Quá trình cố định nitơ trong rừng ngập mặn Cần Giờ và các vi sinh vật tham gia

Quá trình cố định nitơ rừng ngập mặn Cần Giờ vi sinh vật tham gia Đinh Thuý Hằng1, Trần Triết2 1- Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà nội 2- Khoa Sinh học - Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh Tóm tắt Trầm tích rừng ngập mặn thường bị hạn chế nitơ phosphor Nitơ dạng khí hồ tan nguồn dự trữ lớn vùng sinh thái này, vi sinh vật cố định nitơ có vai trị vơ quan trọng Tại rừng ngập mặn Cần Giờ xác định hàm lượng nitơ tổng số cao 2-3 cm bề mặt trầm tích (342 nmol.kg1) giảm dần theo độ sâu, thể đóng góp nitơ rửa trơi từ đất liền trầm tích bề mặt vai trị vi sinh vật cố định nitơ địa việc trì nguồn nitơ lớp trầm tích bề mặt Thông qua phương pháp khử acetylene, nitrogenase xác định khơng có hoạt tính trầm tích bề mặt mà tập trung chủ yếu độ sâu cm, nơi có mơi trường thiếu ơxy Phân tích thư viện gen nifH mã hố cho dinitrogenase reductase phức hợp nitrogenase cho phép xác định mức độ đa dạng cao vi sinh vật cố định nitơ lớp trầm tích bề mặt lớp trầm tích sâu cm, nhóm vi khuẩn kỵ khí Desulfovibrio hay Geobacter chiếm ưu Điều cho thấy khác biệt rõ rệt quần thể vi sinh vật cố định nitơ rừng ngập mặn so với vùng rễ lúa hay họ đậu, nơi có lồi hiếu khí (Rhizobium, Agrobacter …) chiếm ưu Từ khóa Cố định nitơ, nitrogenase, nifH, rừng ngập mặn, trầm tích, vi khuẩn kỵ khí Mở đầu Rừng ngập mặn vùng sinh thái có mức sinh trưởng cao đa dạng sinh học phong phú Loại hình sinh thái khư trú dọc theo bờ biển vùng nhiệt đới, chiếm 60 -70% diện tích bờ biển trái đất (Clough, 1998) Nằm vị trí trung gian biển đất liền, rừng ngập mặn có vai trị hệ thống lọc nguồn nước từ đất liền biển, có ảnh hưởng lớn đến đặc điểm sinh thái vùng biển gần bờ (Ditmar, Lara, 2000; Tam, Wong, 2000) Với điều kiện thường xuyên ngập nước, môi trường cho vi sinh vật phát triển lớp trầm tích rừng ngập mặn chủ yếu kỵ khí (Dittmar, Lara, 2001) Lớp trầm tích rừng ngập mặn nói chung đặc trưng mơi trường nước lợ có hàm lượng cacbon hữu cao lại bị hạn chế nitơ phosphor (Ditmar, Lara, 2000) Ngoài phần nitơ đem tới từ đất liền, nguồn nitơ để đảm bảo cân chu trình tuần hồn vật chất rừng ngập mặn nhóm vi khuẩn cố định nitơ đảm nhiệm, chuyển hố nitơ khí (N2) thành ammonium (Cleveland, 1999; Ditmar, Lara, 2000) Nitrogenase phức hợp enzyme có chức xúc tác cho phản ứng trình cố định nitơ gồm hai protein khác nhau: protein chứa sắt (dinitrogenase reductase) protein chứa molipden (dinitrogenase) nifH gen mã hố cho protein chứa sắt, có độ bảo thủ cao loài vi sinh vật khác nhau, thường dùng làm công cụ để nghiên cứu vi sinh vật cố định nitơ môi trường tự nhiên (Zehr, Capone, 1996) Cây phả hệ dựa trình tự gen nifH thường thể xác mối tương quan loài phả hệ dựa trình tự 16S rADN (Hennecker et al, 1985) Trong báo chúng tơi tiến hành tìm hiểu trình cố định nitơ diễn lớp trầm tích rừng ngập mặn độ sâu khác nhau, xác định nhóm vi khuẩn đóng vai trị chủ đạo q trình thơng qua nghiên cứu gen nifH phương pháp thiết lập phân tích thư viện gen Nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu Thu mẫu trầm tích theo chiều sâu Mẫu trầm tích thu thập dụng cụ hình ống (hình 1), đảm bảo mẫu tầng khác không bị xáo trộn Mẫu sau thu cắt lớp theo độ sâu khác 5, 10, 15, 20 cm bảo quản C tiến hành phân tích phịng thí nghiệm Định lượng hoạt tính cố định nitơ sinh học mẫu trầm tích Hoạt tính cố định nitơ xác định theo phương pháp Hardy đồng tác giả (1973), acetylene dùng làm chất cho enzyme nitrogenase hoạt tính xác định thơng qua lượng ethylene tạo máy sắc ký khí Shimadzu 1500, sử dụng helium khí mang đầu đọc TCD Xác định hàm lượng nitơ tổng số mẫu trầm tích Mẫu trầm tích sấy khơ tán nhỏ trước tiến hành xác định hàm lượng nitơ tổng số máy phân tích ngun tố hố học (Euro-EA Elemental Analysis) theo nguyên lý đốt cháy kết hợp với sắc ký khí Tách chiết ADN tổng số từ mẫu trầm tích ADN tổng số mẫu trầm tích tách chiết theo phương pháp Zhou đồng tác giả (1996) mô tả với cải biến nồng độ proteinase K 20 mg/ml nồng độ đệm phosphate dung dịch phá tế bào 120 mM Thiết lập phân tích thư viện gen nitrogenaza Đoạn gen nifH dài 400 bp khuếch đại với mẫu ADN tổng số tách chiết trực tiếp từ mẫu trầm tích sử dụng cặp mồi có độ biến tính cao: mồi xuôi 5’-GGHAARGGHGGHATHGGNAA RTC-3’ mồi ngược 5’-GGCATNGCRAANCCVCCRCANAC-3 (Mehta et al., 2003) Sản phẩm PCR sau gắn vào pCR4-TOPO vector sử dụng TOPO TA cloning Kit tế bào khả biến One Shot TOP10 theo hướng dẫn nhà sản xuất (Invitrogen) Các clone chọn cách ngẫu nhiên để thiết lập thư viện gen Đoạn chèn gen nifH sau khuyếch đại sử dụng cặp mồi M13 xuôi ngược, sản phẩm PCR tinh QiaQuick PCR purification Kit (QiaGen) đọc trình tự theo hai chiều đoạn mồi T3 T7 Các trình tự sau xử lý phần mềm BioEdit, dịch sang trình tự axit amin so sánh độ tương đồng với trình tự công bô ngân hàng liệu GeneBank sử dụng công cụ BLAST Kết thảo luận Đặc điểm mẫu trầm tích nghiên cứu Trầm tích rừng ngập mặn chia thành hai vùng khác nhau, vùng bờ nước vùng rễ Bùn trầm tích vùng bờ nước có màu sáng thường xuyên tiếp xúc với ánh sáng mặt trời, bùn vùng rễ đước có màu tối đến đen bị che phủ hồn tồn, khơng có ánh mặt trời rọi vào (hình 1a, 1b) Ở vùng, mẫu thu dụng cụ hình ống (hình 1c) với độ lặp lại 3, sau phân tầng 5, 10, 15, 20 cm chuyển vào ống có nút xốy, bảo quản 4C tiến hành phân tích phịng thí nghiệm Hàm lượng nitơ tổng số mẫu bùn trầm tích 1c Lượng nitơ tổng số mẫu bùn trầm tích xác định tầng khác (Hình 2) cho thấy khơng có khác biệt đáng kể mẫu vùng bờ nước mẫu vùng rễ đước Ở 1a 1b hai vùng này, nồng độ nitơ cao khoảng -3 cm bề mặt giảm dần theo độ sâu Hiện tượng giải thích tầng bề mặt bổ sung lượng đáng kể nitơ từ nguồn nước đất liền chảy So với lượng cacbon có mặt mơi trường sinh thái (khoảng 2000 mmol/kg bùn) lượng nitơ chưa đạt mức độ tối ưu cho q trình chuyển hóa sinh học đây, hay nói cách khác môi trường rừng ngập mặn trạng thái thiếu nitơ Hiện tượng quan công bố nghiên cứu trước (Ditmar, Lara, 2000) Hoạt tính nitrogenase mẫu bùn trầm tích Mức độ tham gia vi sinh vật việc cung cấp nguồn nitơ cho hệ sinh thái rừng ngập mặn xác định thơng qua hoạt tính nitrogenase, enzyme có vi sinh vật, thực phản ứng khử phân tử N2 thành NH4 Kết thí nghiệm đo hoạt tính khử acetylene cho thấy enzyme khơng thể hoạt tính cm bề mặt mẫu bùn, nguồn nitơ cung cấp chủ yếu từ đất liền Khác với bề mặt, bùn độ sâu cm có hoạt tính enzyme cao, đạt 40 – 50 mol.L1 bùn (Hình 3), chứng tỏ nguồn nitơ trì phần đáng kể vi sinh vật cố định nitơ địa Có thể nhận thấy hoạt tính nitrogenase vùng bờ nước (vùng chiếu sáng) vùng rễ đước (vùng không chiếu sáng) khơng có khác biệt đáng kế, vai trị lồi cố định nitơ quang dưỡng (Cyanobacteria, Rhodobacter ) không quan trọng so với lồi hóa dưỡng Đa dạng VSV tham gia q trình cố định nitơ thể qua phân tích thư viện gen nifH Trong nghiên cứu này, đoạn 400 bp gen nifH khuyếch đại với mồi đặc hiệu tách dòng sử dụng vectơ pCR4 (Invitrogen) để thiết lập thư viện gen Hai thư viện gen với độ lớn 60 đơn vị tách dòng (clone) thư viện thiết lập cho mẫu bùn bề mặt (0–5 cm) mẫu bùn sâu (5–15 cm) Kết phân tích trình tự clone so sánh với ngân hàng liệu trình tự axit amin GeneBank cho thấy mức độ đa dạng cao vi sinh vật cố định nitơ hai mẫu (Hình 4) So với mẫu độ sâu cm, mẫu bề mặt có quần thể vi sinh vật mang gen mã hoá cho nitrogenase đa dạng Tuy nhiên hai độ sâu, bên cạnh nhóm vi khuẩn chưa phân lập được, nhóm vi khuẩn sinh trưởng kỵ khí Desulfovibrio hay Geobacter chiếm tỷ lệ lớn Điều phản ảnh môi trường thiếu ôxy bùn rừng ngập mặn ưu loài kỵ khí Các nghiên cứu trước cho thấy nhiều loài vi khuẩn khử sulfate thuộc chi Desulfovibrio mang gen nitrogenase có khả cố định nitơ (Rabus, Widdel, 2000) Khác với vi khuẩn khử sulfate, vi khuẩn khử sắt III Geobacter chưa kiểm chứng khả cố định nitơ, nhiên nhóm vi khuẩn nhóm kỵ khí quan trọng số vùng sinh thái, có rừng ngập mặn (Bazylinski et al., 2000) Trong hai loại mẫu phân tích, nhóm vi khuẩn khử sulfate thuộc chi Desulfovibrio có mặt với tỷ lệ cao (27% mẫu cm bề mặt 38% mẫu cm) Kết phù hợp với mật độ vi khuẩn khử sulfate cao rừng ngập mặn nồng độ sulfate đưa vào từ nước biển (Ditmar, Lara, 2001) Kết luận Nitơ tổng số mẫu bùn rừng ngập mặn Cần Giờ cao cm bề mặt giảm dần theo độ sâu Lượng nitơ chưa đạt mức độ tối ưu cho trình chuyển hóa sinh học Hoạt tính nitrogenase xác định mức cao mẫu bùn độ sâu cm, mẫu bề mặt khơng có hoạt tính này, chứng tỏ vai trị ưu nhóm vi sinh vật kỵ khí q trình cố định nitơ mơi trường sinh thái rừng ngập mặn Kết phân tích thư viện gen nifH cho thấy nhóm vi khuẩn kỵ khí (Desulfovibrio Geobacter) đóng vai trị quan trọng trình cố định nitơ rừng ngập mặn Bên cạnh đó, lượng lớn vi khuẩn tham gia q trình thuộc nhóm chưa phân lập (chiếm 20% tổng số clone hai mẫu phân tích) Tài liệu tham khảo Bazylinski DA, Dean AJ, Schueler D, Phillips EJP, Lovley DR (2000) N2-dependent growth and nitrogenase activity in the metal-metabolizing bacteria, Geobacter and Magnetospirillum species Environ Microbiol 2: 266-273 Cleveland CC (1999) Global patterns of terrestrial biological nitrogen (N2) fixation Glob Biogeochem Cycles 13: 623–645 Clough B (1998) Mangrove forest productivity and biomass accumulation in Hinchinbrook Channel, Australia Mangroves Salt Marshes 2: 191–198 Dittmar T, Lara RJ (2000) Driving forces behind nutrient and organic matter dynamics in a mangrove tidal creek in north Brazil Estuarine, Coastal and Shelf Science 52: 249–259 Dittmar T, Lara RJ (2001) Molecular evidence for lignin degradation in sulfate-reducing mangrove sediments (Amazonia, Brazil) Geochim Cosmochim Acta 65: 1417–1428 Hardy RWF, Burns RC, Holsten RD (1973) Application of the acetylene-ethylene assay for measurement of nitrogen fixation Soil Biol Biochem 5: 47-81 Hennecke H, Kaluza K, Thony B, Fuhrmann M, Ludwig W, Stackebrandt E (1985) Concurrent evolution of nitrogenase genes and 16S rRNA in Rhizobium species and other nitrogen fixing bacteria Arch Microbiol.142: 342–348 Mehta MP, Butterfield DA, Baross JA (2003) Phylogenetic diversity of nitrogenase (nifH) genes in deep-sea and hydrothermal vent environments of the Juan de Fuca Ridge Appl Environ Microbiol 69: 960–970 Rabus R, Widdel F (2000) Dissimilatory sulfate and sulfur-reducing prokaryotes In Dworkin M, Falkow S, Rosenberg E, Schleifer KH, Stackebrandt eds, The Prokaryotes: an Evolving electronic resource for the microbiological community Springer-Verlag, New York Tam NFY, Wong YS (2000) Spatial variation of heavy metals in surface sediments of Hong Kong mangrove swamps Environ Pollut 110: 195-205 Zehr JP, Capone DG (1996) Problems and promises of assaying the genetic potential for nitrogen fixation in the marine environment Microb Ecol 32: 263–281 Zhou J, Bruns MA, Tiedje JM (1996) DNA recovery from soils of diverse composition Appl Environ Microbiol 62: 316-322 Lời cảm ơn Tác giả xin trân thành cảm ơn cán Bộ môn Sinh thái Môi trường, khoa Sinh học - Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Tp HCM giúp đỡ việc thu mẫu rừng phòng hộ Cần Giờ, Tp HCM Nghiên cứu thực với trợ giúp Đề tài KHCB 621506 Địa liên hệ: Đinh Thuý Hằng Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà nội 144 Xuân thuỷ, Cầu giấy – Hà nội Điện thoại: 04 3754 76 94 Fax: 04 3754 74 07 Email: dthang@vnu.edu.vn, hangdinh_cbhn@yahoo.com Nitrogen fixation in Cangio mangrove and the involved microorganisms Dinh Thuy Hang1, Tran Triet2 Institute of Microbiology and Biotechnology, National University Hanoi Biology Faculty, University of Natural Sciences, National University HCM City Summary Mangrove sediments are usually limited in nitrogen and phosphorous Dissolved nitrogen, the largest nitrogen reservoir would help to solve this problem through activity of nitrogen-fixing microorganisms, the role of these microbes is therefore quite important in mangrove ecosystem In Cangio mangrove, the total nitrogen content was measured highest at 2-3 cm surface of the sediment (342 nmol.kg1) and gradually decreased with depth, indicating the contribution of nitrogen washed out from land to the surface layers and the role of native nitrogen fixing microbes in supplying nitrogen for deeper layers By using acetylene reduction assay, the enzyme nitrogenase was determined with minor activity in the surface layers, but with high activity concentrated at the depth below cm, where oxygen is limited Analyses of clone library of the nifH gene, coding for dinitrogenase reductase of the nitrogenase complex showed highly diversed nitrogen-fixing communities in both surface and deep sediments, among those anaerobic species such as Desulfovibrio and Geobacter were most abundant This finding revealed a significant distinction between nitrogen-fixing community in mangroves and that in rice or bean rhizosphere, where aerobic species (Rhizobium, Agrobacter ) are dominant Keywords: Nitrogen fixation, nitrogenase, nifH, mangrove, sediment, anaerobic bacteria Author for correspondence: Dinh Thuy Hang Institute of Microbiology and Biotechnology, VNU Tel 04 3754 76 94 Fax: 04 3754 74 07 Email: dthang@vnu.edu.vn, hangdinh_cbhn@yahoo.com 1c 1a 1b 10 15 20 Hình Mẫu bùn trầm tích thuộc vùng bờ nước (1a) vùng rễ đước (1b) thu theo chiều sâu dung cụ ống (1c), đảm bảo bùn tầng khác không bị xáo trộn 1 N(l ) m m o k g 0 Depth(cm) Độ sâu (cm) 5 Hình Hàm lượng nitơ tổng số mẫu bùn trầm tích rừng ngập mặn vùng bờ nước () vùng rễ đước () Ethylene (mol l1 bùn) 0 0 0 0 Thờii(h) gianh T m e ( ) Hình Hoạt tính enzyme nitrogenase mẫu bùn vùng bờ nước () vùng rễ đước () độ sâu – 15 cm 30% 30% 20% 20% 10% 10% 0% 0% Hình phương pháp phân tích thư viện gen nifH VK cố định nitơ chưa phân lập Vibrio sp Pseudomonas sp 40% Wolinella sp – cm Desulfovibrio sp sp VK cố định nitơ chưa phân lập Methylomonas sp Dechloromonas sp Wolinella sp Spirochaete sp Vibrio sp Desulfovibrio sp sp Geobacter sp 40% – 15 cm Đa dạng vi khuẩn cố định nitơ mẫu bùn rừng ngập mặn Cần theo ... nitrogenase mẫu bùn trầm tích Mức độ tham gia vi sinh vật vi? ??c cung cấp nguồn nitơ cho hệ sinh thái rừng ngập mặn xác định thông qua hoạt tính nitrogenase, enzyme có vi sinh vật, thực phản ứng khử phân... nitơ mơi trường sinh thái rừng ngập mặn Kết phân tích thư vi? ??n gen nifH cho thấy nhóm vi khuẩn kỵ khí (Desulfovibrio Geobacter) đóng vai trị quan trọng q trình cố định nitơ rừng ngập mặn Bên cạnh... chế nitơ phosphor (Ditmar, Lara, 2000) Ngoài phần nitơ đem tới từ đất liền, nguồn nitơ để đảm bảo cân chu trình tuần hồn vật chất rừng ngập mặn nhóm vi khuẩn cố định nitơ đảm nhiệm, chuyển hố nitơ