bài giảng về sắc ký

Techniquese in Biotechnology Sắc Ký Tổng quan về sắc ký Khái niệm chung Sắc ký là tên gọi chung của một nhóm phơng pháp tách các chất. Tên gọi này sau đó đợc giữ nguyên mặc dù nhiều chất phân tách không có màu. Lịch sử Năm 1903, nhà khoa học ngời Nga Svet lần đầu tiên đã sử dụng cột hấp phụ (than hoạt tính) để tách các sắc tố thực vật từ một hỗn hợp ban đầu (thành các lớp có màu khác nhau), từ đó đã đặt tên cho phơng pháp là sắc ký (chromatography -ghi màu, theo đó gốc từ Hylạp chromato- màu sắc cũng đồng thời bao hàm nghĩa tên của ông trong tiếng Nga). Tên gọi này sau đó đợc giữ nguyên mặc dù nhiều chất phân tách không có màu. Tổng quan về sắc ký Phơng pháp này sau một thời gian bị lãng quên lại đợc phát triển mạnh từ sau 1930, với các phát kiến về. Sắc ký trao đổi ion (1935), Sắc ký trên giấy (1940), Sắc ký khí (1940- 50), Sắc ký lớp mỏng (1938- 50), Sắc ký lọc gel (1959). Tổng quan về sắc ký Nguyên tắc chung Nguyên tắc chung của mọi phơng pháp sắc ký là dựa trên sự phân bố các chất giữa 2 pha:mộtcố định và một di động. Tổng quan về sắc ký Phân loại Có thể phân chia sắc ký thành 3 nhóm dựa trên hiện tợng hoá lý xảy ra trong quá trình tiến hành: Sắc ký hấp phụ. Sắc ký phân bố Sắc ký trao đổi ion (tđio). Một cách phân loại khác dựa trên hình dạng chất giá của pha cố định hoặc bản chất của pha di động: Sắc ký trên cột Sắc ký trên giấy Sắc ký lớp mỏng Sắc ký khí. C¸c ph$¬ng ph¸p s¾c ký láng ®Ó t¸ch protein C¸c ph$¬ng ph¸p s¾c ký láng ®Ó t¸ch protein Sắc ký trao đổi ion Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) (Ion- exchange chromatography - IEC) Giới thiệu chung Tơng tác ion - cơ sở của việc tách và tinh chế protein bằng IEC- đã đợc ứng dụng thành công từ cuối những năm 1940. Theo những thống kê mới nhất, IEC là kỹ thuật tách protein đợc sử dụng nhiều nhất trong các quy trình tinh chế (có thể bao gồm nhiều bớc và nhiều kỹ thuật khác nhau): IEC: 75%, sắc ký ái lực (AC): 60%, sắc ký lọc gel (GF): 50% các trờng hợp. Những số liệu thống kê từ các công bố gần đây (từ 7 tạp chí hoá sinh học uy tín nhất thế giới trong 2 năm 1996- 1997) cho thấy IEC hiện đợc vẫn là phơng pháp phổ biến nhất trong các bớc sắc ký của quy trình tinh sạch protein (với cả protein thờng và protein tái tổ hợp): chiếm khoảng 40% (AC: 16,5% , GF: 17%). Nguyên tắc của IEC: Trớc tiên, protein sẽ gắn thuận nghịch với các chất trao đổi bằng t ơng tác ion giữa các nhóm mang điện tích trái dấu, Sau đó, protein gắn đợc chiết rút riêng biệt, thờng là nhờ việc tăng dần lực ion (khiến cho tơng tác ion bị bẻ gãy hoàn toàn) Hay dùng nhất là gradient của NaCl) của đệm (có rất nhiều loại khác nhau đợc sử dụng để cân bằng chất trao đổi), Có thể bằng cách thay đổi pH (ít dùng hơn) khiến các nhóm tơng tác trên protein bị mất điện tích Mặc dù đây là phơng pháp thông dụng trong nhiều phòng thí nghiệm hoá sinh, cơ chế cơ bản trong tơng tác giữa protein và bề mặt tĩnh điện vẫn còn ít đợc hiểu biết. Sắc ký trao đổi ion Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) (Ion- exchange chromatography - IEC) [...].. .Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) The principle of ion-exchange chromatography (salt gradient elution) Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) The principle of ion-exchange chromatography The fractionation of variously charged molecules (squares) on an anion exchanger (cirles) Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography... tác động lên quá trình trao đổi ion Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Nguyên tắc của IEC là phân tách dựa trên sự khác biệt về ion Gồm có pha tĩnh (cột nhồi gel, với khác biệt là có các nhóm chức năng ở dạng ion hoá) Pha động Về cách thực hiện IEC gồm hai bước: 1) gắn protein vào các điện tích cố định trên cột 2) chiết rút chúng ra Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography... proton hoá và được tách (rời) ra bằng nhóm amin proton hoá Đối với chất trao đổi cation thì ngược lại Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Theo nguyên tắc chung: Các protein khác nhau về lượng gốc Asp và Glu (a.a axit) tổng số sẽ được tách bằng nhựa trao đổi anion Các protein khác nhau về Lys, Arg và His sẽ được tách bằng nhựa trao đổi cation Tuy nhiên còn nhiều tác nhân khác ảnh hưởng... sử dụng giá trị pH mà tại đó chúng có chứa lượng gốc tích điện khác nhau đáng kể trên 1 phân tử Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Có thể lựa chọn kiểu tách protein bằng điện di trên gel polyacrylamid trong điều kiện acid và kiềm, những phân tách này sẽ là những kiểu phân tích sắc ký trao đổi cation và anion tương ứng Ví dụ nếu tách phân tích tốt một hỗn hợp bằng điện di kiềm... cao hơn dạng sợi cũ Dung tích với protein là tương đối giống nhau ở các loại nhựa: (0.11- 0.15 g albumin/ ml của các loại dẫn xuất DEAE Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Schematic morphological structure of different support materials Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Cách chuẩn bị và tái sinh cột Cần rửa, làm trương (một số nhựa được bán ở dạng đã được... chọn Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Chọn đệm: pH cần ở trong khoảng cho phép của nhựa và cần không gây hại đến protein Để protein có thể gắn được lên nhựa, ít nhất pH phải cách 0,5 hoặc tốt hơn là 1 đơn vị so với pI của nó (cao hơn đối với anionit, thấp hơn với cationit) pH cách quá xa sẽ tạo ra sự liên kết quá mạnh với nguy cơ gây biến tính và hiệu suất thấp Sắc ký trao... đệm thường cho đến khi dịch chảy ra đạt đến pH cần Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Chuẩn bị cột: Thường tỉ lệ giữa đường kính và chiều cao cột từ 1/10 đến 1/20 Lượng nhựa cần dùng được tính từ dung lượng trao đổi của nhựa và lượng mẫu thử rồi thường lấy thừa ra 50% Nhựa được cho (nhồi) vào cột, ở đáy có bông thuỷ tinh Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC)... cùng thường là 1 đối với đa số protein Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Hoặc nồng độ đệm có thể tăng, hoặc được giữ nguyên và tăng các ion khác (như NaCl) Cách sau hay hơn vì khả năng đệm, do đó pH, được giữ nguyên trong quá trình tách Nhựa có thể bảo quản ở 40 oC với chất diệt khuẩn (0,03% toluene), với cationit có thể dùng azid Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography... chromatographic separation) is often expressed as the resolution (Rs) between the peaks of interest Determination of the resolution (Rs) between two peaks Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Separation results with different resolutions Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Hypothetical chromatogram V0 = void volume, VR1 = elution volume for peak 1, VR2 = elution volume... illustration The separation of an amino acid mixture at pH 3.0 on EIC column (above); Automatically recorded highperformance liquid chromatographic analysis of amino acids on a cationexchange resin (below) Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Những nguyên nhân giải thích sự thông dụng của IEC Có độ phân giải cao, Khả năng liên kết protein lớn, Đa dạng (các loại nhựa trao đổi khác nhau, . động: Sắc ký trên cột Sắc ký trên giấy Sắc ký lớp mỏng Sắc ký khí. C¸c ph$¬ng ph¸p s¾c ký láng ®Ó t¸ch protein C¸c ph$¬ng ph¸p s¾c ký láng ®Ó t¸ch protein Sắc ký trao đổi ion Sắc ký trao. di động. Tổng quan về sắc ký Phân loại Có thể phân chia sắc ký thành 3 nhóm dựa trên hiện tợng hoá lý xảy ra trong quá trình tiến hành: Sắc ký hấp phụ. Sắc ký phân bố Sắc ký trao đổi ion (tđio). Một. màu. Tổng quan về sắc ký Phơng pháp này sau một thời gian bị lãng quên lại đợc phát triển mạnh từ sau 1930, với các phát kiến về. Sắc ký trao đổi ion (1935), Sắc ký trên giấy (1940), Sắc ký khí