nội chuyển hóa ester bằng enzyme

Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 1 – Giới thiệu Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 1 PHẦN 1 Giới thiệu phương pháp Nội chuyển hóa ester bằng enzyme 1.1. GIỚI THIỆU VÀ PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN HÓA ESTER 1.1.1. Giới thiệu Chất béo là một trong những thành phần không thể thiếu trong khẩu phần ăn hằng ngày của chúng ta. Không những mang lại giá trò dinh dưỡng cao, chất béo còn góp phần tạo nên mùi vò, cấu trúc và tăng giá trò cảm quan cho sản phẩm thực phẩm mà chúng ta tiêu thụ. Tuy nhiên, đối với dầu và mỡ tự nhiên thì tính chất chức năng và dinh dưỡng của chất béo không thể đạt được một cách toàn diện. Do đó, việc phát triển các phương pháp cải thiện tính chất chức năng và dinh dưỡng của dầu mỡ là điều mà các nhà sản xuất thực phẩm luôn quan tâm. Chúng ta biết rằng khối lượng phân tử (hay chiều dài mạch), mức độ không bão hòa và vò trí của các acid béo trên mạch glycerol là những yếu tố quan trọng quyết đònh đến tính chất vật lý của triacylglycerol (TAG) như nhiệt độ nóng chảy, chỉ số chất béo rắn, cấu trúc và tính ổn đònh. Vì vậy để sản xuất được loại chất béo có tính chất theo yêu cầu thì phải thay đổi các yếu tố quyết đònh trên. Và cho đến hiện nay, có ba kỹ thuật giúp điều chỉnh tính chất vật lý của chất béo đó là kỹ thuật tách phân đoạn, kỹ thuật hydro hóa và kỹ thuật nội chuyển hóa ester (S. Ramamurthi và A.R. McCurdy, 1995). Đối với kỹ thuật tách phân đoạn, đây hoàn toàn là một phương pháp vật lý dựa vào đặc tính kết tinh của những TAG khác nhau để thu nhận một hoặc một số phân đoạn béo có giá trò dinh dưỡng hoặc tính chất cảm quan phù hợp hơn so với nguyên liệu ban đầu. Ngược lại, kỹ thuật hydro hóa là một phương pháp hóa học làm thay đổi mức độ không bão hòa của hỗn hợp TAG. Và cuối cùng là kỹ thuật nội chuyển hóa ester, một trong những phương pháp chuyển hóa ester, làm thay đổi vò trí của acid béo trên những phân tử TAG trong hỗn hợp nguyên liệu ban đầu (F.D. Gunstone, 2006). Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 1 – Giới thiệu Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 2 1.1.2. Phân loại các phương pháp chuyển hóa ester Chuyển hóa ester là phản ứng hóa học làm thay đổi liên kết ester trong phân tử TAG. Dựa vào cơ chất tác dụng mà ta phân loại thành các phương pháp chuyển hóa sau (W. Willis và A. Marangoni, 2002): 1.1.2.1. Acidolysis Acidolysis là phản ứng hóa học giúp chuyển đổi gốc acyl giữa một acid và một ester. Và đây cũng là một phương pháp giúp gắn kết những acid béo tự do vào phân tử TAG. Phương pháp này được dùng để cải thiện giá trò dinh dưỡng của dầu mỡ. Ví dụ như các aicd béo tự do hoặc ethyl ester của acid eicosapentaenoic (EPA) và acid docosahexaenoic (DHA) được gắn và thay thế các gốc acyl trên phân tử dầu thực vật hoặc dầu cá. Theo Yamane và cộng sự (1993), ông có thể tăng hàm lượng EPA trong dầu gan cá từ 8,6% lên 25% và hàm lượng DHA từ 12,7% đến 40% khi ông tiến hành phản ứng acidolysis với việc sử dụng enzyme lipase cố đònh từ loài Mucor miehei. Trong suốt quá trình phản ứng này, hàm lượng các acid béo không bão hòa đa (PUFA) trong dầu cá tăng khi nhiệt độ trong khoảng âm từ 10 o C đến 20 o C vì sự kết tinh và tách ra khỏi hỗn hợp của những acid béo bão hòa. Ngoài ra, Oba và Witholt (1994) còn sử dụng phản ứng acidolysis để gắn các phân tử acid oleic lên chất béo có trong sữa. Do đó hàm lượng các acid béo không bão hòa trong bơ tăng mà không làm thay đổi hương vò của bơ. Ngoài ra, phương pháp acidolysis còn được dùng để tổng hợp chất béo có cấu trúc. Đây là những chất béo được tạo thành từ các acid béo mạch dài hay trung bình. Các loại acid béo này có chức năng dinh dưỡng đối với bệnh nhân ăn kiêng, bởi vì khi được hấp thu vào cơ thể, các acid béo như acid capric và caproic dễ dàng bò oxy hóa để tạo ra năng lượng thay vì được dự trữ như những loại acid béo khác (J. Kennedy, 1991). Còn đối với các loại acid béo mạch dài mà đặc biệt là PUFA, việc sử dụng chúng sẽ làm giảm đi nguy cơ mắc những bệnh về tim mạch (C. Akoh, 1995). Tóm lại, chất béo cấu trúc có dạng MUM với acid béo mạch trung bình (M-medium chain fatty acid)) nằm ở vò trí sn-1,3 và acid béo không bão hòa (U- unsaturated fatty acid) nằm ở vò trí sn-2 thì được xem là nguồn cung cấp năng lượng lý tưởng. Việc tổng hợp nên loại chất béo có cấu trúc xác đònh này đã được nghiên cứu rất nhiều với việc sử dụng enzyme lipase (Xu, 2000). Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 1 – Giới thiệu Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 3 Một trong những chất béo cấu trúc xác đònh có giá trò kinh tế cao là sản phẩm thay thế bơ ca cao (CBE – Cocoa Butter Equivalent) cũng được sản xuất theo phương pháp acidolysis. Nguồn cơ chất sử dụng là phân đoạn giữa của dầu cọ (1,3-dipalmitoyl-oleoyl-glycerol) và acid stearic (Chong và cộng sự, 1992). 1.1.2.2. Alcoholysis Alcoholysis là phản ứng chuyển hóa ester xảy ra giữa rượu và ester. Phản ứng này được dùng để tổng hợp methyl ester (biodiesel) với nồng độ có thể lên đến 53% (D. Briand, 1994). Ngoài ra, sản phẩm của phản ứng còn có thể là những hợp chất trao đổi gốc acyl (acyl donor) được sử dụng trong sản xuất chất béo có cấu trúc xác đònh, như ethyl ester của acid béo (Xu, 2000). Nếu phản ứng xảy ra giữa TAG và một glycerol thì được gọi là glycerolysis. Phản ứng này được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất mono- và diacylglycerol. Hiện nay, việc tổng hợp monoacylglycerol (MAG) sử dụng xúc tác enzyme lipase được thực hiện bằng quá trình kết tinh điều khiển nhiệt độ để tách các tinh thể MAG không bão hòa ra khỏi hỗn hợp phản ứng (G. McNeill, 1992). Enzyme lipase sử dụng là của loài vi khuẩn Pseudomonas fluorescens và Chromobacterium vicosum vì nó thể hiện hoạt tính cao đối với phản ứng glycerolysis (G. McNeill, 1991). T c là nhiệt độ tới hạn mà nếu thấp hơn nhiệt độ này thì MAG sẽ kết tinh và tách ra khỏi dung dòch. Lúc này cân bằng của phản ứng sẽ dòch chuyển về chiều tạo thành MAG. Kết quả là hàm lượng MAG sẽ được tổng hợp nhiều hơn (từ 30% đến 90%). Nhiệt độ tới hạn của dầu thực vật (5 – 10 o C) sẽ thấp hơn nhiệt độ tới hạn của mỡ động vật (30 – 46 o C). Hàm lượng ẩm cũng có ảnh hưởng đến phản ứng. Mcneill và cộng sự nhận thấy rằng nếu lượng ẩm tăng từ 0,5 đến 5,7% thì sẽ tăng sự tổng hợp MAG, nếu vượt quá mức thì sẽ không ảnh hưởng đến tốc độ của phản ứng. Tuy nhiên, thời gian thực hiện phản ứng khá dài, từ 4 đến 5 ngày. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 1 – Giới thiệu Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 4 1.1.2.3. Nội chuyển hóa ester Đây là một trong những phương pháp chuyển hóa ester mà được sử dụng nhiều nhất trong công nghiệp thực phẩm. Phương pháp này sẽ thay đổi vò trí các acid béo của phân tử TAG. Phản ứng được thực hiện qua nhiều bước. Đầu tiên, các liên kết ester của glycerol sẽ bò cắt đứt, giải phóng một số phân tử acid béo vào trong dung dòch phản ứng. Sau đó, những acid béo tự do này hoặc những acid béo đã có sẵn trong dung dòch sẽ kết hợp ngẫu nhiên với glycerol tạo nên liên kết ester mới. Liên kết này có thể được hình thành trên phân tử glycerol cũ (intraesterification) hoặc phân tử glycerol hoàn toàn mới (interesterification). Tuy nhiên tốc độ phản ứng intraesterification sẽ nhanh hơn so với interesterification (B. Sreenivasan, 1978). Cuối cùng, khi phản ứng đạt cân bằng, ta sẽ thu được một hỗn hợp TAG. Sự ảnh hưởng của phương pháp này đến tính chất của chất béo phụ thuộc rất nhiều vào thành phần của nguyên liệu ban đầu. Nếu ta chỉ sử dụng một loại nguyên liệu thì hiệu quả phản ứng sẽ không cao so với một hỗn hợp nguyên liệu (D. Rousseau, 1996). Hình 1.1 – Sự hình thành triacylglycerol trong phản ứng nội chuyển hóa ester: S, stearoyl; O, oleoyl; L, linoleoyl. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 1 – Giới thiệu Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 5 1.2. PHƯƠNG PHÁP NỘI CHUYỂN HÓA ESTER BẰNG ENZYME Phản ứng nội chuyển hóa ester xảy ra giữa hai TAG, hoặc giữa một TAG và một ethyl ester. Phản ứng này được xúc tác bởi hợp chất hóa học hoặc bằng enzyme. Tuy nhiên, hỗn hợp sản phẩm sẽ rất khác nhau khi sử dụng hai loại xúc tác trên vì enzyme lipase có tính đặc hiệu về vò trí (Hình 1.2). Phản ứng này được ứng dụng để sản xuất margarine, shortening và một số chất béo có cấu trúc và chức năng xác đònh (Zhang và cộng sự, 2004). Hiện nay, loại bơ có thành phần acid béo là PUFA cũng được nghiên cứu sản xuất theo phương pháp nội chuyển hóa ester bằng enzyme. Hình 1.2 – Phản ứng nội chuyển hóa ester có sử dụng xúc tác hóa học và enzyme giữa hai triacylglycerol ACA và BBB. Những phân tử được gạch dưới là nguyên liệu ban đầu; dấu sao (*) thể hiện những phân tử có thể được tổng hợp trong phản ứng sử dụng enzyme. Triacylglycerol có dạng UPU (U, acid béo không bão hòa; P, acid palmitic) được xem là chất béo rất tốt cho trẻ sơ sinh bởi vì tính dễ hấp thụ của nó. Loders – Croklaan đã sản xuất thành công sản phẩm thay thế chất béo có trong sữa mẹ với nguyên liệu là tripalmitin, dầu thực vật giàu acid oleic và sử dụng enzyme lipase đặc hiệu vò trí sn-1,3 (Kavanagh, 1997). Còn đối với phản ứng xảy ra giữa một TAG và một ethyl ester (EE) của acid béo thì phản ứng này được xem như phản ứng acidolysis, được dùng để sản xuất chất béo có thành phần acid béo xác đònh. Vì vậy, khi tổng hợp chất béo thay thế cho chất béo trong sữa mẹ bằng phản ứng này thì ta sử dụng nguyên liệu là PPP và U-EE. Hỗn hợp sau phản ứng đem đi chưng cất để tách P-EE ra khỏi sản phẩm là hỗn hợp PPU và UPU. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 1 – Giới thiệu Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 6 1.2.1. Mục đích và ứng dụng Vào những năm 1990, những acid béo dạng trans (TFA-trans fatty acid) đã gây nên những cuộc tranh cãi về việc sử dụng có thể dẫn đến nguy cơ mắc bệnh về tim mạch. Vì vậy trong tất cả các sản phẩm thực phẩm người ta luôn lưu ý đến hàm lượng acid béo này. Nguyên nhân dẫn đến xuất hiện TFA là do sự hydro hóa không hoàn toàn hỗn hợp dầu béo. Vì vậy để tránh sự tạo thành TFA, phương pháp nội chuyển hóa ester đã được ứng dụng để tạo thành những sản phẩm hoàn toàn không chứa TFA. Phương pháp nội chuyển hóa ester bằng enzyme hiện nay được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều, tuy nhiên đây không phải là một công nghệ mới. Unilever đã sử dụng phương pháp này vào năm 1977 để sắp xếp các acid béo của hỗn hợp dầu mỡ, tạo thành sản phẩm có độ mềm dẻo cao. Đột phá cộng nghệ này đã bò trì hoãn bởi vì chi phí cho enzyme lipase cố đònh sử dụng trong phản ứng quá đắt tiền. Vì vậy chỉ những chất béo có giá trò cao mới được tổng hợp bằng phương pháp nội chuyển hóa ester như bơ ca cao (Chang và cộng sự, 1990), chất béo trong sữa mẹ (Betapol TM ), dầu cá giàu PUFA (Shimada và cộng sự, 1997; Haralddsson và Kristinsson, 1998), và các chất béo có cấu trúc khác (Soumanou và cộng sự, 1998; Xu và cộng sự, 1999). Tuy nhiên những năm gần đây, phương pháp này đã được mở ra một cơ hội mới với sự phát triển của công nghệ enzyme. Đó là việc ứng dụng Lipozyme TL IM (Thermomyces lanuginosus lipase được cố đònh trên những hạt silicagen) vào trong phương pháp nội chuyển ester bằng enzyme. 1.2.2. Cơ chế phản ứng Phản ứng nội chuyển hóa ester bằng enzyme lipase cần sự tham gia của phân tử nước trong suốt quá trình phản ứng và những phân tử TAG mới luôn được tạo thành cùng với một vài diacylglycerol (DAG) và acid béo tự do (FFA-free fatty acid) được xem là những sản phẩm phụ trong dung dòch (Wong, 1995). Cơ chế phản ứng được minh họa bởi một số phản ứng sau đây: (E là enzyme) Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 1 – Giới thiệu Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 7 Phản ứng sẽ tiếp tục xảy ra cho đến khi đạt trạng thái cân bằng giữa các sản phẩm tạo thành và nguyên liệu ban đầu. Nếu hàm lượng nước trong phản ứng tăng thì lượng acid béo tự do sẽ tăng, trong khi đó FFA 1 .E hoặc FFA 2 .E sẽ giảm. Điều này dẫn đến hàm lượng các DAG cũng tăng theo. Vì vậy tổng hàm lượng TAG sẽ giảm. Kiểm soát lượng nước tự do trong phản ứng là điều cần thiết để hạn chế FFA và DAG trong sản phẩm. Khi sử dụng enzyme lipase đặc hiệu vò trí sn-1,3, phản ứng nội chuyển hóa ester sẽ tạo thành các hợp chất trung gian như 1,2(2,3)-DAG và FFA.E. Các gốc acyl trên những phân tử DAG sẽ chuyển vò khi có sự xúc tác của acid, base hoặc do trao đổi ion trên chất mang (resin). Điều này gây cản trở cho sự gắn kết các gốc acyl lên mạch glycerol không còn đặc hiệu nữa. Nhiệt độ cao và thời gian thực hiện phản ứng là hai yếu tố ảnh hưởng đến sự chuyển vò của gốc acyl (Bloomer và cộng sự, 1991; Xu và cộng sự, 1998). Do đó để hạn chế sự không đặc hiệu của enzyme, thông số nhiệt độ và thời gian phản ứng cần được kiểm soát. Hình 1.3 – Cơ chế sự chuyển vò gốc acyl bằng xúc tác acid Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 1 – Giới thiệu Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 8 1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính enzyme lipase 1.2.3.1. pH Enzyme lipase chỉ thể hiện hoạt tính ở những giá trò pH nhất đònh. Giá trò pH này phụ thuộc vào nguồn gốc thu nhận enzyme và tình trạng ion hóa của trung tâm hoạt động. Mặc dù enzyme lipase có thể hoạt động trong dải pH khá rộng từ 4 đến 10, nhưng pH tối ưu chỉ nằm trong khoảng từ 7 đến 9 (F.X. Malcata và cộng sự, 1992; T. Yamane, 1987). Ví dụ như enzyme lipase từ các loài Pseudomonas có giá trò pH tối ưu nằm trong khoảng 8,5 nhưng từ Aspergillus niger và Rhizopus delemar enzyme lipase có pH tối ưu dưới 7 (M. Iwai và Y. Tsujisaka, 1974). Ngoài ra, việc cố đònh enzyme cũng có ảnh hưởng đến giá trò pH tối ưu. Sự ảnh hưởng này phụ thuộc vào mức độ khuếch tán ion giữa pha liên tục và môi trường vi mô xung quanh chất mang. Trong trường hợp enzyme được cố đònh bằng chất mang polyanion (polymer tích điện âm), khi đó chất mang sẽ tác động mạnh với cơ chất tích điện dương, chẳng hạn như các proton H + , thì các ion này sẽ tập trung xung quanh polymer chất mang. Lúc đó mật độ của nó ở khoảng không gian gần enzyme cao , mặc dù nồng độ trung bình của nó trong cả hệ thấp. Từ đó, pH ở môi trường vi mô xung quanh enzyme thấp hơn so với pH trong toàn hệ. Kết quả là pH tối ưu của enzyme liên kết đồng hóa trò với chất mang có điện tích âm sẽ chuyển dòch sang phía pH kiềm so với enzyme hòa tan. Ví dụ đối với enzyme lipase tự do có giá trò pH tối ưu là 8,0 , khi được cố đònh trên chất mang có điện tích âm trong dung dòch cũng có pH bằng 8,0 thì pH ở vùng xung quanh enzyme có thể chỉ bằng 7,0. Do đó enzyme lipase hoạt động ở điều kiện pH thấp hơn giá trò tối ưu của nó. Dung dòch cần tăng giá trò pH lên 9,0 để làm cho vùng xung quanh enzyme có giá trò pH là 8,0 đạt điều kiện tối ưu. Hiện tượng này chỉ xảy ra đối với chất mang có điện tích và lực ion thấp (M.D. Trevan, 1980). Nếu proton H + được sinh ra trong quá trình phản ứng thì pH ở vùng xung quanh enzyme sẽ giảm xuống cho đến khi enzyme bò mất hoạt tính hoàn toàn. 1.2.3.2. Nhiệt độ Nhìn chung khi tăng nhiệt độ thì tốc độ của phản ứng sẽ tăng , nhưng nếu nhiệt độ quá cao thì sẽ làm biến tính không thuận nghòch enzyme dẫn đến làm giảm tốc độ phản ứng. Lipase thu nhận từ động vật và thực vật thường có khả năng chòu nhiệt kém hơn từ vi sinh vật (T. Yamane, 1987). Trong dung dòch phản ứng không sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan cơ chất, nhiệt độ phản ứng phải đủ cao để giữ cho cơ chất ở trạng thái lỏng (A.P. Ison và cộng sự, 1994; P. Forssel và cộng sự, 1992). Tuy nhiên, trong ngành công nghiệp thực Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 1 – Giới thiệu Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 9 phẩm, khi không có sử dụng dung môi thì nhiệt độ phản ứng vẫn cao và tăng đến giá trò 60 o C để hóa lỏng cơ chất. Nhiệt độ cao như thế sẽ làm giảm sự ổn đònh và tuổi thọ của enzyme mặc dù enzyme đã được cố đònh trên chất mang. Việc cố đònh enzyme sẽ làm cho nó có hình dạng nhất đònh, giảm tính nhạy cảm với nhiệt độ và chống lại sự biến tính bởi nhiệt. Vì vậy khoảng nhiệt độ tối ưu cho enzyme cố đònh là từ 30 đến 62 o C, cao hơn so với enzyme tự do. 1.2.3.3. Hàm lượng và hoạt độ nước Sự ảnh hưởng của hàm lượng nước đến hoạt tính enzyme lipase phụ thuộc vào nguồn thu nhận enzyme. Lipase thu nhận từ nấm mốc có khả năng chòu được hoạt độ nước thấp hơn từ vi sinh vật. Hàm lượng nước tối ưu cho phản ứng nội chuyển hóa ester đối với các loại lipase khác nhau nằm trong khoảng 0,04 – 11% (w/v), mặc dù hầu hết các phản ứng cần hàm lượng nước ít hơn 1% để đạt hiệu quả chuyển hóa ester (S. Bornaz, 1994; F.X. Malcata, 1992). Hàm lượng nước là yếu tố quyết đònh để xảy ra phản ứng thủy phân hay phản ứng tạo thành liên kết ester. Hoạt độ nước thấp thì phản ứng tạo thành liên kết ester sẽ xảy ra một cách thuận lợi. Tuy nhiên, trong điều kiện đó hoạt tính của enzyme lipase sẽ bò hạn chế (D. Briand, 1994; I. Svesson, 1994). Khi được cố đònh trên chất mang kò nước, hoạt tính của enzyme lipase sẽ ổn đònh hơn. Khi tiếp xúc với hệ nhũ tương dầu trong nước, pha dầu có xu hướng hấp phụ trên bề mặt và khuếch tán vào bên trong chất mang. Do đó, môi trường xung quanh enzyme và chất mang sẽ bò ngăn cách với pha nước bởi lớp dầu bao phủ. Nhưng để phản ứng có thể xảy ra thì các phân tử nước phải tiếp xúc với enzyme. Vì vậy để đảm bảo sự khuếch tán những phân tử nước vào bên trong chất mang thì pha dầu phải được bão hòa nước (F.X. Malcata, 1992). Hàm lượng nước quá nhiều có thể kìm hãm phản ứng nội chuyển hoá ester bởi vì nó sẽ ngăn cản sự tiếp xúc giữa cơ chất và enzyme. Theo Abraham và cộng sự (1998), phản ứng thủy phân sẽ chiếm ưu thế khi tỉ lệ giữa nước và enzyme lipase là 0,9. Trong phản ứng tạo thành liên kết ester, cân bằng của phản ứng sẽ bò ảnh hưởng bởi những phân tử nước được giải phóng khi tạo thành liên kết. Sự tích tụ những phân tử nước này sẽ ngăn cản phản ứng xảy ra theo chiều tạo thành liên kết ester. Vì vậy, hoạt độ nước cần phải được giữ ổn đònh bằng cách loại bỏ liên tục những phân tử nước trong suốt quá trình phản ứng. Một cách thực hiện rất đơn giản là ta tiến hành phản ứng trong điều kiện chân không. Khi đó, những phân tử nước được tạo thành sẽ bốc hơi mà vẫn giữ được hoạt tính của enzyme lipase. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 1 – Giới thiệu Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 10 1.2.3.4. Thành phần cơ chất và sự cản trở không gian Thành phần cơ chất sẽ ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng thủy phân và nội chuyển hóa ester bằng enzyme lipase. Sự có mặt của nhóm hydroxyl (-OH) ở vò trí sn-2 sẽ làm tăng dần tốc độ phản ứng thủy phân từ MAG, DAG đến TAG (P. Desnuelle, 1972). Bên cạnh đó, cấu hình không gian của cơ chất sẽ ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng. Điều đó thể hiện ở sự cản trở bởi cấu hình không gian sẽ làm giảm tốc độ phản ứng nhiều hơn mặc dù tính ái nhân (nucleophilicity) của cơ chất sẽ làm tăng tốc độ phản ứng. Cấu trúc phân tử cơ chất cũng có ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng bởi vì nó ảnh hưởng đến sự tiếp xúc có hiệu quả giữa cơ chất và trung tâm hoạt động của enzyme. Enzyme lipase có vùng trung tâm hoạt động bò che phủ bởi đoạn peptide có tính kỵ nước. Vì vậy phân tử cơ chất có tính ưa béo hoặc có cấu trúc vòng thơm sẽ được hấp phụ dễ dàng hơn so với phân tử cơ chất có mạch nhánh. Ví dụ khi ta sử dụng acid carboxylic có độ dài mạch khác nhau thì việc tăng độ dài mạch lên 7 carbon sẽ làm tăng tốc độ phản ứng đối với enzyme lipase từ loài Mucor miehei (Miller và cộng sự, 1988). Sự oxy hóa cơ chất, mà đặc biệt là PUFA , sẽ làm giảm hoạt tính của enzyme lipase do tạo thành những gốc tự do. Do đó, trước khi tiến hành phản ứng nội chuyển hóa ester, đặc biệt là thực hiện trong thiết bò liên tục có sử dụng chất đệm (fixed bed reactor), dầu chứa hàm lượng PUFA cao cần được tinh luyện thật sạch. 1.2.3.5. Chất hoạt động bề mặt Việc sử dụng chất hoạt động bề mặt khi cố đònh enzyme lipase sẽ làm tăng hoạt tính của enzyme trong phản ứng nội chuyển hóa ester. Tuy nhiên, nếu sử dụng chất hoạt động bề mặt để tạo thành hệ nhũ tương thì nó sẽ ngăn cản sự tiếp xúc giữa cơ chất và enzyme. Ngoài ra, sự có mặt của protein sẽ làm giảm sự hấp phụ của enzyme lipase lên trên bề mặt cơ chất đã được nhũ hóa. Thành phần phospholipid trong dầu (0,1 – 3,2%) cũng có ảnh hưởng không tốt đến hoạt tính của enzyme. Tốc độ của phản ứng sẽ giảm bởi vì phospholipid sẽ cạnh tranh tiếp xúc enzyme với cơ chất. Trong đó, phosphatidylethanolamine có tác động ức chế enzyme lipase nhiều nhất vì có chứa nhóm amine. Do đó, hàm lượng phospholipid trong dầu cần phải được kiểm soát để đảm bảo hoạt tính enzyme lipase được ổn đònh, thường nhỏ hơn 500ppm đối với enzyme lipase cố đònh. [...]... 21 Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp PHẦN 3 Các phương pháp Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Lipase 3.1 NỘI CHUYỂN HÓA ESTER BẰNG ENZYME LIPASE CỐ ĐỊNH Việc cố đònh enzyme lipase để ứng dụng trong phản ứng thủy phân cũng như tổng hợp liên kết ester đã trở nên phổ biến Bởi vì enzyme lipase cố đònh có những ưu điểm hơn hẳn so với enzyme lipase tự do, ví dụ như khả năng tái sử dụng enzyme, .. .Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 2 – Enzyme Lipase PHẦN 2 Enzyme Lipase trong phương pháp Nội chuyển hóa ester bằng enzyme 2.1 GIỚI THIỆU Lipase (triacylglycerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3) là enzyme tham gia quá trình xúc tác cho phản ứng thủy phân thuận nghòch triacylglycerol ở điều kiện bình thường Lipase khác với enzyme esterase ở điểm chỉ thủy phân cơ chất... (Tatsuo Maruyama và cộng sự, 2000) Hình 2.1 – Hoạt tính bề mặt của enzyme lipase: E, enzyme trong pha nước; Ea, enzyme hấp phụ trên bề mặt; Ea*, enzyme được hoạt hóa; S, cơ chất; Ea*S, phức enzyme cơ chất; Ea*Ac, acylenzyme; P1,P2 sản phẩm thủy phân Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 17 Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 2 – Enzyme Lipase 2.4.2.2 Cơ chế phản ứng thủy phân Phản ứng thủy phân được thực hiện... Các liên kết đồng hóa trò giữa chất mang và enzyme có thể phân loại như sau: Diazo hóa : chất mang – N=N – enzyme Tạo cầu amit : chất mang – CO – NH – enzyme Alkyl hóa và aryl hóa : chất mang – CH2 – NH2 – enzyme Tạo base Schiff : chất mang –CH=N – enzyme Trao đổi tidol-disulfua : chất mang – S – S – enzyme Phương pháp: có hai phương pháp gắn enzyme lên chất mang bằng liên kết đồng hóa trò Gắn một giai... đệm phosphate 0,05M (pH=7) Cố đònh enzyme: bằng cách cho 2mL dung dòch enzyme lipase vào trong dung dòch ngâm silica gel đã được hoạt hóa, khuất trộn trong 2 giờ ở 20oC Thu nhận enzyme cố đònh bằng phương pháp lọc, sau đó rửa bằng nước và bảo quản trong dung dòch đệm phosphate 0,05M (pH=7) ở nhiệt độ 4oC Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 27 Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Silica... tổng hợp nên enzyme lipase phải được hoạt hóa trước bằng chất cảm ứng Chất này sẽ giúp giải phóng enzyme RNA polymerase thoát khỏi sự kìm hãm của chất ức chế bằng cách kết hợp với chính chất ức chế đó Bản chất của chất cảm ứng chính là cơ chất chòu sự xúc tác của loại enzyme lipase này Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 13 Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 2 – Enzyme Lipase Kết thúc quá trình phiên... xốp vừa đủ để enzyme chui vào thì sẽ làm giảm sự tiếp xúc cơ chất với enzyme Vì vậy, hoạt tính của enzyme lipase cố đònh thường nhỏ hơn hoạt tính của enzyme hòa tan cùng loại Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 23 Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Theo Lee và Akoh (1998), việc cố đònh enzyme lipase lên các chất mang khác nhau sẽ ảnh hưởng đến hoạt tính cũng như độ bền của enzyme được... đònh enzyme lipase trên chất mang silica gel bằng liên kết đồng hóa trò phải được tối ưu như sau: Tiền xử lý silica gel với 35% hydrogen peroxide Silan hóa bề mặt chất mang bằng 15% 3-APTES trong acetone và sử dụng 2% glutaraldehyde đã được xử lý trong dung dòch nước ở 65oC trong 25 phút Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 32 Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Sau khi liên kết với enzyme, ... tinh − Phương pháp điện di − Phương pháp sắc ký Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 15 Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 2 – Enzyme Lipase 2.4 TÍNH CHẤT VÀ PHẢN ỨNG CỦA ENZYME 2.4.1 Cấu trúc phân tử Enzyme lipase thu nhận từ vi sinh vật là nguồn enzyme đầy tiềm năng và được nghiên cứu một cách sâu rộng Nhìn chung, enzyme lipase có cấu trúc α/β với vò trí trung tâm là lưới hỗn hợp β chứa bộ ba xúc... kết ester mới Các enzyme lipase cố đònh có hàm lượng nước từ 8,9 đến 18,7% khi điều kiện sấy không hiệu quả sẽ ảnh hưởng đến hàm lượng sản phẩm tạo thành do cơ chất bò thủy phân hoàn toàn Bảng 3.3 – Hàm lượng sản phẩm tạo thành khi tái sử dụng enzyme lipase cố đònh Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 25 Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp 3.1.1.2 Phương pháp gắn enzyme lên chất mang bằng . ứng nội chuyển hóa ester: S, stearoyl; O, oleoyl; L, linoleoyl. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 1 – Giới thiệu Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 5 1.2. PHƯƠNG PHÁP NỘI CHUYỂN HÓA ESTER. đến 5 ngày. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 1 – Giới thiệu Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 4 1.1.2.3. Nội chuyển hóa ester Đây là một trong những phương pháp chuyển hóa ester mà được. Gunstone, 2006). Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 1 – Giới thiệu Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 2 1.1.2. Phân loại các phương pháp chuyển hóa ester Chuyển hóa ester là phản ứng hóa học làm