NOVEL MECHANISMS IN THE REGULATION OF PERINUCLEAR ACTIN ASSEMBLY 2

NOVEL MECHANISMS IN THE REGULATION OF PERINUCLEAR ACTIN ASSEMBLY SHAO XIAOWEI (B. Sci., BNU) A THESIS SUBMITTED FOR THE DEGREE OF DOCTOR OF PHILOSOPHY MECHANOBIOLOGY INSTITUTE NATIONAL UNIVERSITY OF SINGAPORE 2014 DECLARATION I hereby declare that this thesis is my original work and it has been written by me in its entirety. I have duly acknowledged all the sources of information which have been used in the thesis. This thesis has also not been submitted for any degree in any university previously. Shao Xiaowei 18 August 2014 i Acknowledgements I would like to express my deepest gratitude to all those who have helped me in my PhD study and this thesis work. First and foremost, I would like to thank my supervisors Prof. Alexander Bershadsky and Prof. G.V. Shivashankar for their guidance and inspiration. I appreciate Prof. Bershadsky’s pure interest and sustained passion in science and wisdom in life. I am most thankful to his generosity, continuous encouragement and understanding. I appreciate Prof. Shiva’s humor and strictness, his clear goals and ambitious attitude to research and oneself. From them I leant how to be a scientist and got faith to take science as career. I am very lucky and grateful to have my colleagues and friends throughout my study. Qingsen, has not only been a collaborator, but also become a good friend during these years. Naila has helped me in many aspects from the first day I joined the lab. Talking with her make me feel warm and positive. I am also extremely grateful to have Robert, Weiwei, Yee-Han, Meenu, Visali, Kee Chua, Nikhil, Abhishek, Shova and Venky as teammates and friends; I am especially thankful to Robert for his expert help in revising this thesis. I must thank Prof. Low Boon Chuan’s lab, where I got a lot of technical suggestions and support of reagents. I want to thank Keiko, Alvin and Jichao for their time and patience in helping me with the biochemical experiments that I am not i good at. A special thanks goes to Dr Foo Yong Hwee, who is always glad to help and spends much his own time whenever I get problems in fluorescence correlation spectroscopy. With this, I must thank our collaborator, Prof. Thorsten Wohland, for introducing this technique to us. I also thank Prof. Alex Mogilner for his great collaboration work in one of our projects. It was a great pleasure to have Prof. Brian Burke and Prof. Low Boon Chuan serve in my thesis advisory committee. Both them have provided valuable advices as well as materials to my work. Also, I would like to thank MBI and the core facilities for providing financial support and such an excellent environment for me to study, grow up and pursue my dream. Last, but not least, I would like to thank my parents and grandparents for their unconditional love, guidance and support. I thank my boyfriend for his company at the final stage of my PhD candidature. There are many other people I want to thank and I can never thank them enough. I wish them all the best in their life. ii Contents Acknowledgements i! Contents iii! Abstract vi! List of Figures ix! List of Abbreviations . xii! Chapter 1! Introduction . 1! 1.1! The mechanosensitive actin cytoskeleton 1! 1.1.1! Cellular response to mechanical signals . 1! 1.1.2! Actin dynamics and its regulation 3! 1.2! Formins as potent activators of actin polymerization 13! 1.2.1! Autoinhibition and activation of formins . 14! 1.2.2! Regulation of cytoskeleton by formins . 18! 1.2.3! Cellular functions of mDia and INF2 . 20! 1.3! The perinuclear actin and nuclear transport . 24! 1.3.1! The perinuclear actin 26! 1.3.2! Nuclear transport machinery 29! 1.4! Thesis summary 33! 1.4.1! Motivation, objectives and hypotheses . 33! 1.4.2! Scope of work . 34! Chapter 2! Materials and methods . 37! iii 2.1! Cell culture, plasmids and transfection 37! 2.2! Chemicals, immunofluorescence and antibodies . 39! 2.3! Molecular biology 40! 2.4! Mechanical manipulation . 42! 2.5! Fluorescence microscopy and spectroscopy 43! 2.6! Data analysis 49! Chapter 3! Perinuclear actin remodeling induced by mechanical stimulation ………………………………………………………………… 51! 3.1! Introduction 51! 3.2! Results 52! 3.2.1! Force activation induces reversible perinuclear actin polymerization …………………………………………………………………….52! 3.2.2! The role of calcium . 57! 3.2.3! The role of actin dynamics . 61! 3.2.4! Dispensability of Nesprin and Filamin A 65! 3.2.5! The critical role of inverted formin . 67! 3.2.6! Ultrastructure of the perinuclear actin rim . 70! 3.3! Discussion 72! 3.4! Supplementary Figure 77! Chapter 4! Localization and dynamics of formin mDia2 at the nuclear envelope ………………………………………………………………… 78! 4.1! Introduction 78! iv 4.2! Results 81! 4.2.1! Accumulation of mDia2 to nuclear envelope (NE) 81! 4.2.2! mDia2 is localized to the cytoplasmic side of NE 84! 4.2.3! Co-localization of mDia2 with NPC and importin β at NE . 86! 4.2.4! Knockdown of importin β attenuates mDia2 recruitment at NE 88! 4.2.5! Interaction between mDia2 and importin β . 90! 4.2.6! Diffusion profiles of mDia2 and importin β measured by fluorescence correlation spectroscopy 92! 4.3! Discussion 96! 4.4! Supplementary figures 100! Chapter 5! Conclusions and future directions . 105! 5.1! Conclusions 105! 5.2! Future directions . 106! References . 107! v Abstract Proper organization and dynamics of actin cytoskeleton are critical for cells’ functions and survival. Perinuclear actin contributes to the maintenance of nuclear shape and cellular mechanical homeostasis, and integrating cell nucleus into the actin cytoskeleton architecture. Actin dynamics is regulated by a number of different factors in concert. It is widely accepted that extracellular physical signals can exert effects on actin dynamics and organization. Inside the cell, the formin protein family constitutes an important group of actin regulators. However, how these external and internal regulators control actin dynamics in the perinuclear region has not been sufficiently studied. This thesis concentrates on understanding the regulation of perinuclear actin dynamics. To investigate this, bioimaging techniques supplemented by force manipulation and biochemical approaches were employed. Here, first I report that external mechanical force induced an immediate and transient perinuclear actin assembly. This actin reorganization was triggered by intracellular calcium burst induced by force application. Addition of calcium ionophore A23187 recapitulated the force induced perinuclear actin assembly. Blocking of either actin polymerization or depolymerization inhibited this response. At the same time, displacing nesprins from the nuclear vi envelope did not abolish the calcium-dependent perinuclear actin assembly. The ER and nuclear membrane-associated actin polymerization factor, inverted formin-2 (INF2), was found to be required for the perinuclear actin assembly. The perinuclear actin rim structure co-localized with INF2 upon stimulation, and INF2 depletion resulted in attenuation of the rim formation. A mathematical model explaining the activation of INF2 by calcium-triggered actin depolymerization was presented and discussed in the thesis. Thus, I demonstrated a novel pathway comprising the increase of the intracellular calcium concentration and formin INF2 activation as a result of local mechanical stimulation. This pathway connects external mechanical stimuli with perinuclear actin polymerization that may play a role in protection of the nucleus as well as in activation of some nuclear functions. The second part of this thesis is devoted to formin mDia2. I showed that this formin localized to the cytoplasmic side of nuclear membrane. Further, quantitative measurement using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) revealed reduced motility of mDia2 in close proximity to the nuclear envelope compared to that in the bulk of cytoplasm. This means that mDia2 is trapped in perinuclear region by interactions with some associated proteins. By super-resolution imaging, mDia2 co-localization with the transport receptor importin β and the nuclear pore complexes (NPC) was demonstrated. Importin β was shown to interact with mDia2 as detected by immunoprecipitation assay. Finally, silencing of importin β was shown to attenuate mDia2 localization at vii the nuclear rim. These data suggest that mDia2 can be an additional factor participating in the assembly of perinuclear actin network. This thesis has provided new findings and hypotheses on the regulation of perinuclear actin. It shows that the dynamics of perinuclear actin can be controlled by external mechanical factors and the molecular regulators from the formin protein family. viii Cooper,)J.A.)(1987).)Effects)of)cytochalasin)and)phalloidin)on)actin.)J)Cell)Biol!105,) 147311478.) Copeland,)J.W.,)and)Treisman,)R.)(2002).)The)diaphanous1related)formin)mDia1) controls) serum) response) factor) activity) through) its) effects) on) actin) polymerization.)Mol)Biol)Cell!13,)408814099.) Copeland,)S.J.,)Green,)B.J.,)Burchat,)S.,)Papalia,)G.A.,)Banner,)D.,)and)Copeland,)J.W.) (2007).) The) diaphanous) inhibitory) domain/diaphanous) autoregulatory) domain) interaction) is) able) to) mediate) heterodimerization) between) mDia1) and) mDia2.) J) Biol)Chem!282,)30120130130.) Coste,)B.,)Xiao,)B.,)Santos,)J.S.,)Syeda,)R.,)Grandl,)J.,)Spencer,)K.S.,)Kim,)S.E.,)Schmidt,) M.,)Mathur,)J.,)Dubin,)A.E.,!et!al.)(2012).)Piezo)proteins)are)pore1forming)subunits) of)mechanically)activated)channels.)Nature!483,)1761181.) 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Thapsigargin,)a)tumor)promoter,)discharges)intracellular)Ca2+)stores)by)specific) inhibition)of)the)endoplasmic)reticulum)Ca2(+)1ATPase.)Proc)Natl)Acad)Sci)U)S)A! 87,)246612470.) Thurston,)S.F.,)Kulacz,)W.A.,)Shaikh,)S.,)Lee,)J.M.,)and)Copeland,)J.W.)(2012).)The) ability)to)induce)microtubule)acetylation)is)a)general)feature)of)formin)proteins.) Plos)One!7,)e48041.) Tominaga,)T.,)Sahai,)E.,)Chardin,)P.,)McCormick,)F.,)Courtneidge,)S.A.,)and)Alberts,) A.S.) (2000).) Diaphanous1related) formins) bridge) Rho) GTPase) and) Src) tyrosine) kinase)signaling.)Mol)Cell!5,)13125.) Toomre,)D.,)and)Bewersdorf,)J.)(2010).)A)new)wave)of)cellular)imaging.)Annu)Rev) Cell)Dev)Biol!26,)2851314.) Toyota,) K.,) Ogino,) D.,) Hayashi,) M.,) Taki,) M.,) Saito,) K.,) Abe,) A.,) Hashimoto,) T.,) Umetsu,) K.,) Tsukaguchi,) H.,) and) Hayasaka,) K.) (2013).) INF2) mutations) in) Charcot1Marie1Tooth) disease) complicated) with) focal) segmental) glomerulosclerosis.)Journal)of)the)peripheral)nervous)system):)JPNS!18,)97198.) Tzima,)E.,)Irani1Tehrani,)M.,)Kiosses,)W.B.,)Dejana,)E.,)Schultz,)D.A.,)Engelhardt,)B.,) Cao,)G.,)DeLisser,)H.,)and)Schwartz,)M.A.)(2005).)A)mechanosensory)complex)that) mediates)the)endothelial)cell)response)to)fluid)shear)stress.)Nature!437,)4261431.) Vartiainen,)M.K.,)Guettler,)S.,)Larijani,)B.,)and)Treisman,)R.)(2007).)Nuclear)actin) regulates)dynamic)subcellular)localization)and)activity)of)the)SRF)cofactor)MAL.) Science!316,)174911752.) Vedula,)S.R.,)Leong,)M.C.,)Lai,)T.L.,)Hersen,)P.,)Kabla,)A.J.,)Lim,)C.T.,)and)Ladoux,)B.) (2012).) Emerging) modes) of) collective) cell) migration) induced) by) geometrical) constraints.)Proc)Natl)Acad)Sci)U)S)A!109,)12974112979.) Wallar,) B.J.,) Deward,) A.D.,) Resau,) J.H.,) and) Alberts,) A.S.) (2007).) RhoB) and) the) mammalian)Diaphanous1related)formin)mDia2)in)endosome)trafficking.)Exp)Cell) Res!313,)5601571.) Walter) F.,) P.B.) (2003).) Medical) Physiology:) A) Cellular) And) Molecular) Approach.) 122 Elsevier/Saunders!pp.!1,300!ISBN:!1[...]... in specialized cellular modules The schematic indicating their cellular functions and localizations is shown in Fig 1-2A 1.1 .2. 2 .2 Actin) disassembly1promoting)factors) Another kind of actin regulators promotes actin disassembly Actin depolymerizing/severing factors and some capping proteins can be classified into this group Actin depolymerizing factor (ADF) or the cofilin protein family is one of the. .. Welch, 20 10) (B) Control of actin dynamics by cofilin phospho -regulation, adapted from (Mizuno, 20 13) Cofilin is activated by slingshots via calcineurin when calcium concentration increases It is deactivated when phosphorylated by the LIM kinases 9 1.1 .2. 2.3 G 1actin) binding)proteins) Actin monomer binding proteins contribute to maintaining the physiological F-/G -actin homeostasis Thymosin-β4 and profilin... calmodulin-dependent signaling in muscle cells (Kamm and Stull, 1989) Calcium is known to induce actin disassembly by modulating actin binding proteins For example, the actin depolymerizing factor cofilin is one of the effector proteins regulated by calcium (Fig 1-2B) Gelsolin is another calcium-regulated protein (Gremm and Wegner, 20 00; Yin and Stossel, 1979) The binding affinity of gelsolin to F -actin increases... proximal to their catalyzing domain FH2, WH2 or EVH2 (Chesarone et al., 20 10; Krause et al., 20 03; Xue and Robinson, 20 13) Therefore, by providing actin monomers in close proximity, profilin can increase the efficiency of actin assembly by these factors 1.1 .2. 2.4 Calcium )regulation) of) actin) Intracellular calcium regulates actin dynamics from many aspects The most commonly known example is the actomyosin contraction... developed a variety of coordinators and pathways that spatiotemporally regulate actin dynamics as a whole Here, I briefly review the regulation of actin by actin assembly and disassembly factors, G -actin binding proteins, and calcium ions 1.1 .2. 2.1 Actin) assembly1 promoting)factors! One group of actin regulators facilitates actin assembly This group of proteins mainly contains actin nucleation and elongation... perinuclear actin remodeling 59! Figure 3-5 Effects of calcium drugs on perinuclear actin remodeling 60! ix Figure 3-6 Effects of actin perturbations on perinuclear actin remodeling 63! Figure 3-7 Effects of inhibitors of Arp2/3, Rho and ROCK on the perinuclear actin remodeling 64! Figure 3-8 Nesprin 2 and Filamin A are dispensable for perinuclear actin remodeling ... 3-9 Roles of INF2 in perinuclear actin remodeling 69! Figure 3-10 Ultrastructure of perinuclear actin upon A23187 stimulation 72! Figure S3-1 Working hypothesis: formation of the perinuclear actin structure 77! Figure 4-1 Accumulation of mDia2 to the nuclear envelope 83! Figure 4 -2 mDia2 is localized to the cytoplasmic side of NE 85! Figure 4-3 Co-localization of mDia2 with... 20 00) Thymosin-β4 acts as a sequestering protein that keeps G -actin from polymerization Profilin, in spite of sequestering, can also shuttle G-actins from thymosin-β4 to the barbed ends of actin filaments (Pollard et al., 20 00) Profilin binds to proline-rich sequences, which can be found in many actin binding proteins (Xue and Robinson, 20 13) For example, formins, WASP and Ena/VASP contain proline-rich... regulates the actin cytoskeleton as a whole 1.1 .2. 3 Perturbation of actin dynamics in research experiments Actin- binding drugs have been widely used to interfere with actin dynamics in research experiments Cytochalasin and latrunculin are two examples of drugs that inhibit actin polymerizing activity, whereas their working mechanisms are distinct The cytochalasin binds to the barbed ends of actin filaments... regions The tandem formin homology domains, FH1 and FH2, localized in the carboxyl terminus (C-terminus), build up the core and functional regions While FH2 domain catalyzes actin polymerization, FH1 binds to profilin, who forms complex with G -actin and recruits substrate for the actin assembly by FH2 domain C-terminal to FH2 domain includes the diaphanous autoregulatory domain (DAD) The amino terminus . polymerization 13! 1 .2. 1! Autoinhibition and activation of formins 14! 1 .2. 2! Regulation of cytoskeleton by formins 18! 1 .2. 3! Cellular functions of mDia and INF2 20 ! 1.3! The perinuclear actin and nuclear. activation induces reversible perinuclear actin polymerization ……………………………………………………………………. 52! 3 .2. 2! The role of calcium 57! 3 .2. 3! The role of actin dynamics 61! 3 .2. 4! Dispensability of Nesprin 2 and. required for the perinuclear actin assembly. The perinuclear actin rim structure co-localized with INF2 upon stimulation, and INF2 depletion resulted in attenuation of the rim formation. A mathematical