Sản xuất protein trong y học

Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành Khoa Công Nghệ Sinh Học SẢN XUẤT PROTEIN TRONG Y HỌC TS. TRẦN HOÀNG DŨNG Tháng 04/2012 Sản xuất protein trong y học 1 Chương 1 DNA - CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG Những khái niệm chính  Các thông tin di truyền được chứa trong các axit nucleic.  DNA là một sợi đôi xoắn song song ngược chiều nhau.  Cặp base (A với T và G để C) giữ hai sợi xoắn lại với nhau.  Sự sao chép DNA xảy ra thông qua việc tháo xoắn của các sợi DNA và sao chép trên mỗi chuỗi.  Các nguyên lý trung tâm của sinh học phân tử: DNA phiên mã RNA dịch mã Protein  Phiên mã là việc sản xuất một bản sao RNA của một trong các sợi DNA.  Dịch mã là giải mã của một phân tử RNA để sản xuất protein. Mỗi sinh vật sở hữu các thông tin cần thiết để xây dựng và duy trì một bản sao sống của chính nó. Các khái niệm cơ bản về di truyền và kết quả cho thấy các gen có thể được truy hồi trở lại năm 1865 và các nghiên cứu của Gregor Mendel được thảo luận bởi Orel (1995). Từ những kết quả của thí nghiệm của ông với đậu Hà Lan, Mendel kết luận rằng mỗi cây đậu Hà Lan có hai alen cho mỗi gen nhưng chỉ hiển thị một kiểu hình đơn lẻ. Có lẽ thành tích xuất sắc nhất của Mendel là khả năng xác định đúng một hiện tượng phức tạp mà không có sẵn những kiến thức về các quá trình phân tử liên quan đến việc hình thành các hiện tượng đó. Sự di truyền qua tinh dịch và trứng được biết cùng một thời điểm và Ernst Haeckel ghi nhận tinh trùng bao gồm phần lớn các vật liệu từ nhân, mặc nhiên đã công nhận rằng nhân đóng vai trò về tính di truyền. 1.1. Acid nucleic là vật chất của di truyền Ý tưởng cho rằng vật chất di truyền là chất truyền từ cha mẹ sang con theo quy luật tự nhiên đã được thừa nhận như là các khái niệm về sự di truyền đã được kế thừa trước đây. Cả hai protein và axit nucleic được xem là chất có vai trò quan trọng trong vật chất di truyền. Cho đến những năm 1940, nhiều nhà khoa học nghiên cứu về protein. Có hai lý do chính cho việc này. Thứ nhất, protein có nhiều ở các tế bào, mặc dù số lượng của một protein riêng biệt thay đổi đáng kể từ các loại tế bào khác nhau, hàm lượng protein tổng thể của tế bào nhất chiếm trên 50% trọng lượng khô. Thứ hai, axit nucleic có thể dễ dàng để vận chuyển các thông tin phức tạp, cần thiết để truyền đạt những đặc điểm của tính di truyền. DNA (deoxyribonucleic acid) lần đầu tiên được xác lập vào năm 1869 bởi nhà hóa học Thụy Sĩ Johann Friedrich Miescher. Ông tách nhân từ tế bào chất của tế bào và sau đó nó được tách bởi một chất có tính axit từ các nhân mà ông gọi là nuclein. Miescher cho thấy nuclein có chứa một lượng lớn phosphorus và không có lưu huỳnh, đặc tính mà có thể phân biệt chúng với protein. Từ những gì đã được chứng minh cho ta có một cái nhìn tổng thể, ông cho rằng "nếu muốn giả định rằng một chất đơn lẻ. . . là nguyên nhân của sự thụ tinh thì chúng ta nên chắc chắn rằng tất cả các suy nghĩ đầu tiên là về nuclein. Năm 1926 dựa trên ý tưởng về DNA bao gồm bốn nhóm nucleotide khác nhau, bằng cách xác định các loại hình liên kết mà nó đã tham gia liên kết với các Sản xuất protein trong y học 2 nucleotide, Levene và Simms đề xuất một cấu trúc của bốn nucleotide (Hình 1.1) để giải thích trình tự sắp xếp hóa học của nucleotide trong axit nucleic (Levene và Simms, 1926). Họ tìm thấy một nucleotide đơn của bốn loại đã được lặp đi lặp lại nhiều lần để tạo thành phân tử acid nucleic dài. Bởi vì cấu trúc của bốn nucleotide là tương đối đơn giản, axit nucleic không có khả năng làm biến đổi tính chất hóa học của các vật chất di truyền. Protein có chứa 20 acid amin khác nhau. Hình 1.1. Đề xuất của Levene Simms năm 1926 về các mô hình bốn nucleotide của cấu trúc axit nucleic. Vào thời gian đó mô hình này đã được đề xuất, người ta cho rằng acid nucleic của thực vật và động vật có thể là khác nhau và sự khác biệt giữa DNA và RNA chưa hoàn toàn được hiểu rõ. Năm 1928, Frederick Griffith tiến hành thí nghiệm bằng cách sử dụng một vài chủng vi khuẩn Streptococcus pneumoniae khác nhau (Griffith 1928). Một số các dòng sử dụng được gọi là dòng độc hại, chúng gây ra viêm phổi ở cả người và chuột. Một số dòng khác thì không gây độc và không gây bệnh. Cả hai dòng này có hình thái riêng biệt trong đó các dòng gây bệnh có một lớp vỏ polysaccharide bao quanh vi khuẩn và hình dáng bên ngoài mượt mà, tạo bề mặt nhẵn khi được nuôi cấy trên các tấm thạch. Vi khuẩn không độc thì không có lớp vỏ và tạo một vùng nhám trên cùng một mẫu. Các vi khuẩn dòng nhẵn thì nguy hiểm vì các viên đường cấu tạo từ lớp vỏ sẽ loại bỏ hệ thống miễn dịch của động vật nhiễm bệnh và do đó chúng có thể nhân rộng và gây ra bệnh viêm phổi. Các vi khuẩn gặp khó khăn khi không có các viên nang polysaccharide nên sẽ không có sự bảo vệ này, do đó chúng dễ dàng xâm nhập và phá huỷ hệ thống miễn dịch của vật chủ. Griffith biết rằng chỉ có vi khuẩn độc sống sẽ tạo ra bệnh viêm phổi khi tiêm vào chuột. Nếu giết chết vi khuẩn gây độc bởi nhiệt sau đó tiêm vào chuột, kết quả cho thấy không có bệnh viêm phổi cũng giống như vi khuẩn sống không độc, không gây bệnh khi tiêm vào chuột. Thí nghiệm quan trọng của Griffith (hình 1.2) liên quan đến việc tiêm vào chuột vi khuẩn sống không độc (avirulent) kết hợp với vi khuẩn độc xử lý nhiệt. Không có loại tế bào gây ra tử vong ở chuột khi họ tiêm, nhưng tất cả những con chuột thu được kết hợp tiêm thuốc thì sẽ bị chết. Các phân tích máu của những con chuột đã chết cho thấy một số lượng lớn các vi khuẩn độc sống khi nuôi trên các tấm thạch. Griffith đã kết luận rằng nhiệt giết chết vi khuẩn nhẵn và bằng cách nào đó chúng đóng vai trò chuyển vi khuẩn nhẵn vào vi khuẩn sống. Ông gọi hiện tượng này là hiện tượng biến nạp và cho rằng nguyên tắc biến nạp có thể là do một số thành phần của viên nang hay hợp chất polysaccharide là nguyên nhân để tổng hợp nên tác nhân gây bệnh, mặc dù ông lưu ý rằng các viên đường một mình nó không gây ra bệnh viêm phổi. Sản xuất protein trong y học 3 Hình 1.2. Các tính năng chính của thí nghiệm của Griffith, kết hợp với dữ liệu của Avery, MacLeod và McCarty để xác định DNA là nguyên tắc chuyển đổi từ Streptococcus pneumoniae. Griffith lưu ý rằng tiêm vi khuẩn nhẵn sống vào chuột dẫn đến sự hình thành của bệnh viêm phổi và cuối cùng đến cái chết của chuột. Xử lý nhiệt trước khi tiêm vi khuẩn không gây ra sự hình thành của bệnh. Không độc đối với chủng vi khuẩn, mà không gây ra các bệnh riêng của chúng, có thể được chuyển đổi bằng cách tiêm kết hợp với xử lý nhiệt vi khuẩn độc hại. Avery, MacLeod và McCarty xác định DNA là nguyên tắc chuyển đổi. Như vậy tác nhân nào đó từ phế cầu khuẩn đã biến nạp và làm cho phế cầu khuẩn từ R chuyển sang S. Người ta chứng minh được rằng :DNA tách từ vi khuẩn S nếu được đưa vào vi khuẩn R thì gây nên sự biến đổi kiểu R sang S, phát hiện này khẳng định DNA là vật chất di truyền. Trong hơn 10 năm trời kể từ sau thí nghiệm của ông, Oswald Avery cùng với Macleod và McCarty đã tiến hành trở lại thí nghiệm biến nạp này nhưng dùng trong in vitro. Năm 1944, Oswald Avery, Colin MacLeod và Maclyn McCarty xuất bản tác phẩm của họ cho thấy rằng các phân tử đóng vai trò là yếu tố cơ bản chuyển đổi là DNA (Avery, MacLeod và McCarty, 1944). Họ bắt đầu bằng cách nuôi số lượng lớn tế bào Streptococcus pneumoniae nhẵn. Các tế bào được thu nhận từ các môi trường nuôi cấy và sau đó giết chết bởi nhiệt. Sau đó đồng nhất và sử dụng chất tẩy rữa, họ thu được một phần chiết được kiểm tra bằng cách tiêm vào vi khuẩn sống theo những nguyên tắc biến nạp. Protein đã được gỡ bỏ từ dịch chiết của chloroform và polysaccharides được nhiều enzyme tiêu hóa và loại bỏ. Cuối cùng, những phần kết tuả với ethanol đã tạo ra một khối lượng xơ mà vẫn giữ lại khả năng gây ra biến nạp của các tế bào vi khuẩn sù sì (avirulent). Từ 75 lít môi trường nuôi cấy của các tế bào Sản xuất protein trong y học 4 vi khuẩn, sau quá trình thu được 10-25 mg từ các yếu tố hoạt động. Những thí nghiệm được thiết lập qua một nghi ngờ rằng nguyên tắc biến nạp là DNA. Khối lượng các sợi sơ được phân tích dựa trên tỷ lệ nitơ / phốt pho, được biểu hiện trùng khớp với tỷ lệ dự kiến với DNA. Để loại bỏ tất cả các chất gây ô nhiễm có thể xảy ra từ chúng khi giải phóng, họ tiến hành xử lí với nó với enzym thủy phân protein trypsin và chyomtrypsin và sau đó họ dùng phương pháp xử lí bằng cách tiêu hóa nó với một RNA enzyme tiêu hóa ribonuclease, nó sẽ bị phá hủy bất kỳ hoạt động còn lại của protein và RNA nhưng vẫn giữ lại các hoạt tính chuyển đổi. Việc xác nhận cuối cùng DNA đã được chuyển đổi bằng cách tiêu hóa dịch chiết với deoxyribonuclease, chúng sẽ bị phá hủy hoạt động chuyển đổi. Năm 1944, O.T Avery Mc Carti đã chứng minh được rằng tác nhân biến nạp là DNA. Phế cầu khuẩn bị xử lí bằng protease hoặc RNA-aza thì hoạt tính biến nạp vẫn còn: nhưng nếu phế cầu khuẩn S bị xử lí bởi DNA-aza thì hoạt tính biến nạp không còn nữa (Cơ sở và phương pháp phân tích sinh học phân tử, T.s Chu Hoàng Mậu, trang 9). Việc thứ hai chứng minh bằng chứng rằng ADN là vật liệu di truyền đã được cung cấp bởi các nghiên cứu về sự lây nhiễm của vi khuẩn Escherichia coli bởi một trong những virus phage T2 . Thường gọi đơn giản là thể thực khuẩn, virus bao gồm một lớp vỏ protein bao quanh một lõi của DNA (xem hình 1.3). Hình 1.3. Vòng đời của thể thực khuẩn T2. Trong quá trình xâm nhiễm, vi khuẩn bám vào các bề mặt của tế bào Escherichia coli. Truyền các thông tin di truyền nhưng không phải là toàn bộ nhân thể thực khuẩn được chèn vào trong vi khuẩn, nơi nó được nhân rộng. Các thể thực khuẩn được sao chép, lớp vỏ protein vẫn còn ở bề mặt của vi khuẩn. Sau khi tổng hợp các nhân thể thực khuẩn mới được sản xuất, ly giải tế bào vi khuẩn và các nhân thể thực khuẩn được giải phóng vào môi trường xung quanh. Trong những năm 1950 chúng ta ít được biết về thể thực khuẩn lây nhiễm. Thể thực khuẩn được biết là hấp thụ vào bề mặt của vi khuẩn, sau đó có một giai đoạn tiềm Sản xuất protein trong y học 5 ẩn của chúng khoảng mười phút trước khi các virus lây nhiễm bắt đầu được thực hiện, cuối cùng dẫn đến ly giải tế bào và phóng thích thể thực khuẩn. Alfred Hershey và Martha Chase lý luận rằng nếu họ biết bản chất của các protein thể thực khuẩn và acid nucleic vào đầu của quá trình xâm nhiễm, họ sẽ hiểu hơn về bản chất của những bước đầu tiến trình. Hình 1.4. Hershey -Chase thử nghiệm cho thấy acid nucleic là vật chất di truyền. Hershey và Chase tăng bacteriophages T2 là vi khuẩn có khả năng truyền tải P 32 trong môi trường (để đánh dấu phốt pho của axit nucleic) hoặc S 35 (để đánh dấu lưu huỳnh của các protein trong các chuỗi bên của các axit amin methionine và cysteine chứa lưu huỳnh). Họ sử dụng phóng xạ đánh dấu bacteriophages của chúng để lây nhiễm một môi trường nuôi cấy mới của vi khuẩn không đánh dấu. Sau khi ủ bệnh ngắn, vi khuẩn đã được thu nhận bằng cách ly tâm và đưa vào máy khuấy để tách các vi khuẩn đi từ thể thực khuẩn gắn liền với bề mặt của nó. Họ thấy rằng, khi DNA đã được đánh dấu, các chất đánh dấu được chuyển vào các tế bào vi khuẩn, trong khi các protein đánh dấu vẫn được gắn phage thực khuẩn. Họ kết luận là vật chất di truyền -tức là các vật chất truyền cho con cái - là nucleic acid. Họ sử dụng đồng vị phóng xạ P 32 và S 35 để thực hiện theo các thành phần phân tử của các thực khuẩn trong xâm nhiễm (Hình 1.4). Vì DNA có chứa phốt pho nhưng không chứa lưu huỳnh, P 32 hiệu quả với DNA và bởi vì các protein có chứa chứa lưu huỳnh nhưng không phốt pho, S 35 được đánh dấu lên protein. Nếu E. coli tế bào được nuôi cấy trong sự hiện diện của P 32 hoặc S 35 và sau đó bị nhiễm virus T2, các tổng hợp thực khuẩn mới sẽ có cả một lõi DNA được đánh dấu phóng xạ hoặc protein vỏ đánh Sản xuất protein trong y học 6 dấu phóng xạ tương ứng. Những thực khuẩn có đánh dấu có thể được phân lập từ môi trường nuôi cấy bị nhiễm bệnh và được sử dụng để lây nhiễm vi khuẩn khác không được đánh dấu. Hershey và Chase đánh dấu các thực khuẩn T2 với một trong hai chất phóng xạ S 35 hoặc P 32 và cho phép chúng hấp thu vi khuẩn không được đánh dấu. Các tế bào này sau đó được tách ra bằng cách ly tâm. Các tế bào được tạo huyền phù và việc dừng pha trộn để tách phần bên trong của thể thực khuẩn từ vi khuẩn bị nhiễm bệnh. Những phần không chứa các vật chất di truyền, mà được nhân rộng trong các vi khuẩn chủ. Hershey và Chase thấy rằng khoảng 80% của S 35 đánh dấu đã được gỡ bỏ từ các vi khuẩn trong khi chỉ khoảng 20% của P 32 đánh dấu đã được gỡ bỏ. Họ kết luận rằng hầu hết các DNA thể thực khuẩn xâm nhập vào tế bào và một dư lượng có ít nhất 80% protein có chứa lưu huỳnh của thể thực khuẩn vẫn còn ở bề mặt tế bào. Điều này cho thấy cùng với lúc đó Avery, MacLeod và McCarty cung cấp bằng chứng rằng DNA là phân tử có vai trò về tính di truyền học. Hershey và Chase hơi nghi nghờ về những phát hiện của họ và sau đó họ kết luận protein không có chức năng trong nhân thể thực khuẩn và DNA có một số chức năng (Hershey và Chase, 1952). 1.2 Cấu trúc của acid nucleid Như chúng ta đã thấy trong phần trên, các vật chất di truyền là DNA hay đúng hơn axit nucleic. Trong hầu hết các sinh vật, vật chất di truyền là DNA. Tuy nhiên, một số virus sử dụng RNA (ribonucleic acid) là những khối vật chất xây dựng cho hệ gen của chúng. DNA và RNA là những phân tử cao phân tử được tạo thành từ chuỗi tuyến tính của các tiểu đơn vị nucleotide. Mỗi nucleotide có ba phần: một gốc base nitơ, 5 nguyên tử carbon, đường và một nhóm phosphate (Hình 1.5). Sự kết hợp của các base và đường được gọi là một nucleoside, trong khi các base-phosphate- đường được gọi là một nucleotide. Chúng bao gồm đường 2’-deoxyribose, các nucleotide của DNA được gọi là deoxyribonucleotides, trong khi những thành phần của RNA có chứa các đường ribose được gọi là ribonucleotides. Các base của nucleotide có thể là bao gồm một vòng purine hoặc một pyrimidine . DNA và RNA được xây dựng từ hai vòng purine và hai vòng pyrimidine có chứa nucleotide. Cácvòng purin của cả DNA và RNA là như nhau bao gồm adenine (A) và guanine (G). Các vòng pyrimidine gồm cytosine (C) cũng được tìm thấy ở cả hai loại axit nucleic, trong khi pyrimidine gồm thymine (T) được giới hạn trong DNA, nó được thay thế bởi uracil (U) trong RNA. Hệ thống đánh số cho nucleotide được sử dụng rộng rãi trong các văn bản này được thể hiện trong hình 1.5. Mỗi nguyên tử carbon và nitơ trong vòng pyrimidine của cả hai và vòng purine được đánh số tương ứng 1-6 hoặc 1-9. Các nguyên tử cacbon của vòng đường hoặc là ribose hoặc deoxyribose được đánh số từ 1 đến 5. Như vậy, 2’-deoxyribose thiếu một nhóm hydroxyl thuộc carbon 2 của vòng đường.Các nucleotide riêng biệt được kết nối với nhau trong cả DNA và RNA thông qua gốc phosphate- đường kết nối từ các nhóm hydroxyl trên carbon số 3 của một nucleotide với nhóm phosphate vào carbon số 5 trên một nucleotide khác. Xem (Hình 1.6. )Hai nucleotide liên kết với nhau được gọi là một dinucleotide, ba được gọi là trinucleotide và nhiều kết nối trong một chuỗi dài được gọi là một polynucleotide. Sản xuất protein trong y học 7 Hình 1.5. Cấu trúc của các purin và pyrimidine các axit nucleic. Các base được đánh dấu bằng màu da cam và các nhóm đường được đánh dấu bằng màu xanh. Bên dưới là hệ thống đánh số được sử dụng trong văn bản này. Các nguyên tử của vòng purine được đánh số từ 1 đến 9 và các thành phần của vòng pyrimidine được đánh số từ 1 đến 6. Các nguyên tử của các đường được đánh số từ 1 đến 5. Hình 1.6. Việc liên kết của các nucleotide như adenine và guanine của một nucleotide. Các phosphate gắn với đường trên vòng của guanine được chỉ định là α, β hay γ. Trong sự hình thành của các dinucleotide, pyrophosphate (đại diện cho β và γ phosphate) là bị mất và các liên kết trong đó liên kết phosphodiester các hydroxyl 3’ Sản xuất protein trong y học 8 đến phosphate về các bon 5‘nguyên tử của đường. Các phân tử DNA luôn có một phosphate 5’tự do và hydroxyl 3’. Trong những năm 1950, nhà hóa học Erwin Chargaff thực hiện thí nghiệm tìm ra cấu trúc, thành phần hóa học của axit nucleic và ông nhận ra rằng axit nucleic chứa các thành phần tỷ lệ không bằng nhau của mỗi nucleotide. Chargaff tách DNA từ một số sinh vật, cả hai sinh chất và nhân điển hình (Chargaff, Lipshitz và Green, 1952, và cộng sự Chargaff, 1951; Zamenhof, Brawerman và Chargaff, 1952). Ông thủy phân DNA vào thành phần nucleotide của nó bằng cách xử lý với axít mạnh và sau đó tách các nucleotide bằng sắc ký giấy. Thí nghiệm của ông cho thấy các tỷ lệ tương đối của 4 base không bằng nhau nhưng cũng không phải ngẫu nhiên. Số lượng adenine (A) (residues )dư lượng trong tất cả các mẫu DNA đã bằng với số thymine (T) dư lượng, trong khi số lượng guanine (G) dư lượng ngang bằng với số cytosine (C) dư lượng (Bảng 1.1). Chargaff quy định rằng đối với bất kỳ loài nào thì: A = T và G = C Tổng các purin = Tổng các pyrimidine Tỷ lệ phần trăm (C + G) không nhất thiết phải bằng tỷ lệ phần trăm (A+T). Những phát hiện này mở ra khả năng cho sự sắp xếp chính xác của các nucleotide trong một phân tử DNA, nhưng ý nghĩa cơ bản của các T = A và G = C sự tương quan giữa C đã không được đầy đủ nhận thấy cho đến khi cấu trúc ba chiều của DNA được tìm ra . Như chúng ta sẽ thấy sau này, trong DNA thì A luôn cặp với T và G luôn cặp với C. Bảng 1.1 Nguyên tắc Chargaff’s. Tỷ lệ của các loại nucleotide được tách từ DNA của các nguồn vi sinh vật khác nhau.Trong khi tỷ lệ của các vòng của purine: purine và pyrimidine: pyrimidine biến thiên rộng, tỷ lệ của purine:pyrimidine được tìm thấy là hằng số không đổi. Giữa năm 1940 và 1953 nhiều nhà khoa học quan tâm trong việc tìm kiếm cấu trúc của DNA. Nhiễu xạ tia X như là một phương pháp xác định cấu trúc protein đã trở thành một kỹ thuật xác định. Nhiễu xạ tia X liên quan đến việc bắn một tia X tại một chuỗi chính xác của các phân tử hoặc tinh thể hoặc một sợi. Khi chùm tia X va chạm Sản xuất protein trong y học 9 vào một nguyên tử trong chuỗi đó chúng sẽ được nhiễu xạ và các chùm tia nhiễu xạ được phát hiện như những đốm trên phim của tia X. Phân tích các mẫu nhiễu xạ thì cho biết các thông tin về cấu trúc và hình dạng của các phân tử trong chuỗi. Đầu năm 1938 William Astbury áp dụng các kỹ thuật lên các sợi DNA. Tới năm 1947, ông đã phát hiện một chu kỳ trong DNA dài khoảng 0,34 nm. Giữa năm 1950 và 1953, Rosalind Franklin được cải tiến dữ liệu tia X từ các mẫu DNA tinh khiết cao. Công việc của bà khẳng định có tính chu kỳ và cho rằng cấu trúc của DNA bao gồm một số dạng xoắn. Franklin đã không đề xuất một mô hình cho cấu trúc của DNA. Thay vào đó, Linus Pauling và Robert Corey sử dụng dữ liệu của Franklin, cùng với điều đó của một người khác và đã đề xuất rằng DNA là một chuỗi xoắn ba với phosphate gần trung tâm của trục và các base ở bên ngoài (Pauling và Corey, 1953). 1.3 Sợi xoắn kép Franklin đã lưu ý rằng các sợi DNA có thể cho hai loại hình ảnh nhiễu xạ khác nhau và chúng phụ thuộc vào cách chuẩn bị và lưu trữ các mẫu. Điều đầu tiên (cấu trúc A) là các sợi tương đối mất nước, thứ hai (Cấu trúc B) đã được phổ biến trên một loạt các ghi nhận. Bà nhận thấy rằng sự thay đổi từ cấu trúc A đến cấu trúc B được đảo ngược, tùy thuộc vào mức độ mẫu hydrat hóa (Franklin và Gosling, 1953). Người ta cho rằng các dạng B của DNA là quan trọng trong cấu tạo sinh học. Dạng DNA (hình dạng A xoắn phải và hình dạng Z xoắn trái) chắc chắn vẫn tồn tại nhất định trong các điều kiện và có thể đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển của các tế bào. Ví dụ, một loại của các protein liên kết đặc biệt với Z-DNA gần đây đã được mô tả (Schwartz và cộng sự năm 2001). Ở đây chúng tôi sẽ tập trung vào các đặc tính và sự tương tác của hình dạng cấu trúc B của DNA. Năm 1953, James Watson và Francis Crick đã cố gắng để xây dựng mô hình phân tử của ADN và nhận ra rằng các cấu trúc Pauling -Corey là không chính xác, một số nguyên tử cần phải xích lại gần nhau hơn. Bằng cách kết hợp mẫu nhiễu xạ tia X của Franklin cùng với nguyên tắc Chargaff, Watson và Crick đã đề xuất mô hình xoắn kép vào năm 1953 (Watson và Crick, 1953a). Mô hình này thể hiện trong hình 1.7, nó có các tính năng chủ yếu dưới đây và một trong số đó đã được cập nhật một ít từ mô hình ban đầu trong ánh sáng của độ phân giải cao trong dữ liệu nhiễu xạ tinh thể tia X. (A) Hai chuỗi polynucleotide dài cuộn quanh một trục trung tâm, tạo thành một chuỗi xoắn kép hướng xoắn phải, điều này có nghĩa rằng các các vòng xoắn theo chiều kim đồng hồ khi nhìn từ trên xuống trục xoắn ốc. (B) Hai chuỗi được xoắn đối song song, có nghĩa là mỗi chuỗi có một hướng xoắn đặc trưng và chạy ngược chiều nhau. (C) Các base của cả hai chuỗi là những cấu trúc phẳng, nằm vuông góc với trục. Chúng được "xếp chồng lên nhau", cách nhau 0,34 nm và hướng vào bên trong của đường xoắn ốc này. (D) Base nitơ của các sợi ngược chiều nhau được liên kết với nhau bởi liên kết hydro. [...]... giá trị trong khoảng -100 đến -500 kJ mol-1 Liên kết hydrogen là dài hơn (khoảng 0,3 nm) và là y u hơn nhiều với giá trị  G trong phạm vi từ -10 đến-30 kJ mol-1 14 Sản xuất protein trong y học Khi tìm th y trong các chuỗi xoắn kép, hình thức adenine hình thành 2 liên kết hyđrô với thymine, và các hình thức cytosine ba liên kết hydro với guanine (xem hình 1.8) Trong khi một liên kết hydro duy nhất giữa... chuẩn (Taylor, Woods và Hughes, 1957), và b y giờ được coi như là cơ chế chung cho nhân đôi DNA 24 Sản xuất protein trong y học 1.8 DNA Polymerase Cả ở tế bào vi khuẩn và tế bào eukaryotic đều có nhiều enzyme DNA Polymerase E coli chứa 3 loại enzyme n y ( bảng 1.2 ) DNA polymerase I chủ y u tham gia vào quá trình sửa chữa DNA hơn là tham gia tái bản DNA polymerase II củng tham gia vào sửa chữa DNA, trong. .. protein n y thúc đ y sự nóng ch y của chuổi DNA xoắn, một quá trình cần thiếc để enzyme đọc trình tự base Sự nhân đôi ở prokaryotes và eukaryotes có thể đáp ứng cùng một chức năng tổng thể nhưng điểm gốc tái bản của tế bào prokaryotes sẽ không thay thế cho eukaryotes và ngược lại Khi xoắn được tháo ra 26 Sản xuất protein trong y học thì DNA polymerase có thể tiến đến và tổng hợp sợi DNA bổ xung Tuy... nông, trong khi các khe nhỏ hẹp (~ 0,12 nm) và sâu Các nhóm chính bao gồm chủ y u là nitơ và oxy nguyên tử của mỗi cặp base Ngược lại, khe nhỏ được che lấp bởi nguyên tử nitơ và oxy nói chung hoặc là các vòng purines hoặc pyrimidine Như v y, khả năng tương tác các rãnh lớn cho cho th y 13 Sản xuất protein trong y học nó phụ thuộc nhiều vào trình tự cơ bản của các rãnh nhỏ Phát hiện n y đã dẫn tới sự suy... nối lại với nhau thành một sợi hoàn chỉnh 25 Sản xuất protein trong y học Còn có một loại enzyme mà chúng ta sẽ được tìm hiểu trong chương sau là DNA polymerase phụ thuộc RNA gọi là enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) Enzyme được tìm th y ở một số virus gọi là retrovirus có vật chất di truyền là RNA thay vì DNA Sau khi nhiễm vào tế bào chủ các RNA n y được dùng làm khuôn cho sự tổng hợp phân... eukaryotes chưa được biết rõ 27 Sản xuất protein trong y học Hình 1.20 Chu kì tế bào eukaryotes Sau khi phân chia xong, tế bào phát triển trong phase G1 Sự tổng hợp DNA sau đó x y ra (S) trước khi bước qua phase G2 Cuối cùng, nhiễm sắc thể nhân đôi và tách ra riêng biệt sau đó x y ra phân chia tế bào Các giai đoạn của chu kì được điều khiển bởi proteins – cyclins và cyclindependent kinases (CDKs) Đ y. .. trên carbon 5 của một vòng deoxyribose Nucleotide bổ sung được tham gia vào chuỗi thông qua liên kết phosphodiester, mà liên kết các nhóm hydroxyl trên nguyên tử cacbon 3 của một đường với các phosphate trên nguyên tử cacbon 5 của một đường liền kề Chuỗi kết thúc bằng một nhóm hydroxyl tự do trên các nguyên tử cacbon 3 của đường cuối cùng 10 Sản xuất protein trong y học Hình 1.8 Các cặp base của DNA... 1993), cho th y sự tương tác giữa các điện tử lưỡng cực trong việc xếp chồng các bases sợi đôi xoắn kép và được trình b y sơ lược trong hình 1.11 Việc xếp chồng của các cặp bases trong sợi đôi DNA có tác dụng làm giảm sự hấp thu của riêng nucleotide do sự tương tác cạnh tranh của các cặp bases liền kề trong ngăn 15 Sản xuất protein trong y học xếp Ở dạng sợi đơn, không có cạnh tranh như v y x y ra và kết... tặng giải Nobel sinh lý y học cho những khám phá về sự kiểm soát chu kì tế bào 28 Sản xuất protein trong y học 1.10 Tái tổ hợp DNA thì không bao giờ được xem như là một phân tử tĩnh Nó thay đổi liên tục và một cơ chế được tạo bởi sự thay đổi n y được mang lại là tái tổ hợp (recombination) Sự tái tổ hợp là sự sắp xếp lại trên quy mô lớn các phân tử DNA Kiểu sắp xếp lại n y x y ra như là một hệ quả của... bởi RecA protein, dọc theo sợi đơn DNA liên kết với protein (SSB), là chất sẽ làm duỗi thẳng sợi DNA  ‘D-loop’ là được tạo thành sau khi sợi bị cắt một lần nữa bởi RecBCD endonuclease  Xuất hiện và kết thúc sự thay đổi trên sợi và được nối lại sử dụng DNA ligase Hình thức n y được gọi là Holliday junction 29 Sản xuất protein trong y học  Hình thức của Holliday junction tiếp theo là sự vận chuyển nhánh