Tìm hiểu về ứng dụng của enzyme cellulase

Trong tương lai hứa hẹn đây sẽ là một ngành công nghiệp được đầu tư phát triển rộng bởi những ứng dụng và tính hiện đại của nó trong nhiều lĩnh vực và đời sống.. Mục đích nghiên cứuMục t

Mở đầu

Enzyme là lọai protein, xúc tác cho mọi phản ứng sinh học trong mọi tế bào của sinh vật Enzyme rất quan trọng với cơ thể con người, nếu không có enzyme thì mọi sự chuyển hóa trong cơ thể con người bị đình trệ và không thể sống được

Ngoài ra nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghiệp chế biến thực phẩm, trong y học, kỹ thuật phân tích, bảo vệ môi trường.

Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng enzyme được phát triển mạnh từ đầu thế kỷ 20đến nay Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại lợi nhuận rất lớn cho nhiều nước Việt Nam là một trong những nước có những nghiên cứu và ứng dụng enzyme.

Tuy nhiên, công nghệ enzyme của ta chưa thực sự phát triển do đây là một ngành đòi hỏi công nghệ cao Trong tương lai hứa hẹn đây sẽ

là một ngành công nghiệp được đầu tư phát triển rộng bởi những ứng dụng và tính hiện đại của nó trong nhiều lĩnh vực và đời sống.

Enzyme cellulase là một trong những enzyme có vai trò quan trọng trong chuyển hóa chất hữu cơ có trong thiên nhiên và có ý nghĩa lớn trong công nghiệp thực phầm và bảo vệ môi trường

Do có nhiều ứng dụng trong thực tế song việc ứng dụng chúng vào thực tiễn không phải là điều dễ dàng nên đó là lý do vì sao vấn đề “ Tìm hiểu về ứng dụng của enzyme cellulase” được chúng tôi chọn làm đề tài tiểu luận.

1 Mục đích nghiên cứu

Mục tiêu của đề tài là khảo sát các đặc tính cơ bản của enzyem cellulase và hướng ứng rộng rãi của enzyme này trong công nghiệp nói chung và công nghiệp thực phẩm nói riêng

2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là enzyme cellulase.

Phương pháp nghiên cứu chủ yếu dùng phương pháp nghiên cứu lý thuyết, phân tích, tổng hợp nhằm làm rõ vấn đề được nghiên cứu và giúp người đọc có cái nhìn tổng quát hơn về loại enzyme này.

3 Kết cấu của bài tiểu luận

Tiểu luận với đề tài:“Tìm hiều về ứng dụng của enzyme cellulase ” được thực hiện bởi 3 phần chính:

Phần I: Tổng quan về enzyme cellulase

Phần II: Quy trình sản xuất enzyme cellulase

Phần III: Các ứng dụng của enzyme cellulase

Phần I: Tổng quan về enzyme cellulase

1 Giới thiệu chung

Cellulase là thành phần cơ bản của tế bào thực vật vì vậy nó có mặt trong mọi loại rau quả, nguyên liệu, phế liệu của các ngành trồng trọt, lâm nghiệp Tuy nhiên người và động vật không có khả năng phân hủy cellulose Nó chỉ có giá trị làm tăng tiêu hóa, nhưng với lượng lớn nó trở nên vô ích hay cản trở tiêu hóa

Cellulase là phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose thông qua việc thủy phân liên kết β-1,4- glucoside trong cellulose

Cellulase có khả năng thủy phân cellulose thanh đường Con người và động vật không có khả năng phân giải cellulose, nó có vai trò chất độn Phương pháp tìm chế phẩm cellulase còn hạn chế

Chế phẩm cellulase thường dùng để: tăng chất lượng thực phẩm, thức ăn và gia súc hoặc tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vât

Enzyme cellulase đã được nghiên cứu rất lâu trên thế giới Đây là enzyme được ứng dụng rất rộng rãi, chỉ đứng sau protease và amylase

2 Nguồn gốc enzyme Cellulase:

Enzyme Cellulase đưược thu nhận từ các nguồn khác nhau:

Từ động vật đó là dịch tiết da dày bò hay các nhóm thân mềm

Từ thực vật: trong hạt ngũ cốc nảy mầm như đại mạch, yến mạch, lúa mì mạch đen

Từ vi sinh vật: các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men

Trong thực tế người ta thường thu nhận enzyme cellulase từ vi sinh vật Các chủng vi sinh vật thường sử dụng đó là:

Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus candidus

Xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli

Vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacillus subtilis, Bacillus pumilis

3

Cấu trúc của enzyme cellulase:

Hình 1: Cấu trúc không gian Cellulase

Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là axit amin, các axit amin được nối với nhua bởi liên kết peptid –CO-NH- Ngoài ra, trong cấu trúc còn có những phần phụ khác Cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme nhóm endoglucanase (EG) và exoglucanase (CBH) giống nhau trong hệ cellulase của nấm sợi, gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận cùng, phần đuôi này xuất phát

từ trung tâm xúc tác và được gắn thêm vùng glycosil hóa, cuối đuôi là vùng gắn kết với cellulose Vùng này có vai trò tạo liên kết với cellulose tinh thể Trong quá trình phân hủy cellulose có sự tương quan mạnh giữa khả năng xúc tác phân giải cellulose của các enzyme và ái lực của enzyme này đối với cellulose Hơn nữa, hoạt tính của cellulase dựa vào tinh thể cellulose và khả năng kết hợp của CBD với cellulose Điều này chứng tỏ CBD sẽ hỗ trợ cho enzyme cellulase thực hiện việc cắt đứt nhiều liên kết trong cellulose tinh thể Vùng gắn kết với cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường của protein và việc thay đổi chiều dài vùng glycosil hóa có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme

4 Tính chất:

Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như carboxymethyl cellulose (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEB) Cellulase cắt liên kết β-1,4-glucosid trong cellulose, lichenin và các β-D-glucan của ngũ cốc

Độ bền nhiệt và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau Cellulase hoạt động

ở pH từ 3-7, nhưng pH tối thích trong khoảng 4-5 Nhiệt độ tối ưu từ 40-50o C Hoạt tính cellulose bị phá hủy hoàn toàn ở 80oC trong 10-15 phút

Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose và bị ức chế hoàn toàn bởi Hg Ngoài ra, cellulose còn bị ức chế bởi các ion kim loại khác như Mn,Ag,Zn nhưng ở mức độ nhẹ

Trọng lượng của enzyme cellulose thay đổi từ 30-11-Kda

5 Phân loại:

Dựa vào đặc điểm cơ chất và cơ chế phân cắt, enzyme cellulase được chia thành 3 loại:

- 1,4-β- D- glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91)

- 1,4-β- D- glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4)

- β- D- glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21)

6

Cơ chất của enzyme cellulase

Cellulose là cơ chất của enzyme cellulase Cellulose là một polysaccharide phong phú nhất trong tự nhiên Việc phân hủy sinh học cellulose bởi vi sinh vật là một trong những chu trình carbon trên trái đất

Hình 2: Cấu trúc Cellulose

7 Cơ chế xúc tác

7.1 Enzyme 1,4-β- D- glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) β-β- D- glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) D-β- D- glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91)

Hình 3: Cơ chế hoạt động của Exoglucanase

Tên gọi khác: exoglucanase, β-1,4-glucanase, cellobiohydrolase, exo-cellobiohydrolase, exo-β-1,4-glucan exo-cellobiohydrolase, 1,4-β-D-glucan

cellobiosidase, cellobiosidase, CBH 1, C1 cellulase, avicedase

Enzyme này thủy phân liên kết 1,4-β-D-glucoside từ đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellubiose

7.2 Cơ chế 1,4-β- D- glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) β-β- D- glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) D-β- D- glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) glucan 4-β- D- glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) glucanohydrolase (EC 3.2.1.4)

Hình 4: Cơ chế hoạt động của Endoglucanase

Enzyme này còn có tên gọi khác như: endoglucanase, carboxymethyl cellulase, celludextrinase, Cellulase A, Cellulosin AP, Alkali Cellulase, Cellulase A3, 9,5 Cellulase, Avicelase, Pancellase SS

Enzyme này thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4-β-D-glucoside giữa mạch của chuỗi cellulose, lichenin và các β-D-glucan của ngũ cốc

7.3 Cơ chế β-β- D- glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) D-β- D- glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) glucoside glucohydrolase ( EC 3.2.1.21)

Hình 5: Cơ chế hoạt động β-glucosidaseglucosidase

Enzyme này có tên gọi khác như là: β- glucoside, β- D- glucosidase, β- 1,6- glucosidase, β- glucoside glucohydrolase, p- nitrophenyl β- glucosidase, aryl- β- glucosidase, gentiobiase, cellobiase, limarase, salicilinase

Enzyme này thủy phân gốc β- D- glucoside không khử ở đầu tận cùng để giải phóng ra β- D- glucose

8 Hoạt lực của enzyme cellulase:

Thủy phân của cellulose phải có sự tham gia của cả 3 loại enzyme cellulose như: endoglucanlase, exoglucanlase và β-glucodase Thiếu 1 trong 3 loại enzyme trên thì không thể thủy phân phân tử cellulose đến cùng

Từ những nghiên cứu riêng lẻ đối với từng enzyme đến nghiên cứu tác động tổng hợp của cả 3 loại enzyme cellulose, nhiêu nhà khoa học đều đưa ra kết luận chung là các loại enzyme cellulose sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose Có nhiều cách giải thích khác nhau về cơ chế tác động của cellulose, trong đó cách giải thích do Erikson đưa ra đươc nhiều người công nhận hơn cả

Theo Erkson và công tác viên(1980), cơ chế tác động hiệp đồng của 3 loại cellulose như sau: đầu tiên endoglucanlase tác động vào vùng vô định hình trên bề mặt cellulose, cắt liên kết β-1,4 glucoside và tạo ra các mạch tự do Tiếp đó exoglucanlase tấn công cắt ra từng đoạn cellobiose từ đầu mạch được tạo thành Kết quả tác động của endoglucanlase và exoglucanlase tạo ra các celloligosaccharic mạch ngắn, cellobiose, glucose Β-glucosidase thủy phân tiếp và tạo thành glucose

Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulose trong điều tự nhiên thường bị tác động bởi các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh, có

loài phát triền rất yếu Chính vì thế, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ xảy ra rất chậm

Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc phân hủy cellulose bằng enzyme ngoài các yếu tố kỹ thuật như nhiệt độ, PH, nồng độ cơ chất, lượng enzyme một yếu tố hết sức quan trọng là tính đồng bộ của hệ enzyme cellulose từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau quá trình thủy phân cellulose chỉ

có thêt tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi sử dụng đồng bộ 3 loại enzyme cellulose Mỗi loại vi sinh vật chỉ có khả năng sinh tổng hợp ưu việt 1 loại enzyme Chính vì thế cần phải khai thác enzyme cellulose từ nhiều nguồn vi sinh vật

9 Các yêu tố ảnh hưởng đế hoạt lực của enzyme cellulase:

9.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp một enzyme của vi sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp Sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme thươnngf bị kìm hãm ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp

Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên kh tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc của enzyme Hoạt tính của enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp, khoảng nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme là vào khoảng 40-50° C ở nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặc mất hoạt tính, còn ở nhiệt độ thấp dưới 0°C hoạt tính của enzyme

bị giảm nhiều nhưng lại có thể phục hồi khi đưa về nhiệt độ thích hợp

Cellulase từ A Niger NRNL- 363 hoạt động mạnh nhất ở 50° C , trong khi đó cellulase A Niger Z10 là 40° Ccòn hoạt tính xúc tác của endoglucanlase III từ

Trichoderma reesei đạt tối đa ở 55 ° Ctheo kết quả nghiên cứu của Kiamoto và cs

(1996) các endoglucanlase từ chủng A Oryzae KBN 616 hoạt động tốt nhất trong

giải nhiệt độ 45- 55° C

9.2 Ảnh hưởng của pH:

Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc vào pH của mô trường phản ứng Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà pH thích hợp để enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm, hoặc acide Theo nghiên cứu trước đây cho thấy, pH tối thích cho hoạt động của enzyme cellulase của A.niger NRRL-363 là 5,5; cellulase từ

A.niger Z10 là từ 4,5- 7,5; của endoglucanlase từ Trichoderma reesei từ 4,0-5,0;

của endoglucanlase từ A Oryzae KBN 616 4,0-5,0 Khi nghiên cứu ảnh hưởn của

pH nên hoạt tính endoglucanlase từ chúng nấm ưa acide A.terreus M11, Gao và

cộng sự cho rằng enzyme này có khả năng hoạt động trong giải pH 2-5, trong đó

pH 2 là tốt nhất

9.3 Ảnh hưởng của ion kim loại

Các ion KL có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa sự hoạt động của các enzym Các ion kl nặng ở nồng độ nhất định có thể gây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch enzym Sharma và cs (1995) nhận thấy, ion Ca2+ làm tăng hoạt tăng hoạt tính của enzyme cellulase của Baccillus sp D04 lên 40% so với đối chứng, còn Mg2+ làm giảm nhẹ ( hoạt tính còn lại 92%) và Zn2+ ức chế mạnh hoạt tính của enzyme này (hoạt tính còn lại bằng 37% so với đối chứng) Theo nghiên cứu của Gao và cộng sự (2008), endoglucannase từ A Terreus M11 bị giảm 77% hoạt tính khi ủ với Hg2+ (2mM), 59% khi ủ với Cu2+ (2mM)

Ngoài ra, các dung môi hữu cơ, các chất tẩy rữa cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt tính của enzyme Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng như bản chất của enzyme mà tính chất và mức độ ảnh hưởng tới hoạt động của enzyme là khác nhau Nghiên cứu của Trịnh Đình Khá (2006)trên chủng Penicillium sp DTQ – HK1 cho thấy, các dung môi hữu cơ methanol, ethanol, isopropanol và các aceton đều ức chế hoạt động của cellulase đặc biệt là n-butanol ức chế mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn 33-63% Các chất tẩy rữa tween 80, SDS và triton

X-100 đều làm giảm hoạt tính cellulase ở mức độ khác nhau, trong đó SDS làm giảm mạnh hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34%

Phần II Quy trình sản xuất enzyme

cellulase từ Trichoderam Reese

Trichoderam Reesei là những vi sinh vật sản xuất nhiều enzyme ngoại bào

có hiệu quả cao Chúng được thương mai hóa trong việc sản xuất enzyme cellulase

và các enzyme khác phân hủy các polysaccharide phức tạp Nhờ vậy chúng được

sử dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm và ngành công nghiệp dệt cho các mục đích tương tự

Hình 6: Hình ảnh Trichoderam Reesei qua kính hiển vi

Quy trình:

Chế phẩm

Dịch Khuấy

Lọc

Thu dịch

Ly tâm 8000 vòng/

phút

Dịch

Kết tủa( bằng cồn, axeton, muối

amoni sunfat)

Ly tâm

Enzyme thô

Tinh sạch

Thuyết minh quy trình:

Chủng nấm Trichoderma Reesei được nuôi cấy trê môi trường BM:CM( bã mía, cám mì) sau quá trình nuôi cấy ta cấy ta thu được chế phẩm enzyme thô từ mô trường

Cân 5g chế phẩm enzyme thô cho vào cốc thủy tinh, thêm vào 20ml nước cất

Khuấy đều enzyme trong khoảng thời gian 30 phút

Lọc lấy dịch chiết được thể tích khoảng 17,5 ml

Đem dịch lọc được đi ly tâm

Thu dịch ly tâm

Tủa dịch ly tâm ( bằng cồn, acetone, hoặc muối amoni sulphate) trường hợp này ta thu tủa dịch bằng cồn 96, với tỷ lệ 1:3 tức là 17,5 ml dịch chiết enzyme thô với 52,5 ml cồn 96

Tách lấy phần tủa ở dưới đem cân phân tích thu được khoảng 20,1 enzyme thô ở trạng thái này enzyme rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản ngừoi ta sấy kết tủa enzyme cellulase ở 40° C cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-8%W

Sau đó ta đem enzyme thô đi tinh sạch bằng quá trình lọc gel hay sử dụng phương pháp cố định enzyme để thu enzyme cellulase thành phẩm

Phần III Ứng dụng của enzyme cellulase

1 Trong công nghiệp giấy:

Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, bổ sung các loại enzyme trong khâu nghiền bột, tẩy trắng có vai trò rất quan trọng Nguyên liệu ban đầu chưuas hàm lượng cao các chất khó tan là lignin và một phần hemicellulose, nên trong quá trình nghiền để tách riêng các sợi gỗ thành bột mịn gặ nhiều khó khăn Trong công đoạn nghiền bột giấy , bổ sung endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học Trước khi nghiền hóa học, gỗ được xử lý với endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin

Trong công nghệ chế tạo giấy, các loại giấy thải cần được tẩy mực trước khi sản xuất các loại giấy in, giấy viết Endoglucanase và hemicellulase đã được dùng

để tẩy trắng mực in trên giấy

Enzyme cellulase được bổ sung vào rất nhiều giai đoạn khác nhau trong quá trình sản xuất giấy:

 Trong giai đoạn nghiền bột giấy cơ học: Người ta bổ sung enzyme

cellobiohydrolase nhằm làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, từ

đó làm tăng khả năng nghiền và tiết kiệm 20% năng lượng

 Trong giai đoạn nghiền bột giấy hóa học: Ngoài enzyme cellulase người

ta còn bổ sung thêm enzyme hemicellulase và pectinase nhằm phá vỡ lớp

vỏ ngoài của gỗ, giúp tăng cường khả năng khuếch tán của hóa chất bên trong gỗ, nhằm làm tăng hiệu quả khử lignin

 Trong giai đoạn tẩy trắng giấy: Đay là giai đoạn rất quan trọng trong sản xuất giấy Trước đây, người ta thường sử dụng acid HCl để tẩy trắng giấy, tuy nhiên, HCl thải ra trong quá trình sản xuất làm ô nhiễm môi trường và gây hại đối với sức khỏe con người Ngày nay, người ta sử dụng enzyme cellulase trong giai đoạn tẩy trắng cũng như quá trình tái chế giấy Ưu điểm của phương pháp này là giữ cho sợi giấy không bị ăn mòn nhiều và không gây ảnh hưởng đến môi trường