Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc

Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc

Trang 1

BO Y TE

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOANG THI HANG

TINH CHE PAPAIN VA NGHIEN CUU UNG DUNG LAM THUOC

KHOA LUẬN TÓT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

GS.TS Nguyễn Xuân Thắng Nơi thực hiện :

Bộ mơn Hóa Sinh

Trường Đại Học Dược Hà Nội

Thời gian thực hiện: 02/2010 — 05/2010

090%

A.9.2040

HA NOI - 2010

Trang 2

LỜI CẢM ƠN

Với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin phép được gửi lời cảm

ơn chân thành nhất tới thay:

GS TS NGUYÊN XUÂN THÁNG TS NGUYÊN VĂN RƯ

Là người đã trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tơi hồn thành

khóa luận này

Đồng thời tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo, các

anh chị kỹ thuật viên trong bộ mơn Hóa sinh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi

giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo cùng toàn thê các cán

bộ trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình dạy bảo, giúp đỡ tơi trong suốt

q trình năm năm tôi được học tại đây

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, người thân, bạn bè,

đã luôn động viên và ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày 1§ tháng 05 năm 2010 Sinh viên

Trang 3

MỤC LỤC Danh mục chữ viết tắt

Danh mục các bảng Danh mục các hình

HẤT VĂN ĐỀ LuaeianeuesnnorestkgiogoiotsrroioiVg0/EAS0TLETA05000n000000nangnulssir 1 Cheney 1 TONG TU AN cesreccmmasmconnnnnnmncniamannncmnnennnen 2

A a ere WE ND NNNEGoeersesreesreeeeeosoaỷỶneỶneannrnerễasnenễrễneeeee-rsi 2 1,1,1 Khái diện DO GHSE cưa q—aqdưữGtGG2Ÿ0G181165181394604340153656455668 2 L.1.2.- Phan logi protease: scscnnseovsesenesnssorsserencarsonsansnnenasvensssonennepoucenonensnveess 2

1.1.3 Đặc điểm về cấu trúc của protease thực vật .- -<«2 3 1.1.4 Dac tinh cua protease thuc vat lam ct 4

1.2 Phuong phap chiét tách va tỉnh chế enzym . . -¿- ¿52 5s255£: 5

1.2.1 Chiét 00.8 3< ÔỎ 5

1.2.2 Một số phương pháp tỉnh chế enZym ¿- ¿+ 2 s2 +xz+e£szss2 6 1.3 Tổng quan về cây đu đủ và papain esssessessessssesssscsessessessenccessessesnee 8 13.1 ÐĐ điềm của cây đu G0 sccccncessssceras ncmnmmncncmmniviemmccerncssunmn 8 1.3.2 Đặc điểm của papain - 2-5 s+s£ e©x+xevz£xrErxrvevrrsrrersrrrrres 1] 1.3.3 Mot s6 tng dung cla papainh .cccccsessessesesecseessseeseeseeneseeseeneeneeses 15

Chương 2 ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên vật liệu thiết bị + - 2 5£ zEx£ xe £z£EzE£kzErzxrkrrersrrrrered 17

Trang 4

2.3.2 Phương pháp chiết tách và tỉnh chế papain từ nhựa của quả đu đủ WEEUcuueuauugtuuktuuukkgtuunkihythak6g189001016004000164)060510914006646700586100010690638040L9X1600)02340)50046046058601580565A I9 2.3.3 Xác định hoạt độ protease của chế phẩm - 23 2.3.4 Kỹ thuật định lượng protein bằng phương pháp Biuret 25 2.3.5 Phương pháp xác định một số đặc điểm của chế phẩm papain thu

CỔ vua no nt C01 001010001006536-6k001G0095963110/01010Á-.8109102502940121071811000000011000036 27

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KÉT QUÁ VÀ BÀN LUẬN 28

3.1 Xây dựng đường chuẩn protein - 2-25 szxezxezxezverrzrerxree 28 3.2 Xây dựng đường chuẩn lọc gel - 2 2 + +sS+zs++ezzzsezxzsee 29 3.3 Quy trình chiết tách papain từ nhựa quả đu đủ xanh tạo chế phẩm đông TT) ca Tin 0n 010500 0 ĐYNENEGIRSĐXĐDSSESEESAĐvV7R30000010/2907000100/00844010301001140/0001400 02004 32

3.3.1 Giai đoạn diêm tích tạo chế phẩm thơ A l . -5-.+ 5+ 32

3.3.2 Giai đoạn kết tủa lại bằng côn tạo sản phẩm v0 33

3.3.3 Giai đoạn lọc gel tỉnh chế papain . -¿- ¿5c s2csccscxecsecee 36

3.3.4 Đông khô và hoạt độ chế phẩm sau khi đông khô 38

3.3.5 Bước đầu tạo chế phẩm BH Hổ uauaaadedaaroaadaaeeseaeoeoaa 39 3.4 Nhan xét, ca na 40

3.4.1 Về chiết tách, tỉnh chế papain từ quả đu đủ xanh 40

3.4.2 Về việc lựa chọn phương pháp xác định hoạt độ protease của

KẾ BÊ ch eeaekkenadozabasiakbvt6403936406134G13G2160101028600310914101060180084000035408 43 3.4.3 Bước đầu tạo chế phẩm papain được dụng .- 2-2552 43

KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT kg ggd tán cgi00idtG2iiay8.30AnxSgszaae 45

) NA nẽếẽếếốẽ số 45

Trang 5

DANH MUC CHU VIET TAT

Ktb: Hé số trung bình

Crotein’ Nong độ protein

D: Mật độ quang

P: Khối lượng protein bị thủy phân

Kat: Don vị hoạt độ protease (1 Katal = 1 mol/s) HđP: Hoạt độ protease

HđP (%): Hoạt độ protein tính theo %

Hẻ riêng: Hoạt độ riêng của protein (nK/mg hoặc nK/mìl) MW: Khối lượng phân tử

Trang 6

DANH MUC CAC BANG

Bảng 3.1 Giá trị hấp thụ quang của dung dịch protein đã biết nồng độ Bảng 3.2 Kết quả rửa giải các protein bằng phương pháp lọc gel Bảng 3.3 Hàm lượng protein và HđP của nhựa đu đủ đã loại tạp

Bảng 3.4 Hàm lượng protein và HđP tủa bằng (NH,)zSO;¿ 45% độ bão hòa Bảng 3.5 Hàm lượng protein và HđP tủa NaC] tỷ lệ 250 g/lít

Bảng 3.6 Hàm lượng protein và HđP tua cồn lạnh 60 độ Bảng 3.7 Hàm lượng protein và HđP chế phẩm sau lọc gel

Bảng 3.8 Tóm tắt quá trình chiết tách và tỉnh chế papain từ nhựa quả đu đủ

xanh

Bảng 3.9 Hoạt độ của papain trước và sau đông khô

Bang 3.10 Một số tiêu chuẩn cơ bản của chế phẩm papain theo USP30 — NF25

Trang 7

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình anh cay du du (Carica papaya L., Caricaceae) Hình 3.1 Đồ thị tương quan giữa nông độ protein và mật độ quang Hình 3.2 Kết quả rửa giải các protein bằng phương pháp lọc gel Hình 3.3 Các giai đoạn tách chiết papain bằng muối vô cơ + cồn Hình 3.4 Giai đoạn lọc gel tỉnh chế papain

Trang 8

ĐẶT VÁN ĐÈ

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế phẩm enzym được nghiên cứu và sản xuất ngày càng nhiều Công nghệ enzym được ứng dụng trong hầu hết các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế Trong đó protease là enzym được ứng dụng

trong y học nhiều nhất

Papain (EC.3.4.22.2) là một protease được lấy ra từ nhựa của quả đu đủ xanh Trong nhựa đu đủ có chứa bốn loại protease là papain, chymopapain, protease III và IV Trong đó, papain có hoạt tính mạnh nhất và chiếm hàm lượng cao nhất Papain có tác dụng như pepsin của dạ dày và nhất là giống trypsin của tuyến tụy trong q trình tiêu hóa các chất thịt Papain cịn có tác dụng làm đông sữa và tác dụng giảm độc đối với toxin và toxanpunin Vì thế, trên thế giới papain được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong công nghệ dược phẩm

Nước ta là một nước nhiệt đới, sản lượng đu đủ hàng năm rất lớn nhưng

chủ yếu để phục vụ cho ngành chế biến thực phẩm còn việc tách papain từ nhựa quả đu đủ xanh ứng dụng trong ngành Dược còn hạn chế Để khai thác nguồn tài nguyên quý báu ấy nhằm mục đích phát huy cao nhất khả năng ứng dụng các hoạt tính sinh học của papain chiết tách từ nhựa quả đu đủ xanh trong y được, chúng tôi thực hiện đề tài “Tinh chế papain và nghiên cứu ứng dụng làm thuốc” với những mục tiêu sau:

1 Chiết tách và tỉnh chế được chế phẩm papain từ nhựa quả xanh

của cây đu đủ Việt Nam

Trang 9

Chuong 1 TONG QUAN

1.1 Đại cương vé protease 1.1.1 Khai niém protease

Protease 1a nhimg enzym xtc tac phan tmg thuy phan lién két peptid

(giữa các L — acid amin) trong chuỗi polypeptid hoặc trong phân tử protein thành peptid phân tử thấp và các acid amin

Protease còn gọi la proteinase hoac peptidase hoac C — N hydrolase Phản ứng thủy phân liên kết peptid có xúc tác của protease khéng cần cung cấp năng lượng từ bên ngoài [9]

1.1.2 Phan loai protease

Y Theo su phan loại quốc tế được chia protease được chia thành bốn phán nhóm phụ sau:

- Phân nhóm phụ 3.4.1: Gồm các aminopeptid do hydrolase xúc tác sự thủy phân liên kết peptid ở đầu mạch polypeptid

- Phân nhóm phụ 3.4.2: Gồm cac enzym peptidil aminoacid hydrolase (cacboxylpeptidase) xúc tác cho sự thủy phân liên kết ở đầu mạch C cua polypeptid

- Phân nhóm phụ 3.4.3: Gồm các enzym dipeptid hydrolase xuc tac cho sự thủy phân dipeptid

- Phân nhóm phụ 3.4.4: Gồm các enzym dipeptidil peptidhydrolase, các enzym này xúc tác cho sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch

v Theo các nhóm chức hoạt động trong trung tâm hoạt động người ta chia protease thanh 4 nhom:

- Nhóm serin: Có nhóm hoạt động là -OH của serin Các protease

này thường hoạt động mạnh trong vùng pH 7 tới I1

Trang 10

- Nhóm chứa kim loại: Có các kim loại tham gia vào phần hoạt động xúc tác, các enzym này thường hoạt động mạnh ở các vùng pH ó,Š tới 7,5

- Nhóm protease — acid: Thường có nhóm hoạt động là các nhóm cacboxyl Các enzym này hoạt động ở vùng pH l1,Š tới 5

v Dựa vào vùng pH hoạt động người ta phân ra: - Protease kiềm

- Protease trung tinh - Protease acid

Tuy nhiên sự phân loại này chỉ có ý nghĩa thực dụng vì pH tối thích của mỗi enzym lại phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như: bản chất của cơ chat

Dựa vào nguôn gốc người ta chia ra thanh 3 loai protease:

- Protease thực vật: Được tách ra từ thực vật Ví dụ: Papain

- Protease động vật: Được tách ra từ những phần khác nhau trong cơ

thể động vật

- Protease vi sinh: Là một hệ thống rất phức tạp gồm nhiều enzym giống nhau về cấu trúc trọng lượng và hình dạng phân tử, thường có trọng lượng phân tử thấp Nguồn gốc chủ yếu là từ nấm mốc, vi khuẩn, xạ khuẩn [8]

1.1.3 Đặc điểm về cấu trúc của protease thực vật

Protease thực vật hay được gọi là protease cystein vì chúng có chứa nhóm thiol của cystein trong trung tâm hoạt động Nhóm này có vị trí đặc biệt trong chức năng của phân tử enzym vì có khả năng phản ứng cao, tham gia

nhiều loại biến đổi hóa học: acid hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa và alkyl hóa

Trang 11

Protease cystein thường hoạt động mạnh ở pH trung tính, có tính đặc hiệu rộng Protease chỉ hoạt động được khi nhóm thiol trong trung tâm hoạt động không bị bao vây Do đó các chất như cystein, acid ascorbic ở nhiệt độ xác định thường có tác dụng làm bền và hoạt hóa enzym nay Protease cystein

bị ức chế bởi một số muối kim loại nặng, đặc biệt là các muối thủy ngân như

p- chloromercuribenzoat và các hoạt chất oxy hóa: hydrogenperoxid, iod EDTA (Acid ethylendiaminotetraacetic) có khả năng kết hợp với các ion kim loại trong dung dịch, vì vậy thường làm tăng độ bền của protease cystein [9] 1.1.4 Đặc tính của protease thực vật làm thuốc

Nhóm protease này bao gồm các enzym có ở thực vật bậc cao là: + Papain (EC.3.4.22.2) tir cay du du (Carica papaya) + Ficin (EC.3.4.22.3) ttr cay sung (Ficus sp.)

+ Bromelain (EC.3.4.22.4) tir cay dita (Anas comosus) Nhóm protease thực vật trên có những đặc tính sau:

v Sự tơn tại hoạt tính enzym đối với thời gian

Enzym protease thực vật tồn tại ở ba trạng thái khác nhau đó là dạng

hoạt động, dạng ồn định và dạng bị phá hủy cấu trúc khơng hoạt động

Hoạt tính của enzym dạng hoạt động chỉ tồn tại trong dung dịch nước

khoảng 30 ngày sau đó chuyền sang dạng enzym ơn định có thê tồn tại 2 năm Chế phẩm chứa protease thực vật như dạng viên, viên nang (capsule), dung dịch sau 2 năm bảo quản hoạt tinh papain giam 40% ở dạng capsule và 60% ở

dạng nước [6]

Y Anh huong cua chất hoạt hóa đối với hoạt dong xuc tac cua enzym

Chất hoạt hóa ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng xúc tác của các enzym

papain, ficin, bromelain Chat hoat héa thường là những chất khử, đặc biệt là

các chất có nhóm —SH như cystein, glutathion, DTT (dithiothretiol) Các chất

Trang 12

nhóm —SH cho protease thực vật mà không hề có tác động đến protease động vật [6]

v Ảnh hưởng của nhiệt độ với protease thực vật

Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động xúc tác của enzym, hầu hết

enzym mắt hoạt tính ở nhiệt độ cao Tuy vậy nếu enzym ở trạng thái khô, độ

âm dưới 5% thì khả năng chịu nhiệt cao hơn Nếu độ âm tăng lên, nhiệt độ có

thê làm mắt hoạt tính protease thực vật [6]

v Khả năng thủy phán của protease thực vật

Sự thủy phân của các enzym papain, ficin, bromelain đối với cơ chất là không giống nhau Papain thủy phân protein mạnh hơn bromelain Khả năng thủy phân protein của protease không chỉ phụ thuộc vào cơ chất mà còn phụ thuộc vào trạng thái của cơ chất, khi protein bị biến tính thì sự thủy phân tốt hon [6]

1.2 Phuong phap chiét tach va tinh ché enzym

Chiét tach enzym (protease) tir té bao thuc vat rat khé khan vi trong té

bào thực vật enzym cố định không tồn tại độc lập mà nó tồn tại cùng các

protein và các chất khác, chúng có tác động qua lại với nhau Mặt khác enzym còn chịu sự tác động của các yếu tố bên ngồi làm thay đổi tính chat, cau trúc

từ đó dẫn tới làm giảm hoạt tính hoặc mắt hoạt tính của enzym

1.2.1 Chiết tách enzym

Lựa chọn nguyên liệu là việc quan trọng trong kỹ thuật chiết tách enzym, trong đó lựa chọn vị trí giàu enzym và lựa chọn thời điểm có thê cho

hàm lượng enzym cao rất quan trọng Biện pháp cần thiết trước khi chiết tách

là bảo quản và sơ chế nguyên liệu Phá vỡ màng và vách tế bào bằng máy

Trang 13

tách enzym [18] Trong trường hợp cần phải loại acid nueleic có thê dùng một số muối hoặc enzym đặc hiệu [9]

Phương pháp kết tủa protein có thê dùng để tách protein hoặc để loại tạp ra khỏi chế phẩm Dung môi hữu cơ có thê sử dụng như alcohol, aceton Những muối vô cơ được dùng để chiết tách và tỉnh sạch enzym 1a NaCl,

(NH,);SO¿, K;SO¿ Ở nồng độ thích hợp các muối này có thể tách được

enzym ở dạng khá sạch Trong một số trường hợp có thê dùng cách xử lí nhiệt

thích hợp, nóng hoặc lạnh để tách enzym Dùng enzym đặc hiệu như protease,

lipase cũng đã được tiến hành trong một số trường hợp Một số tác giả cho rằng dùng chính enzym trong nguyên liệu đề phá vỡ cấu trúc tế bào, enzym sẽ được hòa tan vào dịch chiết (gọi là phương pháp “tự phân”) Ngày nay người ta có thể dùng phương pháp siêu ly tâm để loại tạp chất nhưng phương pháp

này đắt tiền và khó áp dụng với số lượng lớn Sử dụng phối hợp các biện pháp

trong chiết tách enzym cơ bản có thê loại được các tạp cơ học, mảnh vụn tế bào, pectid, lipid, phospholipid, protein khác ra khỏi dịch chiết trong giai đoạn này [9]

1.2.2 Một số phương pháp tỉnh chế enzym

Enzym thường chiếm một tỷ lệ rất nhỏ trong tế bào hoặc các cơ quan và có lẫn nhiều tạp chất, do đó việc tinh chế là rất cần thiết Trong những trường hợp nhất định cần phải tỉnh chế enzym để sử dụng cho mục đích riêng như

papain tỉnh khiết để tách mô tế bào [5]; tỉnh chế chymotrypsin để điều chế

thuốc tiêm (chống viêm, giảm phù nề) hoặc dùng trong nghiên cứu [12]

Trang 14

v Tỉnh chế enzym dựa vào tính chất hòa tan kết tủa

Kết tủa enzym bằng cách thay đổi mật độ điện tích, pH Enzym thường

được tủa ở điểm đẳng điện (pl) đặc trưng riêng cho từng loại Ta có thể dùng

muối, dung môi hữu cơ để kết tủa và tinh chế enzym tại điểm đẳng điện của

enzym đó Thay đổi sự hydrat hóa cũng có thê dẫn tới kết tủa enzym do làm thay đổi độ tan của protein, thường dùng các muối vô cơ (diêm tích) [9]

v⁄ Tỉnh chế enzym dựa vào kích thước phân tử của protein

Protein lớn nhất đi ra khỏi cột trước tiên vì phân tử lớn không di

chuyên vào không gian trong của gel như các phân tử nhỏ Do đó quãng

đường đi từ đỉnh đến đáy cột của phân tử lớn ngắn hơn phân tử nhỏ Phương

pháp này có ưu điểm là tiện lợi, nhanh, khơng địi hỏi lượng lớn và có thé tinh chế enzym trực tiếp từ sản phẩm thô

v Phương pháp siêu ly tâm

Dùng để xác định trọng lượng phân tử và tính đồng nhất của chế phẩm hơn là tinh chế Nguyên tắc là dựa vào tỷ trọng, kích thước và hình dạng của phân tử

v Phương pháp điện di

Thường dùng để xác định độ tinh khiết của protein hơn là đề tỉnh chế

Dựa vào sự khác nhau của mật độ điện, sự phân bố điện tích, hình dáng và

kích thước của các phân tử nên các protein khác nhau có độ di chuyên điện khác nhau Phương pháp này cũng dùng để tách một protein này ra khỏi protein khác [9]

v Phương pháp sắc ký ái lực

Tinh chế enzym dựa vào sự tạo phức hợp hấp phụ lập thể Đây là

phương pháp đặc hiệu để phân biệt các enzym Mỗi enzym tạo phức hợp hấp

phụ với chất có tính đặc hiệu lập thể, phù hợp với trung tâm hoạt động Chất

Trang 15

vì tương tác với các nhóm đặc hiệu đó nên enzym di chuyên chậm hơn các

protein khác Sau đó enzym được rửa giải ra khỏi cột bằng cách thay đổi nồng độ ion, pH hoặc hằng số điện môi của dung môi rửa giải

v Phương pháp sắc ký trao đổi ion

Tinh chế enzym dựa vào trao đổi ion Sử dụng các chất có khả năng trao đổi ion (cation hoặc anion) làm chất giá Cần lựa chọn chất giá ưa nước có điện tích ngược với điện tích trên protein Rửa giải bằng cách thay đổi hàm lượng muối hoặc pH của dung dịch Ưu điểm của phương pháp này là có thể dùng phân tách riêng enzym trong một hỗn hợp protein Có thê tái sắc ký để tăng độ tinh khiết cho enzym [9]

Trong thực tế người ta đã sử dụng các phương pháp hòa tan — kết tủa, hấp phụ, phương pháp trao đổi ion, lọc gel để thu các chế phâm enzym: papain, ficin, pancreatin Dùng phương pháp sắc ký ái luc dé tinh chế trypsin, chymotrypsin [12]

1.3 Tổng quan về cây đu đủ và papain

1.3.1 Đặc điểm của cây ẩu đủ

⁄ Đặc điểm về hình thái

- Tén khoa hoc: Carica papaya L

Thuộc họ Du đủ Caricaceae [3]

Trang 16

cam Trong ruột quả có rất nhiều hạt đen to bằng hạt tiêu, xung quanh có lớp

nhay [3]

Y Dac diém phân bố và thu hái của cây ẩu đủ

- Nguồn gốc cây đu đủ là vùng nhiệt đới châu Mỹ, sau được phổ

biến đi khắp nơi Tại Việt Nam, đu đủ được trồng Ở khắp nơi nhưng việc

trồng trên quy mô kỹ nghệ chưa được đặt ra

- Cây trồng bằng hạt, sau 8 — 10 tháng bắt đầu thu hoạch nhưng thu hoạch cao nhất từ năm thứ 3 trở đi [3]

v4 Thành phân hóa học của nhựa ẩu đủ

Trong nhựa đu đủ bao gồm: chất cao su, chất nhựa, các acid amin

(leucin, tyrozin), chất béo, acid malic, chất mỡ, protease (papain, chymopapain, protease III, protease IV) [3]

Y Céng dung cua cay du di theo y hoc cé truyén [3]

- Du đủ chín được coi là món ăn bồi bổ và giúp tiêu hóa các chất

thịt, các chất lòng trắng trứng

- Du đủ xanh nấu kỹ với thịt gà gần đây được một số đơn vị quân y

dùng đề điều trị loét dạ dày có hiệu quả Tuy nhiên có một số trường hợp

xuống cân Nhân dân còn dùng để nấu với thịt cứng cho chóng chín nhừ Quả

đu đủ xanh nghiền với nước cịn dùng để bơi mặt và tay chữa các vết tàn

hương ở mặt và tay

- Nhựa đu đủ dùng làm thuốc giun nhưng cần chú ý tránh nguy hiểm với trẻ em và người loét dạ dày Có khi được dùng bơi ngồi chữa chai chân

và hột cơm, bệnh sang thấp (ezema) hoac can tién (psoriasis)

- Tại Mỹ, nhựa đu đủ dùng trong kỹ nghệ chế bia, kỹ nghệ thực

phẩm, kỹ nghệ thuốc, kỹ nghệ tơ sợi để làm cho sợi khỏi co, kỹ nghệ làm da,

Trang 17

10

- Lá đu đủ dùng gói thịt gà cứng để khi nấu chóng mềm, dừ Nước

sắc lá đu đủ dùng để giặt những vết máu trên vải và quần áo hoặc rửa các vết thương, vét lở loét

- Thái lá đu đủ cho nhỏ rồi trộn với thóc cho ngựa, bị ăn để chữa

bệnh biếng ăn của bò ngựa Rễ đu đủ sắc uống làm thuốc cầm máu trong bệnh

băng huyết, sỏi thận

- Hoa đu đủ đực tươi hoặc phơi khô hấp với đường hoặc đường phèn dùng chữa bệnh ho, viêm phế quản, mất tiếng

Trang 18

I1

1.3.2 Đặc điểm của papain

1.3.2.1 Cau tao cia papain Y Cau tao héa hoc

Papain (EC.3.4.22.2) là một protease chứa 15,5% N và 1,2% S Phân tử papain cấu tạo từ 212 acid amin Cấu trúc phân tử của nó bao gồm một mạch polypeptid, dau N 1a isoleucine, dau C 1a asparagin Phan tir papain có 6 gốc cystein tạo thành 3 cầu disulfua ở các goc acid amin thir 22 — 23, 56 — 95 va 153 — 200 Ngoai ra no con chứa nhóm —SH tự do ở goc acid amin thir 25 [8]

Papain chua hoat héa cé thanh phan 1a hén hgp protein cystein disulfid [9]

v Cấu trúc không gian

Phân tử papain có dạng gần giống với hình cầu (kích thước 36Ä x 84A x 36Â) gồm hai phần lõm tách nhau ra, trên bề mặt là phần tâm hoạt động

Phần xoắn chiếm 20% toàn bộ các acid amin có trong phân tử, khu vực trung

tâm của phân tử là nhân ky nước Ngoài ra trong phân tử còn chứa một số cầu

nối nội phân tử được tạo thành bởi các nhóm guanidin của gốc arginin và nhóm cacboxyl Một cầu nối phân bố ở bên trong còn 4 cầu nối phân bố ở phía ngồi phân tử [21]

v Cấu trúc tâm hoạt động của papain

Vùng trung tâm của phân tử papain là một nhân kị nước có chứa 12 đến 14 gốc acid amin như leucin, valin, phenylanalin tương tác với nhau Trung tâm hoạt động của papain gồm nhóm thiol của cystein và nhóm nitrogen bậc

ba của histidin, liên kết với nhau bằng liên kết hydro Vùng trung tâm hoạt

động của papain chứa mạch polypeptid với các acid amin là:

Trang 19

12

1.3.2.2 Tính chất vật lý của papain

+ Bột màu vàng hay nâu nhạt tùy thuộc vào phương pháp sấy, không tan hầu hết trong các chất hữu cơ nhưng tan trong nước hay glycerin

+ Bên với nhiệt

+ Trọng lượng phân tử khoảng 23.900 Da hoặc 23.400 Da (do thiếu I

methionin)

+ Điểm đăng điện ở pI = 9,0

+ Hằng SỐ lắng S›o: 2,42 + 0,04 + Độ triền quang [œ]D: - 66,79 + Độ xoắn: 17%, + Vòng hiệu ứng coton: 290 nm + Thể tích riêng phần V(m[L/g): 0,724 + Trị số ma sát f/fo: 1,16

1.3.2.3 Tính chất thủy phân protein của papain

Papain thủy phân các protein thành các polypeptid và các acid amin, nó đóng vai trị như endopeptidase vừa như mot exopeptidase Cac endopeptidase thủy phân các protein thành các peptd là chính, cịn các exopeptidase thủy phân các peptid thành các acid amin [9]

So với protease nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác, papain có khả peptid cịn lại sau khi đã thủy phân bằng trypsin hay chymotrypsin [9]

1.3.2.4 Tính đặc hiệu cơ chất của papdin

Trang 20

13

các peptid dạng như Ala — Ala — Phe — Ala có phenylalanin nằm ở vị trí thứ hai trước đầu tận carboxyl thì khơng bị thủy phân bởi papain Chính vì thế các peptid này còn được sử dụng như chất kìm hãm cạnh tranh của papain [19] 1.3.2.5 Những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của papain

vˆ Các yếu tố hoạt hóa

Các chất đóng vai trị hoạt hóa papain là những chất khử như: cystein, glutathion, acid thioglycolic, Na2S2O3, bohydritnatr, Chất hoạt hóa pho biến nhất là cystein và cyanid [9]

Đề thu được hoạt tính enzym cao nhất thì trong qua trinh tach papain tir nhựa phải đồng thời có mặt trong dung dịch các chất khử và các chất có khả

năng liên kết với kim loại làm hỗn hợp chất hoat hoa [8]

v Các yếu tố kìm hãm

Các chất ức chế hoạt tính của papain là các chất có tính oxy hóa như: oxy, ozon, hydroperoxid, iodacetat, iodacetamid, p— chlomecurybenzoat, cystatin, N— (N— acetyl— 1— phenylalanyl) amino acetonitrile va cac hợp chat disulfua khác Trong đó papain rat dé mat hoạt tính khi có mặt hydroperoxyd

Papain và mercuripapain bị ức chế bởi dimedon, diketone hydrinden và N,N’— dimethyl burbitutric 6 nồng độ 5 x 10M [15]

Trong quá trình phản ứng liên kết với các chất tẩy rửa như SDS (sodium dodecyl sulfate) papain lién két manh hon va bi mat nhiéu hoat tinh hơn so với các protease khác Khi gây ức chế sự hoạt động của papain các chất này tham gia phản ứng với nhóm —SH của tâm hoạt động [ 16]

v Nhiệt độ

Papain có thể hoạt động ở khoảng nhiệt độ rộng tùy theo dạng chế phẩm Papain dạng hòa tan tham gia tổng hợp peptid ở 25°C — 65°C, trong khi

đó dạng enzym có định có thê hoạt động ở 37°C — 95°C Nhiệt độ hoạt động

Trang 21

14

động tối ưu của phản ứng thủy phân là 40°C, nhưng ở phản ứng tông hợp

peptid là 50°C Mặt khác nhiệt độ hoạt động tối ưu của papain dạng hịa tan là

65°C, dạng khơng tan là 75°C và dạng có định là 8§0°C Độ bền chịu nhiệt của

papain tương đối cao, phụ thuộc nhiều vào dạng chế phẩm Enzym hòa tan

bền ở nhiệt độ khoảng 5 — 66°C Papain ở dạng enzym cố định hoàn toàn bền

ở nhiệt độ 21°C trong 86 ngày và thậm chí ở 90°C enzym vẫn có khả năng

hoạt động nhưng thời gian phụ thuộc vào một sỐ yếu tố khác Đặc biệt chế

phẩm enzym dạng enzym hòa tan đặt ở 100°C trong ba ngày chưa có sự biến tính enzym; dạng enzym không tan đặt ở 50°C trong 35 ngày giữ nguyên hoạt

độ Sau khi đã tính sạch và ở trạng thái tỉnh thế thì papain có độ bên nhiệt

thấp hơn papain trong mủ nhựa bởi vì trong mủ nhựa cịn chứa các protein

khác có tác dụng bảo vệ nó [19] Như vậy dé khắc phục sự giảm hoạt độ

protease của papain đối với nhiệt cần chú ý đến dạng enzym, trạng thái hoặc

độ âm của chế pham [9] v pH mơi trường

Papain có độ bền pH môi trường trong khoảng pH rộng từ 4,5 tới 8,5 nhưng nó lại bị biến tính nhanh trong mơi trường acid có pH < 4,5 hoặc trong môi trường kiềm mạnh pH > 12 [8]

Papain bị mất hoạt tính trong đệm phosphat pH 5,0 va 6,8 va dém Tris pH 6,5 khi tăng áp suất lên tới §00 Mpa Cũng trong điều kiện như vậy ở

nhiệt độ 60°C thì việc mất hoạt tính xảy ra nhanh hơn ở nhiệt độ 20°C Việc

mất hoạt tính là do ion thionat ở tâm hoạt động bị oxy hóa thành (SO¿)“ và

(SO;)” [18]

Khi tiến hành kết tỉnh papain thì pH thích hợp để papain ồn định nhất là

pH 5 toi 6 [8]

Trang 22

15

papain phản ứng với casein ở pH tối ưu là 7,0 và 7,5 Papain phan ứng với albumin ở pH tối ưu là 5,2 tới 4.0 và 6,4 nhưng ở pH 5,2 thì phản ứng nhanh hơn

Với cơ chất tông hợp: Benzoyl— L- Arginin amid (BAA) thì pH tối ưu cho papain hoạt động là 5,0 tới 7,Š [8]

1.3.3 Một số ứng dụng của papain

[9] [8] [10] [14] [20] [22]

+ Trong y học:

- Papain thủy phân zymogen có trong ruột, dạ dày giải phóng ra các enzym có tác dụng tiêu hóa nên nó được dùng trong trường hợp thiếu dịch vị ở đạ dày hoặc dạ dày tiêu hóa kém Với một liều lượng nhỏ người ta dùng nó

đề chế biến thức ăn dễ tiêu hóa cho trẻ em

- Papain dùng để chống viêm loét mà không gây ra bệnh loãng xương,

xốp xương và suy giảm miễn dịch

- Papain cịn có thê phân cắt được các kháng thể đơn dòng (Mabs)Ÿ được dùng rộng rãi trong chân đoán và điều trị các bệnh ung thư mô

- Papain làm teo các sẹo, chỗ dính trong phẫu thuật động mạch; teo các

sẹo trong phẫu thuật mắt, giảm các tồn thương hữu cơ ở cột sống Papain giúp

tạo các đường dẫn máu sau khi mô các cơn kịch phát nhồi máu cơ tim

- Papain được dùng để điều chế chất tiêu dịch hoặc bỏ đạm thừa, làm sạch các vết hoại tử

- Papain dùng đề cắt các mạch cần thiết của protein trong nghiên cứu hóa sinh và cơng nghệ sinh học Ngoài ra nó cịn được dùng để chế pepton,

peptid làm môi trường nuôi cấy vi sinh

- Papain có tác dụng kích thích sự phát triên của các mô bị thương, tiêu

mủ tại các mô bị hoại tử; có tính chất sát trùng nên người ta dùng nó để điều

Trang 23

16

- Là enzym protease, papain có thể hủy diệt những ký sinh đường ruột;

có thể tiêu hóa và hủy diệt tắm chắn bảo vệ các virus, các khôi u ác tính và

một số khuẩn khác Khi tắm chắn này bị phá hủy, các khối u và các vi sinh

hồn tồn có thể bị hệ miễn dịch tiêu diệt

- Papain tham gia bán tổng hợp các enzym khác và còn được dùng kết

hợp với các enzym khác tạo thành chế phẩm mới có hoạt lực cao, có tính chất đặc hiệu lớn

+ Trong công nghiệp:

- Trong công nghiệp thuộc da papain dùng để làm mềm da bì và da

thuộc

- Trong công nghiệp dệt papain dùng để làm tăng chất lượng của len, thu hồi và xử lý len Tăng khả năng lên tơ của kén, tây keo tơ khi dệt lua rồi

đem nhuộm

- Papain dùng để xử lí mủ, tẩy các loại chăn đệm, trải giường, các dụng

cụ y học cũng như các vật liệu khác bị bân hữu cơ như: máu, mủ, chất đạm, vaccin,

- Trong công nghiệp hương liệu papain được dùng làm các loại mỹ phẩm dưới dạng thêm vào kem, sáp bôi lên biểu mô để làm sạch da mặt, tay các vết nhám đen

- Papain có tính chất thủy phân protein nên nó cịn được dùng để làm

mềm thịt và thu hồi protein từ phế liệu cá để chế biến thức ăn cho gia súc Papain dùng để chế biến các protid thực vật để làm tăng lượng aminoacid

- Trong công nghiệp thực phẩm papain được dùng làm chất ôn định cho

bia, nhất là khi pha bia có glutathiol và acid ascorbic Đồng thời nó cũng làm

Trang 24

17

Chương 2 ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu, hóa chất

2.1.1.1 Nguyén ligu

Dịch nhựa quả đu đủ xanh được lấy từ cây đu đủ có tên khoa học là

Carica papaya L., Caricaceae Trong nghiên cứu này nhựa đu đủ được lấy từ quả xanh của cây du đủ được trồng tại khu vực Trường đại học Nơng nghiệp

2.1.1.2 Hóa chất thuốc thử

v Pha dưng dịch đệm phosphat pH 5,8; pH 6,5; pH 7,0

- Pha dung dịch Na;HPO¿: Lay 11,36 g Na;HPO¿.12H;O hòa tan với 40 ml nước cất đun sơi để nguội trong bình định mức 1000 mi, sau đó thêm

nước đun sơi đề nguội vừa đủ 1000 mI

- Pha dung dịch KH;PO,: Cân §,40 g KH;PO/¿ hịa tan với 40 mÌ nước cất đun sôi để nguội trong bình định mức 1000 mi, sau đó thêm nước

đun sôi đề nguội vừa đủ 1000 ml

Y Dung dich casein 1%: Can chinh xac 1 g casein hoa tan trong 15 ml NaOH 0,1N trong cốc có mỏ ĐÐun cách thủy, khuấy đến tan, làm lạnh Dùng dung dịch KH¿PO¿ ở trên để điều chỉnh pH đến 7,0 Thêm dung dịch đệm pH

7,0 vào đến 100 ml Kiểm tra lại pH và điều chỉnh

v Dựng dịch cystein 0,04M: Cân 0,49 g cystein hydroclorid trong 90 ml

nước cất, chỉnh pH đến 7,0 bằng dung dịch NaOH IN, thêm nước vừa đủ 100

mÌ (pha trước khi dùng)

v4 Dung địch Tricloaecetie 10%

Y Dung dich EDTA 0,001M: Can 0.0744 g EDTA pha voi 200 ml nước cât

vˆ Dựng dịch NaOH 1M: Can 4 g NaOH pha với 100 mÌ nước cất 280 4

Trang 25

18

Y (NH4)2SO,, NaCl

Y Chymotrypsin, Vitamin B12, insulin

v Thuốc thử ŒGornal: Hòa tan 1,5 g CuSO¿.5H;O va 6,0 g Na, K tactrat

trong 500 mÌ nước cất Thêm 300 ml dung dịch NaOH 10% (30 g NaOH trong 300 ml nước cất), vừa thêm vừa lắc đều Thêm 1 g KI rồi thêm nước cất vừa đủ 1000 ml Lắc kỹ và bảo quản trong lọ nút kín, chú ý bỏ đi khi có cặn

Y Sephadex G75

2.1.2 Dụng cụ máy móc

- Máy đo quang phổ hấp thụ U — 1800 - May ly tâm lạnh Heraus 1SR

- Máy ly tâm thường

- Máy điều nhiệt

- Máy đông khô

- Dụng cụ thủy tính khô và sạch

- Cột sắc ký: buret 25 ml 2.2 Nội dung nghiên cứu

v Tách chiết và tỉnh chế papain từ nhựa quả ẩu đủ xanh: - Phương pháp diêm tích

- Phương pháp tủa bằng dung môi hữu cơ - Phương pháp lọc gel Sephadex G75

Định lượng protein — papain và xác định hoạt độ profease dựa trên nguyên tắc của phản ứng Biuret

v Tạo chế phẩm dược dụng từ sản phẩm enzym thu được

2.3 Phương pháp thực nghiệm 2.3.1 Phương pháp thu nhựa đu đủ

Trang 26

19

- Cây đang sinh trưởng tốt, không bị sâu bệnh, thân cây mập mạp

cho nhựa nhiều

- Lay nhựa ở những quả còn xanh, vỏ mịn, từ 0,3 đến Ikg, độ 10

tuân tuôi là tốt nhất

+ Thu nhựa vào trước lúc 8 giờ sáng mùa hè hoặc vào 9 giờ sáng mùa

đông, chất lượng nhựa phụ thuộc rất nhiều vào thời tiết (chưa kê chất lượng

giống cây) Vào mùa hè có nhiều mưa, nhựa đu đủ chứa nhiều nước hơn, vào mùa đông nhựa đu đủ đặc hơn và lượng nhựa ít hơn so với lượng nhựa lay vao mua hé [8]

+ Để yên cả quả đu đủ ở trên cây, lấy dao mạ sắc rạch 8 đến 10 rãnh dọc thân quả từ cuống xuống đáy quả, hứng nhựa chảy ra vào bát sành hoặc

bát nhựa, chờ độ 1 đến 1,5 phút sau khi nhựa không chảy nữa, tiếp tục thu

nhựa như vậy từ quả khác Sau khi rạch 1Š đến 20 quả và lấy nhựa như vậy mắt từ 25 đến 30 phút, quay lại thu nhựa ở quả rạch ban đâu, lúc ấy nhựa đã

đông trên các vết rạch, chỉ việc lay dao gạt nhẹ vào bát, các kĩ thuật được tiến

hánh nhẹ nhàng không làm xước lớp vỏ quả đề diệp lục không lẫn vào nhựa + Nhựa đu đủ sau khi thu nhanh chóng cho vào bảo quản trong tủ lạnh + Nhựa đu đủ chứa hỗn hợp enzym thủy phân protein rất mạnh, có tác dụng ăn da, do đó khi lấy nhựa phải đeo găng tay cao su, hết sức tránh nhựa bắn vào mắt

2.3.2 Phương pháp chiết tách và tỉnh chế papain từ nhựa của quả du di xanh

Trong nghiên cứu này để loại các protease tạp và các phân tử có trọng lượng phân tử cao khác ra khỏi papain trong nhựa đu đủ chúng tôi đã dùng phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính và dung môi hữu cơ Cụ

thê là chúng tôi đã dùng muối (NH¿)zSO¿ NaCl và dung môi hữu cơ là cồn để

Trang 27

20

2.3.2.1 Tách papain bằng phương pháp muối tách

Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH¿);SO¿ và NaCl dựa trên sự khác nhau về khả năng kết tủa protein enzym ở một nồng độ muối (tính theo phần trăm nồng độ bão hòa) Thường các phân tử protease trong dung dịch có hai loại tương tác protease — protease và tương tác protease — dung môi Sự có mặt của (NH¿);SO¿ trong dung dịch protease sẽ làm thay đổi cân bằng giữa

hai loại tương tác trên Ở một nông độ nhỏ muối (NH,);SO; sẽ làm cho

protein tan vào dung dịch nhiều hơn Khi nông độ (NH,);SO¿ tăng lên tới một giá tri nao do thi tuong tac protease — protease trdi hon va cac phan tu

protease bat dau két tia Gia tri nong độ muối (NH,);SO¿ gây nên kết tủa

protease tùy thuộc vào từng loại protease và người ta lợi dụng sự khác nhau này đề tách chọn lọc các protease ra khỏi nhau

Một tính chất khác của protease là tính tan của các protease sẽ thấp nhất trong dung dich tại điểm đẳng điện của chúng, người ta lợi dụng tính chất này

dé tiến hành kết tủa chúng tại giá trị điểm đăng điện đó Giá trị điểm đăng

điện có được bằng cách thay đổi pH của dung dịch chứa protease [8], [7] Trong quá trình kết tủa protease, để bảo vệ tâm hoạt động của chúng

người ta thường thêm vào dung dịch tách một chất có tính chất bù lại tâm hoạt

động bị mất đi trong quá trình tách loại Đối với papain người ta dùng cystein làm chất hoạt hóa bởi tâm hoạt động của papain có nhóm —SH và cystein cũng có chứa nhóm -SH

2.3.2.2 Tách papain bằng dung môi hữu cơ

Trang 28

21

dung môi — dung môi tăng lên và tương tác giữa các phân tử protease — protease với nhau tăng lên làm cho các phân tử protease có xu hướng co cụm

kết tủa lại với nhau

Với từng loại protease khác nhau nồng độ cồn ảnh hưởng tới tương tác của chúng cũng khác nhau hay nói cách khác chúng hoàn toàn kết tủa chọn lọc với nhau tùy thuộc vào nồng độ cồn khác nhau [8]

Tuy nhiên, đề tránh hiện tượng biến tính các prơtease việc kết tủa các protease thường được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ thấp Trong nghiên cứu này, còn được dùng làm dung môi hữu cơ để tách papain ra khỏi nhựa đu đủ 2.3.2.3 Phương pháp tỉnh chế papdain bang loc gel sephadex G 75

v Mục đích của phương pháp:

Trong phương pháp lọc gel, logarit MW (logarit khối lượng phân tử)

tỷ lệ thuận với Ve (thể tích rửa giải) Do đó nếu biết được MW của một chất

có thể dự đốn được thê tích rửa giải của nó để thu lấy chất cần thiết và loại đi

tạp chất (nếu có) v Nguyên tắc:

Sephadex được ngâm trương nở, sau đó được nhồi lên cột Lọc qua cột gel dung dịch các protein chymotrypsin, casein, insulin va vitamin B12 da

biết khối lượng tương ứng 25.000, 23.600, 5.700, 1.350 Da, để xây dựng

đường chuẩn phụ thuộc giữa khối lượng phân tử (MW) và thể tích rửa giải (Ve) Sau đó nạp dung dịch protein — papain để thu được các phân đoạn tương ứng với MW khoảng 23.400 Da

2.3.2.4 Phương pháp đông khô tạo chế phẩm papain thé

* Nguyên tắc:

Kết tủa protein — papain được pha loãng theo tỷ lệ thích hợp đề tạo

thành hỗn dịch Hỗn dịch này được đóng vào các lọ thủy tỉnh với thé tích nhất

Trang 29

22

phép nước chuyền trạng thái từ ran sang thé hoi mà không phải qua thé long trung gian

v Quá trình đơng khơ gơm 3 giai đoạn: đông lạnh, sấy sơ cấp, sấy thứ cấp - Giai đoạn đông lạnh: Trong giai đoạn này, sản phẩm được đóng

băng hồn tồn ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ eutecti (đối với dạng kết tỉnh) hay nhiệt độ chuyển đổi thủy tỉnh (đối với dạng vơ định hình) của hệ Đầu

tiên, các tỉnh thể nước đá được hình thành và tách khỏi dung dịch Phần dung

dịch chưa được đơng lạnh có nồng độ dược chất, tá được tăng dần, băng điểm

của nó giảm xuống và tiến đến nhiệt độ eutecti (hay nhiệt độ chuyên đổi thủy tỉnh) Cuối cùng các thành phần khác trong hệ kết tỉnh hoặc chuyền sang dạng

vô định hình Kết thúc quá trình, hệ tồn tại nhiều dạng khác nhau: tỉnh thể, vô

định hình hoặc cả tỉnh thể và vơ định hình

- Giai đoạn sây sơ cấp: Sản phẩm sau khi được đơng lạnh thích hợp được chuyền sang buông đông khô dưới điều kiện áp suất nhỏ hơn áp suất hơi nước đá (thường từ 0,05 - 0,20 mmHg hay 0,0665 — 0,226 mbar), nhiét độ condensor (nhiệt độ buồng ngưng) khoảng — 50°C, nhiệt độ của giá từ — 30 đến 10°C Trong điều kiện này, nước sẽ thăng hoa trực tiếp từ trạng thái răn sang trạng thái hơi không qua giai đoạn lỏng trung gian Quá trình nhận biết được bởi bề dày băng giảm trong khi bề dày của sản phẩm đông khô tăng lên

Ở giai đoạn này, nhiệt độ của sản pham phai thap hơn nhiệt độ phá vỡ cầu

trúc khoảng 2 — 5°C

- Giai đoạn sấy thứ cấp: Nhiệt tiếp tục được cung cấp cho sản phẩm

để loại bỏ hoàn toàn nước, không được đông lạnh và nước hấp phụ trên bé

Trang 30

23

2.3.3 Xác định hoạt độ protease của chế phẩm

Phương pháp xác định hoạt độ protease thường dùng hiện nay là dùng

một protein đã xác định làm cơ chất (casein, albumin, hemoglobin biến tính),

kết tủa protein bằng acid triloacetic, đo độ hấp thụ quang trực tiếp ở bước

sóng 280 nm hoặc với thuốc thử Biuret Một số phương pháp xác định hoạt độ

protease thường dùng là phương pháp Anson, Anson cải tiến, Biuret hoặc Lowry Cũng có thê có một số phương pháp riêng cho mỗi enzym trong đó sử

dụng một cơ chất đặc hiệu, hoạt độ protease được xác định bằng lượng cơ

chất còn lại hoặc sản phẩm được tạo thành [2], [9]

Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành đo hoạt độ protease dựa trên nguyên tắc của phản ứng Biuret

Nguyên tắc:

Dưới tác dụng của enzym protein bị thủy phân giải phóng các acid amin tan trong acid trichloacetic Phần protein còn lại tủa trong acid tricloacetic Tủa này phản ứng với thuốc thử Gornal tạo phức màu tím hồng Đo quang ở 550 nm, cuvet 1 em Dựa vào biểu đồ mẫu tính ra hoạt tính của enzym

v Tiến hành:

Trang 31

24

# Ông cơ chất Ông thir Ong Enzym

Hoa chat

(ml ) (ml ) (ml)

Casein 1% L5 1,5 0

Đệm phosphat pH 7.0 2 2 2

Cystein 0.04 M 0,5 0,5 0,5

Dung dich Enzym 0 0,1 0,1

Mat do quang DI D2 D3

Để I giờ ở tủ ấm 379C Sau đó cho vào mỗi ống 2,5 ml acid tricloacetic

10% Lắc đều để ở nhiệt độ phòng 10 phút, ly tâm lấy tủa Thực hiện phản

úng với 4 ml thuốc thử Gornal Để ôn định ở nhiệt độ phòng 30 phút, đo

quang ở 550 nm, cuvet 1 cm Dựa trên biểu đồ mẫu tính ra lượng enzym bị thủy phân

P=PI +P2 - P3 Trong đó:

P1: Lượng protein trong ống cơ chất P2: Lượng protein trong ống Enzym P3: Lượng protein trong ống thử

v Đơn vị hoạt tính:

+ Katal (K) và nanokatal (nK)

+ Katal là lượng enzyme thủy phân một mol cơ chất trong 1 giây ở điều

kiện xác định

+ Đơn vị enzym quốc tế (UI) là lượng enzym có khả năng xúc tác làm

Trang 32

25

v Công thức:

A.B.209.10°

dP = 536.105.M.t (nano Katal)

Trong đó:

HđP: Hoạt độ protease (nanokatal)

A: Lượng protein bị thủy phân (mg)

B: Độ pha loãng của dung dịch chế phẩm enzym

209: Số đoạn nói của casein

23600: Trọng lượng phân tử của casem t: Thời gian thủy phân (giây)

M: Số lượng chế pham enzym đem thử (g)

v Hoạt độ protein tính theo % (hoạt độ protein ttơng đối) được tính theo

cơng thức:

cơ chit Dens + D ening

D

HdP( %) = D

co chat

Trong do :

Deo chit : Mat dO quang cua ống cơ chất Dan; : Mật độ quang của ống chứng Duy : Mật độ quang của ống thử

2.3.4 Kỹ thuật định lượng protein bằng phương pháp Biuret

Các phương pháp định lượng protein thường dùng hiện nay là Kieldahl, Biuret, Lowry, đo quang trực tiếp và phương pháp cân Trong đề tài này chúng tôi sử dụng kỹ thuật định lượng protein — enzym bang phương pháp Biuret

Trang 33

26

Khi cho tác dụng với thuốc thử Gornal, protein (có liên kết peptid) tạo thành phức màu tím hồng Đo quang phổ hấp thụ, so với biêu đồ mẫu đề định lượng protein

v Mục đích của phương pháp

Xây dựng biểu đồ mẫu để định lượng protein bằng phản ứng Biuret

Dùng dung dịch protein đã biết nồng độ (casein 1%) làm dung dịch mẫu

Chứng minh mối quan hệ tuyến tính đồng biến của nồng độ protein và mật độ quang, làm cơ sở cho định lượng nồng độ protein của các dung dịch thử

v4 Tiến hành:

Thực hiện phản ứng:

Dung dich thu: 1 ml Thuốc thử Gornal: 4 mÌ

Lắc đều, để yên 30 phút, đo quang ở 550 nm, cuvet 1 em Kết quả thu

được dựa vào biểu đồ mẫu đề xác định hàm lượng protein v Tính kết quả:

+ Các hệ số protein K, là tỷ lệ giữa nồng độ protein (mg/ml) và độ hấp

thụ quang: _ Nong độ protein ` Mát độ quang + Tính hệ số trung bình Kạ: bin XK Kip =

+ Cơng thức tính nồng độ protein theo D (mật độ quang):

Trang 34

27

2.3.5 Phương pháp xác định một số đặc điểm của chế pham papain thu được

⁄ Xác định độ ẩm trong sản phẩm papain

Độ âm của sản phẩm được xác định bằng phương pháp cân, sây mẫu sản phẩm tới khối lượng không đổi ở 60°C Độ ẩm của sản phẩm được tính theo cơng thức:

X(%) = (m, — mị) : mạ

Trong đó:

X: Độ âm (%)

mạ: Trọng lượng mẫu trước khi sấy (g)

Trang 35

28

3.1 Xây dựng đường chuẩn protein

vˆ Tiến hành

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KÉT QUÁ VÀ BÀN LUẬN

Dùng dung dịch casein 1% là protein mẫu để pha chính xác các dung

dịch protein có nồng độ từ 0 đến 10 mg/ml và thực hiện phản ứng theo bảng

sau: Ong 1I|2|3|4|5|6|L7|8| 9 |10|11 Protein mẫu (ml) | 0.1 |0.2|03|0.4|0,5|0,6|0/7|0/8|0.9|110 Đệm pH 7,0 (ml) | 090.8 |0,7|0,6|0,5|0,4| 03 |0/2|01|0 |1 Gornal (ml) 4/4/4]/4/4]4/4/4]4]/4] 4

quang ở bước sóng 550 nm, cuvet | cm

Bảng 3.1 Giá frị hấp thụ quang của dung dịch protein đã biết nông độ

Lắc đều, để các ống 30 phút ở nhiệt độ phịng sau đó đem đo mật độ

Trang 36

Hình 3.1: Đồ thị tương quan giữa nông độ protein và mật độ quang 0.6 y=0.0527x+0.0118 0.5 +1 0.4 - 0.3 - oD 0.2 - 0.1 0 0 2 4 6 8 10 12 C(mg/m))

Nhận xét: đường thu được là đường thăng có phương trình OD =

0,0527.[protein] + 0,0118 và có hệ số tương quan là 0,996] > 0,99 Vậy có

thể kết luận nồng độ protein và mật độ quang tại 550nm (sau khi thực hiện

theo quy trình trong phần phương pháp thực nghiệm) có quan hệ tuyến tính đồng biến Để xác định được nồng độ protein có thể căn cứ vào đường chuẩn

phương trình hoặc vào hệ sé protein Ky

3.2 Xây dựng đường chuẩn lọc gel v⁄ Chuẩn bị cột sắc ký:

- Ngâm sephadex G75 trong nước cất có thêm 30% côn tuyệt đối

trong 24h dé gel trương nở hoàn toàn Dùng một lượng nước sao cho khi

trương nở và gel đã lắng xuống lượng nước thừa phải có thê tích gấp 10 lần thê tích gel

- Cho một ít dung dịch đệm vào cột

- Cho một lớp bông thủy tỉnh vào đáy cột

Trang 37

30

- Gel đã trương nở đồ vào cột bằng đũa thủy tinh Khi được một lớp

gel đã lắng xuống khoảng vài em, mở khóa đáy cột cho dung dịch đệm từ từ chảy ra Tiếp tục đồ gel vào, chú ý sao cho quá trình đồ ln có 3 lớp: lớp dưới là gel đã lắng, lớp này ngày càng cao dần; ở giữa là lớp gel đang lắng: cịn phía trên là lớp dung dịch trong suốt Nếu quá trình lắng nhanh hơn lưu

lư xng chảy có thể thình thoảng hút bỏ lớp dung mơi phía trên để có thể tiếp

tục 16 gel vao Lam nhu vay cot gel sé dong đều khơng có chỗ thưa chỗ đặc - Đặt lên gel một miêng giấy lọc

- Cho dung dịch đệm chảy trong vài giờ đề ôn định cột

~ Nap mau:

- Pha dung dịch mẫu có nồng độ protein khoảng 10 mg/ml - Hút bỏ phần dung môi trên cột gel

- Mở khóa dưới cột cho chảy tiếp tới khi mực nước xuống sát lớp gel

- Cho dung dịch cần tách vào, để lớp này ngắm hết xuống

- Đồ dung dịch đệm có chứa NaCl 0,1M vào cột tới độ cao cần thiết

Y Thu mau:

Thu vào mỗi ống nghiệm, mỗi ống chứa 1 ml Thu các phân đoạn có sự

hiện diện của protein tương ứng với MW của nó (theo đường chuẩn đã dựng) dé xác định hàm lượng protein

Trang 38

31

Bảng 3.2 Kết quả rửa giải các protein bằng phương pháp lọc gel

Protein | Chymotrypsin Casein Insulin Vitamin B12 MW (Da) 25 23.6 5.7 1.35 LogMW 1.398 1.373 0.756 0.13 Ve (ml) 7.5 8 10 12.5 1.6 1.4 1.2 > = 08 = 06 0.4 0.2 y=-0.2597x + 3.3715) 0 R” =0.9976 0 2 6 8 10 12 14 V(ml)

Hình 3.2 Két qua rita giải các protein bằng phương pháp lọc gel Nhận xét: Đồ thị về mối tương quan giữa logarit khối lượng phân tử của các protein và thể tích rửa giải có dạng là một đường thăng tuyến tính

bậc nhất y = ax + b, cụ thể là y = -0,2597x + 3,3715 (y: logarit khối lượng

phân tử của các protein và x: thê tích rửa giải) Đường thăng có hệ số tương

quan RỶ = 0,9976 lớn hơn RỶ = 0,99 Do đó có thê kết luận trong điều kiện thi

nghiệm Log MW và Ve tuyến tính nghịch biến Papain có MW = 23.400 Da có thê tích rửa giải tương ứng là 7,71 ml Do đó khi tinh chế lựa chọn thể tích

thu mau tir 6 — 9 ml

Trang 39

3.3 Quy trình chiết tách papain từ nhựa quả đu đủ xanh tạo chế phẩm

đông khô

3.3.1 Giai đoạn diêm tích tạo chế phẩm thơ AI

Thực hiện chiết tách papain từ nhựa quả đu đủ xanh qua 4 giai đoạn: Giai đoạn l: Hòa tan nhựa ẩu đủ tươi

30 ml dịch nhựa được hòa tan đồng thể trong môi trường đệm (KH;PO,

- Na;HPO¿) 0,05M pH 5,8 có cystein 0,05M + EDTA 0,00IM + 14% (NH,);SO¿ Khuấy đều trong 1 giờ để enzym hòa tan hoàn toàn Để yên 30 phút Sau đó lọc, ly tâm 4000 vòng/phút trong 1Š phút bỏ tủa lấy dịch

⁄ Giai đoạn 2: Chiết dịch hôn hợp enzym

Giai đoạn này loại các ion kim loại nặng cũng như các loại tạp chất có

trong thành phần nhựa đu đủ Dung dịch nước trong chiết ra được đưa tới pH

9 bằng NaOH 1M Đề kết tủa, ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút bỏ tủa lấy

dịch Tiến hành đo hoạt tính và nồng độ protein của dung dịch thu được, kết quả được tóm tắt trong bảng 3.3

Bảng 3.3 Hàm lượng protein và HP của nhựa đu du đã loại tạp

ở Protein Nano dé

, | Thê tích 1" H HđP ong CQ | HdP riéng

Thong so tong so protein

(ml) (nKat) (mg/ml) (nKat/mg)

(mg)

Két qua 40 569,60 | 485378,95 14,24 852,14

v4 Giai đoạn 3: Tach loai chymopapain

Dịch ly tâm được phân đoạn bằng (NH¿)zSO¿ 45% độ bão hòa Cho từ từ và khuấy cho tan hết Tủa protein — enzym xuất hiện, để yên huyền dịch

trong 1 giờ ở 4”C để sự kết tủa đạt đến độ ồn định rồi đem ly tâm lạnh 12000

Trang 40

33

đo hoạt tính và nồng độ protein của dung dịch thu được, kết quả được tóm tắt

trong bảng 3.4

Bảng 3.4 Hàm lượng protein và HäP tủa bằng (NH,);SO, 45% độ bão hòa

s Protein Nang dé

, | The tich 5 ô HP 0nĐ d | HđP riêng

Thong so tông sô protein

(ml) (nKat) (mg/ml) | (nKat/mg)

(mg)

Két qua 30 216,32 | 369634,64 7,21 1708,74

Y Giai đoạn 4: Loại các enzym tạp khác (protease III va IV)

Hòa tan tủa vào trong dung dịch đệm (KH;PO¿— Na;HPO¿) 0,05M pH

6,5 có cystein 0,05M + EDTA 0,001M, sau đó dùng NaCl tỉnh thể đề kết tủa papain với tỷ lệ 250 g/lít dịch chiết Khuấy cho tan hết, để yên trong 1 giờ ở

4°C rồi đem ly tâm lạnh như trên thu tủa bỏ dịch được sản phẩm tho Al Hoa

tan tủa, tiến hành đo hoạt tính và nồng độ protein của dung dịch thu được, kết

quả được tóm tắt trong bảng 3.5

Bang 3.5 Ham luogng protein va HdP tua NaCl ty lé 250 g/lit

5 Protein a ˆ

Thếtích | , „ Hap | Nông độ | HđP riêng

P tong so protein

Thông sô (ml) (nKat) (mg/ml) (nKat/mg)

(mg)

Két qua 30 98.40 263713,97 2,46 2680,02

3.3.2 Giai đoạn kết tủa lại bằng côn tạo sản phẩm A2