Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ

Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ

B ộ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI BỘ MÔN : VÔ Cơ - HOÁ LÝ PHAN TIẾN Lực THỬ NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG SELEN TRONG NẤM MEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP c ự c PHỔ (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ 1999 -2004) Giáo viên hướng dẫn: PGS. TSKH. LÊ THÀNH PHƯỚC Th. s. HOÀNG THỊ TUYẾT NHUNG Nơi thực hiện : Bộ môn Vô Cơ - Hoá Lý Thời gian thực hiện : 2/2004 - 5/2004. HẢ NỘI, 5-2004 \ ■ ì » , Ỷ - LC ÚQ, / LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tói: PGS.TSKH : LÊ THÀNH PHƯỚC Th.s : HOÀNG THỊ TUYẾT NHUNG Đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em khắc phục những khó khăn để hoàn thành khoá luận này. Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Vô cơ - Hoá lý đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khoá luận. HÀ NỘI: 5/2004 Sinh viên Phan tiến Lực 3.1.3. Xử lý dụng cụ 15 3.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét 16 3.2.1. Kết quả khảo sát chọn thông số cho phép đo 16 3.2.2. Kiểm tra độ lặp lại của máy với bộ thông số đã chọn 16 3.2.3. Khảo sát khoảng tuyến tính, lập đường chuẩn 18 3.2.4. Định lượng selen trong nấm men theo phương pháp đường chuẩn 21 3.2.5. Định lượng selen trong nấm men theo phương pháp thêm chuẩn 24 3.2.6. Khảo sát độ đúng (độ thu hồi) bằng phương pháp thêm 28 3.3. Bàn luận 30 4. Kết luận và đề nghị 31 5. Tài liệu tham khảo 33 6. Phụ lục CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT AAS : Atomic Absorption Spectophotometry - phổ hấp thụ nguyên tử. DPP : Differential pulse polarography- Cực phổ xung vi phân. DME : Dropping Mercury electrode - Điện cực giọt thuỷ ngân. E1/2 : Half-wave potential - thế bán sóng. SQW : Square Wave - sóng vuông. HDME : Hanging Mercury Drop Electrode - Điện cực giọt thuỷ ngân treo, ppb : part per billion - phần tỷ. ppm : part per million - phần triệu. l.ĐẶT VẤN ĐỂ Ngày nay, selen được coi là nguyên tố vi lượng rất quan trọng đối vói cơ thể con nguời. Enym Glutathion peroxydase chứa selen có vai trò cực kỳ quan trọng, nó loại bỏ gốc tự do, bảo vệ màng tế bào và ADN. Enzym này có nhiều ở gan để hoá giải các chất độc, ồ cơ tim để bảo vệ các tế bào có cường độ hoạt động lớn. Selen có chức năng quan trọng trong qúa trình hô hấp tế bào vì liên quan đến sinh tổng hợp Coenzym- Q. Sự thiếu hụt selen trong dinh dưỡng sẽ có nguy cơ dẫn đến hàng chục loại bệnh tật: ung thư, tim mạch, lão hoá sớm Tuy nhiên, cũng như các nguyên tố vi lượng khác, tác dụng sinh học của selen phụ thuộc vào liều lượng. Ở liều cao selen có thể gây độc, vì vậy cần phải xây dựng phương pháp tin cậy để xác định selen có trong các chế phẩm bổ sung. Để định lượng selen có thể sử dụng nhiều phương pháp, trong đó phương pháp cực phổ là phương pháp có nhiều ưu điểm. Cùng với sự phát triển của các phương pháp phân tích khác, phương pháp cực phổ ngày càng được hoàn thiện và có nhiều ưu điểm về độ nhạy, tính tối ưu của phép đo, thòi gian thực hiện phép đo ngắn. Đặc biệt là việc vi tính hoá toàn bộ qui trình và kết quả đo với phần mềm vi tính chuyên dụng đã đưa tới những biến đổi sâu sắc trong kỹ thuật cực phổ. Với mong muốn bước đầu làm quen và sử dụng máy cực phổ VA 757 Computrace để đánh giá hàm lượng Selen trong nấm men, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Thử nghiệm định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ”, với 2 mục tiêu chính: 1- Nắm được cách sử dụng máy cực phổ với kỹ thuật đo xung vi phân có phần mềm vi tính chuyên dụng. 2- Áp dụng khả năng của máy để định lượng selen trong nấm men. 2. TỔNG QUAN 2.1. Đại cương về nguyên tố selen [3], [13], [14]. • Selen là nguyên tố đã được Berzelius phát hiện năm 1817. Trong bảng tuần hoàn các nguyên tố selen ở trong nhóm 6A cùng vói oxy, lưu huỳnh và telu. Cấu tạo lớp điện tử ngoài cùng của selen là: 4s24p4 [14]. Về tính chất hoá học Selen rất giống lưu huỳnh. Trong hoá học vô cơ lưu huỳnh và selen đều thể hiện hoá trị -2, 4, 6 ứng với các hợp chất sulfua và selenua, sulfit và selenit, sulfat và selenat [3]. Vói nhiều hợp chất hữu cơ của lưu huỳnh, selen có thể thay thế vị trí của lưu huỳnh trong các hợp chất đó cho những hợp chất tương tự của selen như thioure và selenoure, cystein và selenocystein, methionin và selenomethionin, các enzym có nhóm -SH tương tự như enzym chứa -SeH • Selen thâm nhập vào cơ thể con người chủ yếu thông qua thức ăn, do đó khẩu phần selen phụ thuộc vào hàm lượng nguyên tố này trong ngũ cốc, rau cỏ, trong cá, trong thịt gia súc và gia cầm .[3]. Selen phân tán trong đất đá, thường lẫn chung vói quặng lưu huỳnh (dạng sulfid, selenid). Chu sa, thần sa dùng trong đông y có chứa selen. Nước khoáng một số vùng có hàm lượng selen cao. Trong thực vật, selen thường tập trung trong các cây họ Đậu, họ Cà phê, trong lúa mì, cây xấu hổ, cây nhàu, cây keo dậu, cây bakích và một vài loài nấm. Tuy nhiên selen có tập trung cao trong những cây ấy được hay không còn phụ thuộc vào điều kiện thổ nhưỡng và môi trường. Trong động vật, selen tập trung nhiều nhất ở da, gan các loài cá, đặc biệt là ở cá ngừ. Vì thế mỡ cá, dầu gan cá có hàm lượng selen lớn. Các loài động vật khác có hàm lượng selen nhỏ và không ổn định [3]. 2.2. Vai trò sinh học của Selen [3], [14]. Trước đây selen được coi là nguyên tố có độc tính cao vì trên những vùng đất kiềm giàu selen thường gặp một số bệnh ở súc vật và người (rụng lông, yếu cơ ). Thế nhưng từ năm 1958 người ta đã nhận ra lợi ích của selen đối với sức khoẻ con người và động vật, khi mà Schwarz chiết ra từ thận động vật một yếu tố chứa selen có tác dụng cực mạnh điều tri thoái hoá hoại tử gan [3]. Một trong những chức năng quan trọng nhất của selen là vai trò của nguyên tố này trên hệ thống enzym của cơ thể. Selen có trong thành phần của nhiều enzym, tạo ra các nhóm chức -S-SeH, -S-Se-S, là những tâm hoạt động sinh học mạnh. Trong hệ thống chống gốc tự do của cơ thể, hệ enzym Glutathion peroxydase chứa selen có vai trò cực kỳ quan trọng. Nó có mặt trong mọi tế bào để cùng enzym SOD loại bỏ gốc tự do, đặc biệt là phá huỷ H20 2, dập tắt các gốc Ư, LOO* của acid béo, bảo vệ màng tế bào và ADN. Glutathion peroxydase chứa selen đặc biệt tập trung nhiều ở gan để hoá giải các chất độc, ở cơ tim để bảo vệ các tế bào có cường độ hoạt động lớn [14]. Vai trò của selen trong việc ngăn chặn và điều trị ung thư đã được phát hiện vào khoảng những năm 1970. Nhiều nhà khoa học đã khẳng định khẩu phần ăn có hàm lượng selen đủ sẽ làm giảm tỷ lệ ung thư tuyến tiền liệt, bàng quang, tuỵ tạng và ung thư da. Năm 1911, Wasserman đã chữa khỏi một số ca ung thư vú ở chuột bằng cách tiêm hợp chất Seleneosin. Tác dụng của selen đối với bệnh tim mạch được thể hiện trong bệnh Keshan hay còn gọi là bệnh cơ trắng. Vì thiếu selen đã gây ra biến đổi thành phần đạm của cơ tim, kèm theo sự tăng hoạt độ của Collagenase, đạm của cơ tim dần dần bị thay thế bởi đạm của mô liên kết. Triệu chứng điển hình của bệnh cơ trắng là suy tim đột ngột trong các trường hợp cấp tính. Việc sử dụng selen để điều trị bệnh cơ trắng đã cho kết quả tốt. Hiện nay có nhiều bằng chứng cho phép kết luận selen là một yếu tố quyết định khả năng chống đỡ của cơ thể đối với hiện tượng nhiễm khuẩn. Selen xúc tác cho quá trình tổng hợp các globulin miễn dịch cũng như các protein khác. Tác dụng phối hợp của Selen + Vitamin E đã làm tăng kháng thể của hệ miễn dịch lên nhiều lần. Người ta thấy rằng hàm lượng selen trong võng mạc cao hơn những tổ chức khác của cơ thể. Selen tham gia vào quá trình chuyển tín hiệu quang thành tín hiệu điện ở võng mạc. Selen đảm bảo sự toàn vẹn của thuỷ tinh thể. Những thí nghiệm của Sprinker, Newbome (1971), gây đục thuỷ tinh thể ở chuột bằng cách cho chuột ăn một khẩu phần thiếu selen, chứng tỏ điều này. Nếu cho chuột ăn thiếu selen nhưng thừa vitamin E bệnh đục thuỷ tinh thể vẫn xảy ra [3]. Bệnh loạn dưỡng gan xuất hiện trên cơ địa thiếu selen trong khẩu phần dinh dưỡng. Những triệu chứng của bệnh là mệt mỏi, lười hoạt động, thở dốc, lười ăn, mất trương lực, đi đứng không vững và run chân. Selen có tác dụng làm giảm độc tính nhiều ion kim loại nặng và nhiều loại chất độc khác. Tác dụng chống viêm của selen đã được khẳng định từ lâu. Dân gian thường dùng rễ cây trinh nữ, một dược liệu giàu selen để điều trị bệnh thấp khớp. Tác dụng của selen được tăng cường rõ rệt khi dùng kết hợp với Vitamin E, điều này do selen kết hợp với Vitamin E làm ổn định các thể tiêu bào Lysosome, mà sự không toàn vẹn của Lysosome được coi là nguyên nhân các rối loạn của hiện tượng viêm. Selen xúc tác cho sự tạo thành các gốc tự do bền (gốc Vitamin E = Tocopheryl, CoenzymQ, Flavin ) chống lại các gốc tự do độc hại. Vì vậy, vi lượng selen giúp ngăn ngừa nhiều dạng ung thư, bảo vệ hệ tim mạch, duy trì chức năng hoạt động tích cực của hệ miễn dịch, giải độc nhiều hoá chất. Khoảng 40 loại bệnh tật, đặc biệt là các bệnh ung thư, có thể phát sinh chỉ vì thiếu một liều vi lượng selen được cung cấp hàng ngày [14]. 2.3. Nhu cầu Selen của cơ thể [3], [15]. Ở hàm lượng thấp, selen có tác dụng rất tốt trong việc phòng ngừa bệnh tật. Nếu cơ thể thiếu selen sẽ dẫn tói sự phát sinh các quá trình bệnh lý. Nếu đưa vào cơ thể hàm lượng selen lớn quá mức cần thiết sẽ dẫn tói nhiễm độc [3]. Năm 1980, các nhà khoa học Mỹ đã xác định hàm lượng selen trong chế độ dinh dưỡng hằng ngày của người lớn là 50-200|ig. Kết quả này dựa vào thí nghiêm trên động vật vì thời gian đó những dữ liệu về nhu cầu selen ở người hầu như không có. Hàm lượng selen trong chế độ dinh dưỡng của phần lớn động vật vào khoảng 0,1 fig/g thức ăn khô. Từ đó thấy rằng một người mỗi ngày ăn 500g thức ăn khô thì được 50|ig selen. Hàm lượng selen trong chế độ dinh dưỡng thay đổi trong khoảng rộng từ 50-200|ig/ngày. Điều này là do sự không ổn định về sinh khả dụng của selen, và do chế độ dinh dưỡng của từng người, từng vùng khác nhau [15]. Trong những năm 1980, có một số công trình nghiên cứu về nhu cầu selen ở người. Các cuộc điều tra chỉ ra rằng bệnh cơ trắng không xuất hiện ở những nơi mà hàm lượng selen đưa vào cơ thể hằng ngày là 19fj.g ở nam giới và 13ịig ở nữ giới. Do vậy mà giá trị này được xem như là nhu cầu selen tối thiểu trong chế độ dinh dưỡng. Nhu cầu selen ở người cũng được xác định dựa vào chế độ ăn có hàm lượng selen cần thiết để tăng tối đa hoạt tính của enzym Glutathion peroxydase. Hội đồng nghiên cứu quốc gia Hoa kỳ đã chấp nhận lượng selen đưa vào cơ thể hằng ngày là 100|j,g với nam giới và 70|0,g với nữ giới. Đối với trẻ em hàm lượng Selen trong khẩu phần ăn là 10-15fig trong một ngày. Phụ nữ có thai và cho con bú thì hàm lượng Selen trong khẩu phần ăn tăng thêm 10-20Ịig trong ngày. 2.4. Một số dạng thuốc chứa Selen [15], + Granions de Sélénium (Pháp): ống 2ml chứa 0,96mg Selenium. + Celnium (Pháp): nang chứa 5ƠỊj.g selen dưới dạng men bia nuôi cấy ở môi trường đặc biệt đã hấp thu selen vô cơ trong môi trường nuôi cấy. + Selenium injectable (Pháp): lọ 10ml chứa 0,219mg Natriselenit tương ứng vói lOOỊLig nguyên tố selen. + Selsun: dịch keo chứa selen sulfid 2,5% bôi ngoài da để chống nấm, viêm bì da tiết bã nhờn. + Young ton: mỗi nang mềm có: Vitamin E : 400UI Vitamin c : 500mg Vitamin A : 5000UI Selen trong nấm men : 96,2mg (tương đương 50|Lig selen) + Belaf: mỗi nang mềm có: P-caroten: 15mg Vitamin E : 400UI Vitamin c : 500mg Selen trong nấm men : 92,6mg (tương đương 50jng selen) Ngoài ra còn có các chế phẩm Binacle, Saylom, Cigelton có thành phần tương tự, đều chứa 50jug selen. Chỉ định cho các dạng thuốc chứa selen là: Dự phòng và điều trị các bệnh tim mạch, cao huyết áp, viêm khớp, rối loạn thị lực, rối loạn chức năng tuần hoàn, bệnh cơ và da. 2.5. Selen trong nấm men [15]. Khi đưa selen như một nguyên tố vi lượng vào môi trường nuôi cấy, thì nấm men có khả năng đồng hoá chuyển selen vi lượng này vào thành phần các acid amin và protein. Dựa trên cơ sở đó, natriselenit đã được đưa vào môi trường nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae. 2.6. Các phương pháp định lượng Selen [3], [7], [12], [16]. [...]... máy cực phổ VA 757 Computrace (Metrohm/Thuỵ Sĩ) Sử dụng kỹ thuật cực phổ xung vi phân để định lượng selen trong nấm men Cụ thể là, khảo sát và chọn được bộ thông số định lượng, cho độ lặp lại tốt của thế bán sóng và cường độ dòng khuyếch tán 3 Đã ổn định được phương pháp vô cơ hoá đốt mẫu bằng khí oxy tinh khiết trong bình kín đem định lượng trên máy cực phổ VA 757 Computrace 4 Định lượng được 2 mẫu nấm. .. (trong công thức, C: Nồng độ selen xác định theo phương pháp thêm chuẩn) 3.2.5.2 Kết quả định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp thêm chuẩn Độ lặp lại của phép đo trên mẫu thực Tiến hành vô cơ hoá hai mẫu nấm men (đã được Viện kiểm nghiệm xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử): - Mẫu M8 17 Mỗi mẫu làm lặp lại 8 lần (n=8) Thực hiện đo trên máy cực phổ VA 757 Computrace theo các... V trước khi đo cực phổ m : Khối lượng mẫu (nấm men) cân đựơc (g) a% : Phần trăm độ ẩm của mẫu (nấm men) 106 : H ệ s ố ch u y ển đ ổi g thành Ịig (|LLg/g) 3.2.4.2 Kết quả định lượng selen trong nấm men theo phương pháp đường chuẩn (mẫu của Viện kiểm nghiệm) Độ lặp lại của phép đo trên mẫu thực Tiến hành vô cơ hoá hai mẫu nấm men (đã được Viện kiểm nghiệm xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên... cho vào bình định mức 50ml - Định mức tất cả đến 50ml - Hút 10ml dung dịch này pha thành 25ml bằng HC1 0,1M trong bình định mức 25ml - Dung dịch cuối cùng đem đo trên máy cực phổ VA757 Computrace - Hàm lượng selen trong nấm men được tính theo công thức: O^-IO6 Trong đó: X : Số )ug selen trong một gam nấm men khô (ịig/g) c : Nồng độ selen xác định theo đường chuẩn (g/1) V : Thể tích định mức bằng HC1 0,1M... điện cực vào lại dung dịch Phương pháp Vôn-ampe hòa tan có độ nhạy rất cao 2.7 Hệ máy cực phổ VA 757 Computrace [2], [7], [19] * Nguyên lý hoạt động [7], [19] Máy cực phổ VA 757 Computrace là sản phẩm kết hợp giữa toán, tin học và các kỹ thuật cực phổ Để tiến hành phân tích bằng phương pháp cực phổ, người ta dùng bộ thiết bị gồm một máy cực phổ tự ghi và một bình điện phân gồm hệ 3 điện cực: cực làm... thuỷ ngân) (s) c : Nồng độ chất điện hoạt trong dung dịch (mM) Giá tĩị Id tỷ lệ với nồng độ c Đây là phương trình làm cơ sở định lượng cho phương pháp cực phổ 2.Ó.5.2 Cực phổ sóng vuông [2], [7], [12] Cực phổ sóng vuông được Barker và Senkins nghiên cứu với mục đích loại trừ dòng tụ điện để tăng độ nhạy của phương pháp cực phổ Ở đây dòng tụ điện sẽ được loại trừ bằng cách máy chỉ ghi các tín hiệu đo ở... RSD% = 1,79 Phương pháp có độ lặp lại tốt Tương ứng ta có các đồ thị xác định theo đường chuẩn (phụ lục 2) So sánh 2 giá tri trung bình mẫu M817 do chúng tôi định lượng (đạt 627|ig/g) và do Viện kiểm nghiệm định lượng (đạt 817|xg/g), được: k2= — 100% =76,74% 2 817 -23- 3.2.5 Định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp thêm chuẩn 3.2.5.1 Kỹ thuật vô cơ hoá [12] Tương tự như mục 3.2.4.1 (trong công... RSD% = 1,23 Phương pháp có độ lặp lại tốt Tương ứng ta có các đồ thị xác định theo phương pháp thêm chuẩn (phụ lục 3) So sánh 2 giá trị trung bình mẫu M1 1 do chúng tôi định lượng (đạt 37 1015jig/g) và do Viện kiểm nghiệm định lượng (đạt 1317|ug/g), được: k3= — 100% =77,07% 3 1317 -25- 1(A) -300m -350m -400m -450m -500m -550m -600m U(V) Hình 4: Cực phổ đồ định lượng mẫu M13l7 bằng phương pháp thêm chuẩn... sánh 2 giá trị trung bình mẫu M817 do chúng tôi định lượng (đạt 627ịig/g) và do Viện kiểm nghiệm định lượng (đạt 817|j,g/g), được: k4= — 100% = 76,74% 4 817 -27- 1(A) - ì 20e-6 -1.00e-6 ■ Hình 5: Cực phổ đổ định lượng mẫu M8 7 bằng phương pháp thêm chuẩn 1 3.2.6 Khảo sát độ đúng (độ thu hồi) bằng phương pháp thêm [8], [9] Để tính độ thu hồi của phương pháp vô cơ hoá, tiến hành song song theo mục 3.2.4.1... thêm 0,05ml dung dịch selen chuẩn 500ppm (tẩm vào giấy lọc chứa các mẫu nấm men) rồi đem vỏ cơ hoá, làm lặp lại 5 lần, Nồng độ selen trong mẫu nấm men sau khi thêm lượng chuẩn trên vẫn nằm trong khoảng tuyến tính Tiến hành xác định nồng độ selen của các dung dịch trên máy cực phổ VA 757 Computrace, vói các thông số đã chọn Từ đó tính toán lượng selen thu hồi, kết quả được trình bày trong bảng 5: Bảng . 18 3.2.4. Định lượng selen trong nấm men theo phương pháp đường chuẩn 21 3.2.5. Định lượng selen trong nấm men theo phương pháp thêm chuẩn 24 3.2.6. Khảo sát độ đúng (độ thu hồi) bằng phương pháp. định lượng selen có thể sử dụng nhiều phương pháp, trong đó phương pháp cực phổ là phương pháp có nhiều ưu điểm. Cùng với sự phát triển của các phương pháp phân tích khác, phương pháp cực phổ. trong kỹ thuật cực phổ. Với mong muốn bước đầu làm quen và sử dụng máy cực phổ VA 757 Computrace để đánh giá hàm lượng Selen trong nấm men, chúng tôi đã thực hiện đề tài: Thử nghiệm định lượng