các kỹ thuật DNA Markers

các kỹ thuật DNA Markers

BM CÔNG NGHỆ SINH HỌC

****

CÁC KỸ THUẬT DNA

MARKER

Môn học: sinh học phân tử GVHD: TS Trần Thị Dung

Nhóm 10:

Tháng 2/2014

Nội dung

 1 DNA marker

 2 Các kỹ thuật:

1 Kỹ thuật RFLP (Restriction fragment length polymorphism)

2 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polimorphism)

3 Kỹ thuật RAPD (Random Amplification Polymorphic DNA)

1.DNA MARKER

 Về bản chất, bất kỳ chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt hai cá thể, hai dòng hoặc hai giống khác nhau đều có thể được xem như một DNA marker

 Các DNA marker có thể chia thành hai nhóm:

-Marker dựa trên cơ sở lai DNA: RFLP, minisatellite

-Marker dựa trên sự khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR: ALP, AFLP, SSR, SSCP, RAPD

 Dựa trên kiểu hình có thể phân loại DNA marker thành 2 loại:

-Marker đồng trội: là kiểu chỉ thị có biểu hiện khác biệt giữa các cặp allene Là những

marker có thể phân biệt được cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử, đó là các marker

allozyme, microsatellite, PCR nhân RFLP Trong trường hợp này tần số alen có thể được tính trực tiếp từ dữ liệu kiểu gen

-Marker trội: là kiểu chỉ thị có biểu hiện đồng nhất hoàn toàn giữa 1 cặp allene Là những

marker không thể phân biệt những cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử vd: RAPD marker

RFLP Restriction fragment length polymorphism

AFLP Amplified freagment lenth polymorphism

RAPD Random Amplification Polymorphic DNA

SSR Single sequence repeat (microsatellite)

SSCP Single strand conformation polymorphism

MRDHV-DNA Moderately repeated, dispersed and highly variable DNA (minisatellite)

2 MỘT SỐ KỸ THUẬT DNA MARKER

2.1 Restriction fragment length polymorphism – đa hình

chiều dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP)

Định nghĩa:

 Kỹ thuật phân tích RFLP (đọc là / ri-flip/- viết tắt của Restriction Fragment Length

Polymorphism)

 RFLP được định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự

khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn khi có sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác

Nguyên tắc

 Dựa trên độ đặc

hiệu của các

enzyme cắt hạn chế

(RE) đối với vị trí

nhận biết của chúng

trên DNA bộ gen

 DNA bộ gen sẽ

được cắt bằng các

enzyme cắt giới

hạn, chạy điện di

qua gel agarose,

thấm qua màng lai

và lai với một mẫu

dò DNA (được đánh

dấu phóng xạ) liên

kết với một locus

đặc biệt

 Sự khác biệt vị trí

cắt giữa hai cá thể

sẽ tạo ra những

phân đoạn cắt khác

nhau

T-RFLP method

Ưu và nhược điểm

 Ưu điểm :

 Là marker đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp và dị hợp

 Do kích thước DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng marker tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu

 Hạn chế:

 Do qui trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đối với sức khoẻ người nghiên cứu (sử dụng phóng xạ đánh dấu)

 DNA yêu cầu có chất lượng cao

Ứng dụng

• phân biệt giống, phân biệt cá thể

• phát hiện gen đã chuyển trong quá trình nghiên cứu chuyển gen cây trồng

• lập bản đồ di truyền

1.Xác định thông tin di truyền:

Schematic for RFLP by cleavage site loss

2.Phân tích cấu trúc di truyền DNA ứng dụng trong Y pháp nhận dạng :

Từ những năm 30s dấu vân tay được đưa vào ứng dụng trong Y Pháp (Forensics) và trở thành một công cụ cần thiết trong phòng thí nghiệm của cảnh sát hình sự và thám tử để nhận dạng Tuy nhiên dấu vân tay bộc lộ nhiều khiếm khuyết một khi áp dụng trong thực tế Chẳng hạn, dấu vân tay thông thường chỉ có thể lấy mẫu được từ các đầu ngón tay mà thôi Đã thế ngày nay nó không còn đặc hiệu cho từng cá thể nữa từ khi phẫu thuật chỉnh hình phát triển mạnh, người ta có thể chủ định thay đổi dấu vân tay qua phẫu thuật Chỉ trong vòng trên dưới 50 năm từ khi cấu trúc chuỗi di truyền DNA được Watson và Crick công bố [1], ngành sinh học phân tử đã phát triển mạnh mẽ và được ứng dụng rộng rãi Một trong những ứng dụng quan trọng của sinh học phân tử là sử dụng đặc tính của cấu trúc chuỗi di truyền DNA của từng cá thể vào trong Y pháp để nhận dạng đối tượng coi như là một cuộc cách mạng trong Y học hình sự của nhân loại

Tương tự như dấu vân tay, mỗi một con người đều có một đặc trưng riêng về cấu trúc di truyền của mình, được xác định bằng chuỗi di truyền DNA

Cấu trúc của DNA [1], và"điểm chỉ" DNA:

Đặc tính của tất cả các sinh vật, kể cả con người, đều được cấu tạo từ đơn vị căn bản nhất là tế bào,

từ nguyên thuỷ là hợp tử được thụ tinh bởi trứng và tinh trùng Về phương diện sinh học phân tử, mỗi tế bào của cơ thể (trừ hồng cầu) đều có nhân, trong nhân chứa các chất liệu di truyền, nhiễm sắc

thể (chromosome) quyết định cấu trúc đặc tính cho mỗi cá thể Con người có 23 bộ nhiễm sắc thể (22 đôi thường và một đôi xác định giới tính) Các nhiễm sắc thể này được tạo bởi các chuỗi chất liệu chứa đựng thông tin di truyền DNA (viết tắt của từ DeoxyriboNucleic Acid) thừa kế từ cha và

mẹ Mỗi cá thể sống nhận chất liệu DNA 50% từ cha và 50% từ mẹ

Có thể hình tượng cấu trúc phân tử của một DNA như là một cái phéc-mơ-tuya (zip), mỗi răng kéo là một trong bốn khối chất liệu căn bản, viết tắt bằng các ký tự A (adenine), C (cytosine), G (guanine), và T (thymine), mà mỗi một ký tự đó gọi là một nucleotide, chúng cũng đứng song đôi như các răng kéo của phéc-mơ-tuya theo cặp cố định A-T hoặc G-C Thông tin chứa đựng trong DNA được xác định cơ bản bằng chuỗi tiếp nối các ký tự này dọc theo cái "phéc-mơ-tuya" di truyền

đó Các 'ký tự' này đứng theo một thứ tự và một số lượng nhất định để tạo thành đơn vị lớn hơn gọi

là gien Nhiều gien nối lại với nhau tạo thành nhiễm sắc thể Theo ước tính mới nhất, con người có khoảng 35000 bộ gien Trong đó chỉ có 1% số lượng gien đóng vai trò chức năng (thí dụ như gien quy định màu da, tóc v.v ), 99% còn lại là những gien không có chức năng, các gien này rất đa dạng, khác nhau ở từng cá thể Cho nên chẳng thể có người nào giống người nào về cấu trúc di truyền DNA cả, trừ đó là người sinh đôi cùng trứng

'Hồ sơ' DNA (tạm dịch từ DNA profiling) là một phần nhỏ trích từ cấu trúc toàn bộ của chuỗi DNA (của một cá thể), tức là các bộ gien và thuộc phần gien không có chức năng, đủ để phản ánh đặc thù riêng nhất của mỗi cá thể không lẫn lộn với người khác Và cũng từ đó mà thuật ngữ "Điểm chỉ" DNA (tạm dịch từ DNA fingerprint)- cũng chính là 'hồ sơ DNA', do một nhà Di truyền học người Anh, Alec Jeffreys đề xuất, để nói lên một đặc trưng duy nhất cho mỗi cá thể giống như là dấu vân tay (hay điểm chỉ) 'Điểm chỉ' DNA là hoàn toàn giống nhau ở tất cả các tế bào, tổ chức mô, tạng phủ trong một cơ thể; và điểm chỉ DNA không có thể thay đổi được bằng bất cứ hình thức nào với tri thức của nhân loại hiện nay

Về nguyên lý nhận dạng cá thể sống bằng DNA rất đơn giản, đó là nguyên lý so sánh và ghép cặp Đối với nhận dạng vết tích thì người ta đem mẫu DNA của vết tích so sánh với mẫu DNA dự trữ hoặc với các mẫu nghi ngờ Đối với việc nhận dạng quan hệ huyết thống (cha mẹ chẳng hạn), người ta đem so sánh DNA của cha, mẹ với cá thể đó để xem có quan hệ di truyền hay không Nói nôm na là như biển số đăng ký xe Mỗi một chiếc xe có một biển số riêng, người ta có thể dựa vào

hồ sơ đăng ký có thể xác định chính xác chủ nhân hiện thời của chiếc xe đó, tương tự mỗi chủ nhân

có một thẻ đăng ký xe, khi mất xe họ có thể dùng số đăng ký đó đi truy tìm chiếc xe ở đâu Kỹ thuật nhận dạng bằng DNA cũng y như vậy nhưng điều đặc biệt là DNA không thể thay đổi được, và nó 'ẩn' bên trong cơ thể, phải dùng các phương pháp kỹ thuật nhất định để có thể đọc được nó mà thôi

Tuy nhiên như đã trình bày vì cấu trúc di truyền DNA đầy đủ của mỗi một cá thể rất phức tạp, người ta không thể và không cần thiết phải sử dụng toàn bộ 35 nghìn bộ gien để đi phân tích, so sánh Do đó chỉ sử dụng những bộ gien (khoảng chừng 12 gien hoặc ít hơn) hoặc các marker (đoạn đặc trưng) của các gien (không có chức năng) sao cho đủ để đặc trưng cho mỗi cá thể để phân tích

mà thôi

Ứng dụng thực tế của công nghệ điểm chỉ DNA:

Điểm chỉ DNA được ứng dụng trong cuộc sống hàng ngày với mục đích: (a) Trong Y pháp, hình sự : để xác định quan hệ phụ hoặc mẫu hệ; để nhận dạng tội phạm cũng như loại trừ nghi can thông qua dấu vết của cơ thể để lại hiện trường; nhận dạng cá nhân, nạn nhân vô thừa nhận (b) Trong Y học điều trị: để chẩn đoán các bệnh về di truyền; phát triển các phương pháp để chữa các rối loạn về di truyền (c) Trong các ngành khoa học khác: Như trong khảo cổ học; hoặc trong nông-lâm-ngư nghiệp dùng để vẽ bản đồ gien (mapping), tạp giao, lai giống, chuyển gien, để nhận dạng dấu vết các loài thú quý hiếm Một trong ứng dụng mới nhất của công nghệ phân tích điểm chỉ DNA trong nông nghiệp là để bảo vệ tác quyền thương mại các sản phẩm, hay giống lai tạo mới

Tuỳ theo các mục đích khác nhau mà người ta tiến hành cách thức thu thập mẫu để có được chuỗi DNA cơ bản đầu tiên để phân tích khác nhau Trong ứng dụng nhận dạng con người các mẫu

thu thập cũng tuỳ theo yêu cầu mà có thể lấy mẫu máu, tóc, lông, da v v đặc biệt trong nhận dạng tội phạm hình sự, mẫu thu thập rất đa dạng tuỳ theo tính chất sự kiện các dấu vết được để lại hiện trường

Các kỹ thuật phân tích điểm chỉ DNA hiện hành [2]:Có nhiều kỹ thuật phân tích nhưng hai

kỹ thuật thông dụng nhất hiện nay là:

Kỹ thuật phân tích RFLP (đọc là / ri-flip/- viết tắt của Restriction Fragment Length Polymorphism) (tạm dịch là các đoạn gien có độ dài giới hạn đa hình thái) Xuất phát từ thực tế là

các đoạn DNA chức năng và các đoạn DNA không chức năng có thể tồn tại dưới nhiều hình thái khác nhau Bằng cách sử dụng các enzyme đặc hiệu, chẳng hạn Restriction enzyme, có thể cắt ra các đoạn gien RFLP Người ta đã có thể nhận dạng được đến vài nghìn loại RFLP, rất đặc hiệu cho cơ thể

Kỹ thuật phân tích PCR/STR (Polymerase chain reaction/Short Tandem Repeat)

Tức là kỹ thuật dùng phản ứng chuỗi enzyme đa phân để 'khuếch đại' các đoạn gien ngắn có độ lặp ngắn theo thứ tự (Short Tandem Repeat, STR) Ở đây polymesase tức là một loại enzyme có thể cho phản ứng tạo ra nhiều bản copy của một đoạn DNA nào đó; phản ứng chuỗi tức là một phản ứng diễn ra liên tục Như vậy bằng kỹ thuật PCR có thể trong một thời gian ngắn tạo ra hàng triệu triệu đến hàng tỷ bản copy của một STR Kỹ thuật này còn được gọi là kỹ thuật "khuếch đại DNA" hay

"Photocopy phân tử" trong một lối nói rộng rãi hơn

Đây là một kỹ thuật hiện đại nhất hiện nay được dùng trong Y pháp DNA Về mặt cơ bản kỹ thuật này cũng tiến hành tương tự như kỹ thuật RFLPs Lợi điểm của kỹ thuật này so với RFLP là:

- Mẫu thu thập không nhất thiết phải đạt tiêu chuẩn cao, những mẫu lấy từ các mô bị huỷ hoại hoặc cháy bỏng nặng, xác thối rữa do chôn lâu đều có thể dùng được, hoặc chỉ lấy các 'vi vết' như tàn thuốc lá, vết dính nước bọt, những mẫu bệnh phẩm bị trộn lẫn như máu của nạn nhân lẫn với máu hay dịch của phạm nhân

Các đặc điểm khác nhau về kỹ thuật cơ bản giữa PCR/STR vơi RFLP là: (a) Trong nhận dạng quan hệ huyết thống, nếu phân tích một gien bằng kỹ thuật RFLP chỉ có thể cho ra tối đa hai dị hợp tử (allele) và ba kiểu gien (genotype), trong khi đó dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại số lượng gien này lên, thì có thể cho ra đến 20 dị hợp tử và đến (20x21)/2 kiểu gien, và vì thế kỹ thuật này cho phép đánh giá chính xác hơn, (b) kỹ thuật PCR/STR gắn huỳnh quang rất tốt, nên rất dễ phát hiện tự động, thuận lợi cho phân tích pháp y, bảo quản và dễ phục hồi số liệu

Sau khi có các đoạn gien cần thiết được cắt đoạn, xếp theo kích thước, phân loại, thông qua hai kỹ thuật trên, các đoạn DNA này được chuyển dạng, nhuộm màu hoặc gắn huỳnh quang và tạo thành các thanh (như các thanh mã (bar codes) trong các gói hàng bán trong siêu thị), và dùng để so sánh đối chiếu

2.2 Random Amplification Polymorphic DNA – đa hình

Khái niệm:

 RAPD (đọc là "rapid") là chữ viết tắt của Random Amplification of Polymorphic DNA nghĩa

là đa hình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên do William (1990), Welsh và cộng sự (1991) phát minh

 Là phương pháp dựa trên kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) nhằm đánh giá tính đa

hình của các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên

Nguyên tắc

 Nguyên tắc phản ứng RAPD cũng như nguyên tắc phản ứng PCR thông thường Tuy nhiên,

vì sử dụng mồi ngẫu nhiên nên nhiệt độ bắt cặp của mồi thấp để tạo điều kiện bắt cặp không nghiêm ngặt

 Nhiệt độ bắt cặp của phản ứng là 30oC-36oC

RAPD chỉ sử dụng các mồi oligonucleotide được tổng hợp ngẫu nhiên từ 9-12 base nên dễ dàng tìm được các đoạn tương đồng trên mạch đơn DNA bộ gen

Các đoạn mồi nếu bắt cặp ngẫu nhiên với cả hai mạch đối diện của mạch khuôn DNA trong khoảng cách có thể khuếch đại được (dưới 3000bp) sẽ cho ra những đoạn DNA có kích thước khác nhau sau khi khuếch đại

Tính đa dạng thu được nhờ RAPD là đáng tin cậy, vì khi có sự thay đổi một base nitơ nào đó thì nó

sẽ ngăn cản việc tiếp hợp giữa mồi và DNA mạch khuôn Sự mất đoạn nhiễm sắc thể hoặc sự thêm bớt điểm gắn mồi cũng như sự xen vào của một gen nào đó sẽ làm thay đổi kích thước đoạn DNA được khuếch đại

Tuỳ vào từng nhóm loài thực vật hay vi sinh vật mà các đoạn mồi ngẫu nhiên được thiết kế đặc dụng Sản phẩm của PCR gồm nhiều đoạn DNA có kích thước từ 2-100 bp

Kết quả sau khi điện di sản phẩm RAPD sẽ phát hiện được sự khác nhau trong phổ các đoạn DNA được nhân bản

Sự khác nhau này được gọi là tính đa hình

Tính đa hình của các đoạn DNA được phát hiện khi điện di sản phẩm PCR trên gel agarose hay polyacrilamid, sau đó nhuộm ethidium và soi dưới đèn tử ngoại

Tính đa hình của các mẫu RAPD-PCR là do sự thay đổi một hoặc cả hai vùng gắn primer (ví dụ đột biến điểm) hay là do những thay đổi (thêm đoạn, mất đoạn, đảo đoạn) trong đoạn DNA được nhân lên, gây ra sự thay đổi về kích thước hay cản trở quá trình nhân lên của DNA này

Tính đa hình sẽ thể hiện thông qua sự có hay vắng mặt của vạch điện di tương ứng

Tính đa hình được nhận ra do: khi phân tích đa hình di truyền bằng kỹ thuật RAPD, nếu 2 cá thể có genome hoàn toàn giống nhau thì khi làm phản ứng PCR-RAPD với bất kỳ mồi nào cũng cho các băng giống nhau

Đoạn mồi ngẫu nhiên có thể bám vào bất cứ vị trí nào có trình tự nucleotide bổ sung trên phân tử DNA genome Với đặc điểm là ngắn nên xác suất đoạn mồi có được điểm gắn trên phân tử DNA khuôn là khá lớn

Theo tính toán, một mồi ngẫu nhiên gồm 10 nucleotide thì xác suất bắt cặp của nó là 1x410 =

1.048.576 Ở lúa, bộ DNA nhân đơn bội có khoảng 550.000kb =550.000.000 bp

Như vậy, với một mồi ngẫu nhiên có thể có 524 vị trí bắt cặp với mồi nghĩa là có thể có 262 đoạn DNA được nhân bội

Do kỹ thuật RAPD chỉ sử dụng một loại mồi đồng nhất cho cả 2 đầu đoạn DNA cần nhân bản, ngoài

ra hai đoạn mồi này phải kết cặp trên 2 sợi đơn khác nhau của chuỗi DNA và phải “đi” theo chiều hướng vào nhau nên xác suất trên sẽ phải nhỏ đi nhiều

Xác suất này sẽ còn nhỏ hơn nữa do trong điều kiện thông thường kỹ thuật PCR chỉ tổng hợp được một đoạn DNA không dài quá 5000 nucleotide dẫn đến việc phản ứng PCR chỉ hiệu quả khi hai đoạn mồi kết cặp với DNA genome ở vị trí không xa quá 5000 bp

Trong thực tế, số lượng này nhỏ hơn nhiều vì còn phụ thuộc vào độ dài của đoạn được nhân bội và

sự sắp xếp các trình tự bắt cặp với mồi trên DNA genome của lúa

Quy trình thực hiện

 Kỹ thuật RAPD được thực hiện theo các bước cơ bản sau:

- Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR

- Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid

- Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYS-PC,

GELCOMPAR, …) Các số liệu cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu

Ưu và nhược điểm

Ưu điểm

• Đơn giản, dễ thực hiện

• RAPD là phương pháp phân tích nhanh, rẻ tiền hơn RFLP và chỉ sử dụng một lượng mẫu DNA rất nhỏ (25ng) Phương pháp này không đòi hỏi việc phân lập và đọc trình

tự, cho phép phát hiện nhiều locus cùng một lúc

• Không cần biết thông tin đoạn gene cần khuếch đại

• RAPD marker tỏ ra rất hiệu quả trong việc thiết lập bản đồ gen của các cây họ tùng bách trong khi các RFLP marker không thể dùng cho mục đích này bởi vì hàm lượng DNA trong các mô của các giao tử lớn rất thấp và sự đòi hỏi thời gian dài để thu được quần thể F2

•

 Thích hợp với phòng thí nghiệm có đầu tư vừa phải, nhân sự ít kinh nghiệm Nhược điểm:

• Độ tin cậy, độ lặp lại không cao

• Không phân biệt được đồng hợp tử và dị hợp tử

• Không chắc chắn được cung một band sản phẩm là 1 hay nhiều sản phẩm

• Các đoạn mồi ngắn dùng để xác định các RAPD marker cũng nhân lên một vài trình tự từ các vùng không liên kết Vì vậy các marker như vậy không thể sử dụng để đánh giá các dòng từ