới khi 1 ml huyền phù từ ống nghiệm 4 được cho vào ống nghiệm 5.

Lấy 3 hộp petri mỗi hộp cho vào 1 ml huyền phù từ ống nghiệm 5 để nuôi cấy với mục đích xác định vsv tổng số

Kết quả đĩa 1 có 78 khuẩn lạc, đĩa 2 có 57 khuẩn lạc, đĩa 3 có 60 khuẩn lạc, hãy cho biết

a Mục đích của việc sử dụng 5 ống nghiệm nói trên

b So sánh mật độ vi khuẩn giữa các ống nghiệm

c Số vi khuẩn có trong 1 kg tôm nguyên liệu

d Nhân viên thu mẫu nhưng để qua đêm mới làm thì kết quả kiểm nghiệm còn ý nghĩa không? Tại sao

Trả lời:

a việc sử dụng 5 ống nghiệm nước cất nhằm mục đích pha loãng VSV từ mẫu ban đầu

b.mật độ vi khuẩn của ống nghiệm sau bằng 1/10 mật độ ở ống nghiệm liền trước

c ở VSV qua quá trình nuôi cây bằng phương pháp pha loãng 1 khuẩn lạc có nguồn gốc từ 1 VK

- số VK trong 1ml huyền phù từ ống nghiệm 5 là (78 + 57 + 60)/3 = 65

Từ một dịch nuôi phagơ T4 (lây nhiễm vi khuẩn E coli) có mật độ chưa biết (ống

), người ta tiến hành pha loãng theo dãy như hình dưới đây Từ ống cuối (ống

), dùng pipet hút ra 3 lần, mỗi lần 0,1 mL (mililít) rồi tiến hành cấy trải trên 3 đĩa Petri chứa môi trường giàu dinh dưỡng Qua đêm, người ta xác định được số lượng vết tan trên 3 đĩa Petri lần lượt là 11, 12 và 16 Giả sử mỗi vết tan tương ứng với

một phagơ T4, thì mật độ phagơ T4 trong 1,0 mL dịch nuôi ban đầu (ống ) là bao

b Phương pháp nhuộm màu tế bào sinh vật

Phương pháp được sử dụng khi muốn xác định hình dạng tế bào, nhận biết vi

khuẩn gram dương, vi khuẩn gram âm hoặc quan sát NST qua tiêu bản tế bào vi

sinh vật…v.v…

* Phương pháp nhuộm đơn tế bào

Chuẩn bị: thuốc nhuộm xanh metilen, fucshin, dung dịch nấm men

Cách tiến hành:

Bước 1: Dùng que cấy lấy một ít dịch nấm men cho vào ống nghiệm có sẵn 5ml

nước, khuấy đều

Bước 2: Dùng que cấy lấy một giọt dung dịch này cho lên lam kính → hong khô Bước 3: Dùng pipet nhỏ một giọt fucshin vào vị trí đã nhỏ giọt dung dịch khô Bước 4: Để 1 phút rồi nghiêng phiến kính đổ fucshin đi.

Bước 5: Rửa nhẹ tiêu bản → hong khô, soi kính.

* Phương pháp nhuộm Gram

0,1 mL 0,1 mL 1,0 mL 3,1 mL

9,9 mL môi trường lỏng

9,0 mL môi trường lỏng

6,9 mL môi trường lỏng

0,1 mL

9,9 mL môi trường lỏng

Chuẩn bị: Dung dịch tím kết tinh, dung dịch lugol, dung dịch tẩy màu: cồn 95o; dung dịch nhuộm bổ sung fucshin.

- Đèn cồn, lam kính, lamen, kính hiển vi, que cấy

Cách tiến hành

Bước 1: Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau

khi cấy 24 giờ) hoà vào một giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí

Bước 2: Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.

Bước 3: Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô Bước 4: Nhuộm lại bằng dung dịch lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô => iot

tạo phức với tím kết tinh -> giúp bền màu

Bước 5: Nhỏ dịch tẩy màu (cồn), giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất

màu), rửa nước, thấm khô => gram – không màu; gram + màu tím

Bước 6: Nhuộm bổ sung bằng dung dịch fucshin đỏ trong 2-3 phút, rửa nước, để

khô trong không khí

Bước 7: Soi kính: dùng vật kính dầu 100´.

Kết quả: G + màu tím, Gram – màu đỏ

Giải thích: bản thân PG không bị nhuộm màu, nhưng ngăn cả sự thất thoát của tím kết tinh Khi tẩy bằng cồn, G+ do có thành dày nên giữ được màu, G- lớp PG mỏng nên khi tẩy cồn làm mất màu, màu hồng của G – là màu của thuốc nhuộm bổ sung

Câu 15 Nêu cơ sở hóa học của phương pháp nhuộm Gram? Ý nghĩa của phương