Tách chiết Chlorophyll A và chuyển hóa thành Chlorin-e6-Trimetyl Este để làm hoạt chất chữa trị ung thư bằng liệu pháp quang

ĐẠI HỌC Q ư ỏ c GIA HA NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN ;ịí ^ ^ ^ TÊN Đ Ể TÀI: TÁCH CH1ÉT CH LO R O PH Y L L A VÀ C H U Y Ể N H Ó A TH ÀNH CH L O RIN-e6-TR IM ETYL ESTE ĐÊ LÀM H O ẠT CHẤT CHỮA TRỊ ƯNG T H Ư B Ầ N G LIỆU PHÁP Q U A NG M Ã SỐ: QG-11-08 CHỦ TRÌ ĐÈ TÀI : PGS. TS. TRẦN THẠCH VĂN CÁC CÁN B ộ THAM GIA: TS. ĐOÀN DUY TIÊN TS. TRẦN THỊ THANH VÂN HVCH. TRẦN THỊ HIÈN HÀ NỘI - 2013 c Á 0 ( c m r r ? ỉ , L í. BAO CAO TOM TẢT: n. "l en đề tài: Tách chiết chlorophyll (I và chuyển hóa thành chlorin-efi-trimetyl estc đ ê là 111 hoạt ch ât chữ a trị 11 tì <4 thư bang liệu ph áp q ua ng Mã số: Q G -11 -0 8 b. C hủ trì đề tài: PCìS. TS. Trần Thạch Văn c. C ác cán bộ tham gia: TS. Đ oàn Duy Tiên TS. Trần Thị Thanh vân H VC H. Trần Thị H iền (I. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu: M ục tiên : Xây dựng quy trình tách chiết chlorophyll a từ vi khuẩn lam và chuyển hóa thành ch lonn-e ó-triinetyl este để làm hoạt chất chữa trị ung thư bằng liệu pháp quang. N ội (htiĩo: • Ngh iên cứu quá trình chiết tách liên tục chlorophyll a từ vi khuẩn lam và thực hiện phản ứng chuyển hóa chlorophyll a thành pheophytin a. • Nghiên cửu quá trình chiết lách gián đoạn chlorophyll a từ vi khuẩn lam và chuyển hóa trực tiếp thành metyl pheophorbide a bằng phương pháp chiết và chuyển vị este một giai đoạn. • N gh iên cứu phản ứng chuyển hóa m etyl pheophorbide a thành chlorin-er,- trimetyl este bằng phản ứrm m ở vòng cacboxyclic. • X ác định cấu trúc các sản phẩm trung gian và ch lorin-e6-trimetyl este. e. C ác kêt q u ả đ ạt dirọc: K ết quả thực nghiệm: • Quy trình tách chiết và chuyển hóa chlorophyll a từ vi khuẩn lam thành chlorin- e6-trimety] este có độ tinh khiết cao. • Đ iều chế 2g chlorin-e6-trhnethyl este đủ để xác định cấu trúc và phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. K é t quá c ôn g bố: Với kết quả dó đã cône, bố các côn g trình sau đây: Trần Thạch Văn, Trần Thị Thanh V ân, Trần Thị H iền, Đ ặng Thị Thủy A n,N guyên Anh D ĩìno, Đ oàn D uy Tiên, T ách ch iêt chloro phill a từ vi k huân cy an o bacteria và chuy ến h óa thành p h eop h ytin a, Tạp chí Hóa học T.50 (4A ), Ir. 2 88 -29 0, 2012. - Trần Thị Thanh Vân, N guy ễn Thị H iển, Đ oàn D uy Tiên, P h ư o n g p há p m ói tách chiết chlorophyll a và chuyển hóa một giai đoạn thành methylpheophorbicle a, Tạp chí Khoa học và C ôn 2, ne;hệ, T .50 (3E), tr. 13 32-1337, 2012. x é t quả đà o tạo: D ựa trên đề tài đà ctào tạo được 01 sinh viên làm ngh iên cứu khoa học năm học 20 11 -2012: Đặng Thị Thùy An K 54A - 01 sinh viên làm khóa luận tốt n°hiệp: N gu yễn A nh D ũng K 54A (năm 2013) I liền H V C H khóa 20. f. Tinh hình kinh phí cùa đề tài: T ổng kinh phí được cấp cho v iệc thực hiện đề tài trong 2 năm là 160 triệu đồng chủ yếu được dùng để mua hoá chất nghiệm. M ột phần khác được dùng để thuê m ướn chuyên m ôn và lao động. Đã quyết toán kình p h í của hai năm. KIIOA QUAN LY (Ký và ghi rõ ho tên) CHỦ TRÍ ĐẺ TAI (Ký và ghi rõ họ tên) PGS. TS. Nguyên Thi Câm Hà PGS. TS. Trần Thạch Văn TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỤ NHIÊN a. R easerching Project: Isolation and transformation of chlorophyll a to chlorin-e,,- trimethyl ester using for photodvnamic therapy of cancer Code: Q T-10-18 b. Director: Tran Thach Van, A ss.Prof.Ph.D c. Mem bers: - Doan Duy Tien, Ph.D - Tran Thi Thanh Van, Ph.D - Tran Thi Hien, M.s d. Researching Attitudes and Contents: - Researching A ttitudes: Build the process o f isolation chlorophyll a from cyanobacteria and transformation to chlorin-e^-trimethyl ester using for photodvnamic therapy o f cancer - Researching Contents: Study on process o f isolation consecutive chlorophyll a from cyanobacteria and transformation chlorophyll a to pheophythine a. Study on process o f isolation interruption chlorophyll a from cyanobacteria and transformation direct to methyl pheophorbide a - Study on reaction transformation methyl pheophorbide a to chlorin-e6-trimethyl ester from open carboxyl cyclic. - Study on structure o f mediation products and chlorin-e6-trimetyl este e. Results: • The process o f isolation and transformation chlorophyll a from cyanobacteria to chlorin-e6-trimethyl ester with good pure • Synthesis of 2g chlorin-e6-trimethyl ester • Two reaserching paper has been submitted. • The reaserching project has contributed to the graduations o f one bachelor, the researchs o f one junior and one master. II. SUMMARY: MỤC LỤC CÁC KÍ HIỆU VIÉT TẮT D AN H M Ụ C BẢ N G BIẾU, HÌNH VẼ MỞ ĐÀ U 1 CHƯƠNG 1 : TỔNG Q U AN 3 1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp 3 1.1.] Cấu tạo và tính chất của hệ quane hợp ở thực vật và vi khuẩn 3 1.1.2 Chlorophyll 10 1.2 Giới thiệu về ngành vi khuấn lam ( ngành cyanobacteria) 13 1.2.1 Sơ lược về vi khuẩn lam 13 1.2.2 Cấu tạo tế b à o 15 1.2.3 Phân lo ại 15 1.2.4 Ỷ nghĩa thực tiễn 16 1.3 Tình hình nghiên cứu về chlorophyll a trong nước và quốc tế 17 1.4 Các dẫn xuất của chlorophyll a 18 1.5 Sinh tổng hợp chlorophyll a 19 1.5.1 Sinh tổng hợp axit 5-am inolevulinic 19 1.5.2 Sinh tổng họp pyrol (porphobilinogen) 20 1.5.3 Quá trình đóng vòng của 4 vòng pyrol (tetrapyrol) 21 1.5.4 Đưa ion Mg2+ vào hộ thống vòng 22 1.6 Tổng hợp loàn phần chlorophyll a theo W oodward 23 CHƯƠNG 2: TH ựC NGHIỆM 25 2.1 Mục tiêu thực ngh iệm 25 2.2 Xác định các tính chất vật lý 25 2.2.1 Sắc kí bản m ỏn g 25 2.2.2 Phổ hồng ngoại (1R) 25 2.2.3 Phổ cộng hựởng từ hạt nhân 25 2.2.4 Phổ khối (M S ) 25 2.2.5 Phổ tử ngoại 25 2.3 Nội dung nghiên cứu 25 2.3.1 Nội dung 1 25 2.3.2 Nội dung 2 27 2.3.3 Nội dung 3 28 2.4 Xác định cấu trúc các sản phẩm bàng phổ hồng ngoại, tử ngại và khả kiến, phổ cộng huỏng từ hạt nhân và phổ khối 29 2.4.1 Cẩu trúc của pheophytin a 29 2.4.2 Cấu trúc của metyl pheophobide a 30 2.4.3 Cấu Irúc cua chlorin e<s- trimetylester 30 CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ TH AO LUẬN 32 3 .1 Tách chiết và chuyên hoá chlorophvll a thành pheophytin a 32 3.2 Thực hiện phàn ứng chuvén hoá chloroph\ II a thành metvl pheophobide a 36 3.3 Chuyền hoá metyl pheophobide a thành chlorin - e h trimetylester 40 CHƯƠNG 4 : KẼT LUẬN 45 TAI LIỆU THAM K HẢO 46 PHỤ LỤC CÁC KÍ HIỆU V IÉT TẮT PS : H ệ th ổnc quang họp III : Phổ hồn° ngoại u v - V I S : Phổ tử n^oại và khả kiến M S : Phổ khối lirợns, 'H -N M R : Phổ cộn g hưởng từ hạt nhân 'H. M PP : M elyl pheophobide a pp : Pheophvtin a AT P : A denosin Triphotphat N A D P : N icotinam it Adenin D inucleotitphotphat LHC : Phức họp thu nhận ánh sáng Bảig 1. 1: Baig 3.1: Bảig 3.2: Bảng 3.3: Hhh 1.1: 1-i'nh 1.2 : linh 1.3: Hiih 1.4: Hiih 1.5: Hhh ] .6 : Hhh 1.7: Hình 1.8: Hình 1.9: Hình 1.10: Hình 1.11. I-Inh 1.12: Hình 1.13: Hnh 1.14: H nh 1.15: H nil 1.16: H nh 1.17: H nh 1.18: H nh 1.19: H n h 1.20: H n h 1.2 1 : H nh 2 .]: H nh 2 .2 : H nh 2.3: H nil 2.4: *5 -í DA NH M ỤC BẢNG BIÊU, H ÌNH VẺ Thành phần của các chlorophyll khác n hau Bảng dữ liệu phổ 'H-NMR của pheophvtin a Bảng dừ liệu phổ 'H-NMR của metvl pheophobide a 377 Bảng dữ liệu phổ 'H-NMR của chlorin e6 - trimetylester 422 DA NH M ỤC HÌNH VẺ Năng lượng bức xạ trong tone họp cua các phân từ hữu CO' 3 Các hệ thống quane hợp 4 Hệ thống ăng ten của các vi khuân t ía 5 Hấp thụ ánh sáng của hệ thốn2 ăng ten trong thực v ậ t 6 Caroten trong hệ quang hợp 6 Cấu trúc trung tâm phản ứng của vi khuẩn Rhodopseudomonas virdis 7 Chuỗi eletron vận chuyến của m àng th y lak oid 8 Cố định Cacbon c 6 theo chu trình Calvin-Benson 9 Cố định cacbon theo chu trình c 4 10 Công thức cấu tạo của chlorophyll a 11 Te bào dị hình (*) ở Tảo Annabaena 15 Các hợp chất chlorophyll phổ biến trong tự n h iên 177 Các hoạt chất sử dụng để chữa trị ung thư bàng liệu pháp quang 1919 Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic từ glyxin và sucxinyl-C oA 200 Sinh tông hợp axit 5-aminolevulinic 200 Quá trình tổng họp vòng p y ro l 211 Sự tạo thành tetrapyrol 211 Quá trình đóng vòng của tetrepyrol 212 Quá trình tạo thành protophvrin I X 222 Quá trình hình thành phân tử chlorophyll a[l0'30'331 233 Tổng họp chlorophyll a theo W oodward 244 Chuyển hoá chlorophyll a thành pheophytin a 266 Chuyển hoá chlorophyll a thành metyl pheophobide a 277 Chuyển hoá trực tiếp thành metyl pheophobide a từ vi khuẩn lam 28 Chuyển hoá metyl pheophobide a thành chlorin e6- trimetylester 29 lình 3.1: Phố h ồn” ngoại của pheophvtin a 344 linh 3.2: Phổ u v - VIS của Pheophvtin a 344 lình 3.3: Phô khối cùa pheophytin a 355 lình 3.4: Phổ 'H-NM R của pheophvtin a 355 lình 3.5: Phô hồng ngoại của metvl pheophobide a 38 -lình 3.6: Phổ u v - VIS của metyl pheophobide a 3838 lình 3.7: Phổ khối của metyl pheophobide a 39 -lình 3.8: Phổ 'H - NMR của pheophobide a 39 lình 3.9: Phổ u v - VIS cùa chlorin e6 - trimetylester 433 -lình 3.10: Phổ hồng ngoại của chlorin e6- trim etylester 433 lình 3.1 1: Phổ khối cùa chlorin e6 - trimetvlester 44 -linh 3.12: Phồ 'H -N M R của chlorin e6 - trimetylester 444 M Ở Đ À U Từ làu các nhà khoa học rất quan tâm tói việc chiêt tách các sẳc tố từ lá xanh của thực vật bậc cao. Cách đâv hon 100 năm các nhà hóa học đã tách được chất màu xanh lừ lá và liọi chúns là Chlorophyll. Vào năm 1913, Richard Willstatter. nhà hóa học người Đức đã chi ra rang tất cả các năng lượng sống đều nhờ mặt trời và cây xanh có một cách nào đó để hấp thụ năng lượng này. Tới năm 1919. ông đã giải thích được chức năng cua hợp chất hâp thự năng lượng mặt trời chính là Chlorophyll. Thực vật bậc cao có lá xanh đã tự mình hấp thụ năng lượng bức xạ và chuvền hóa thành năng lượng dự trữ trong cơ thể. Chlorophyll giữ vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình quang họp. là chất hấp thụ năng lượng ánh sáng trong hệ quang hợp. Chlorophyll chuyên năng lượng ánh sáng thành năn2, lượng hóa học trong phân tử ATP. trong quá trình này xảy ra các phản ứníỊ chuyên dịch electron (phản ứng oxy hóa khử). Chlorophyll và các dẫn xuất của chúng là một đối tượng nghiên cứu hấp dẫn và trở thành một lĩnh vực phát triển rộng lớn và được các nhà khoa học quan tâm bao gồm các nghiên cứu về hệ thơm, khả năng hấp thụ ánh sáng, chuyển dời điện tích, tính chất phổ, sinh tồng hợp và các nghiên cứu y dược. Chlorophvll và các dan xuất của chúng có nhiều ứng dụng khác nhau trong y học và công nghiệp. Trong y học, chlorophyll được dùng như một thành phần cơ bản trong khẩu phần ăn kiêng và thuốc chừa bệnh. Chẳng hạn, Cu-chlorophyllin phòng chống uns thư từ thức ăn bị thiu mốc chứa hydrocacbon mạch vòng, atlatoxin. Chlorophyll và các dẫn xuất còn được sử dụng như là chất nhạy sáng đế tiêu diệt các tế bào ung thư và chống virus, chat chừa vet thươne và khử mùi hôi. Chlorophyll ức chế phát triển của vi khuẩn, kích thích việc phục hồi các mô đã bị hư hại và ngăn càn tác hại của các chất gây une, thư. Chlorophyll còn có lợi cho hệ tiêu hoa và có tác dụng dưỡng da. Một số dẫn xuất chlorophyll có hoạt tính sinh học quí giá như tiêu diệt tế bào ung thư tủy, virus leukemia, u ác tính (malignant melanoma) theo cơ chế quang trị liệu. Chlorophvll còn có tác dụna giảm viêm khóp (arthritis), chữa trị u xơ. giảm mùi hôi. giảm đường máu của người bệnh cao tuổi. 1 [...]... lập chlorophyll a từ các nguồn tự nhiên rất khó khăn do các phản ứng phân hủy như: đề kim loại h a, đề phytyl h a, oxi h a quang h a, solvat h a, allomerization và đề metoxycacbonyỉ h a Chlorophyll a đóng vai trò rất quan trọng trong hệ thống quang hợp do khả năng hấp thự ánh sáng và biến đồi quang năng thành hoá năng với hiệu xuất cao, quá trình này xảy ra trong hệ quang hợp c a thực vật bậc cao,... succinyl-CoA ** Sinh tổng họp axit 5-aminoỉevuIinic từ axit glutamic 1 Cơ chat c a quá trình sinh tổng họp là glutamic xảy ra trong thực vật bậc cao, rêu, khuân lam và nhiêu vi khuân khác Đầu tiên, axit glutamic được hoạt h a bằng cách gắn với A R N t0lu tạo thành glutamyl-ARN| với sự có m ặt c a A TP và M g2+ Sau đó glutamyl-ARN, bị đehiđro dưới tác dụng c a N A D P tạo thành glutamat-l-anđehit Cuối... pheophobide a chlorin e6 - trimethylester Hình 1.13: Các hoạt chất sử dụng để ch a trị ung thư bằng liệu pháp quang 1.5 Sinh tổng họp chlorophyll a Quá trình sinh tống lụyp chlorophyll trải qua 4 giai đoạn: Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic Sinh tổng hợp vòng pyrol từ axit 5-aminolevulinic Tone hợp hệ 4 vòng tetrapyrol Quá trình đ a M g2+ vào hệ thống vòng 1.5.1 Sinh tống họp axit 5-aminolevulinic.. .Chlorophyll là một nhóm các hợp chất a dạng bao gồm chlorophyll (a, b c d , ) trong đó chlorophyll a phô biến nhất trong tự nhiên, đó là chlorophyll trong hệ quang hợp cua thực vật bậc cao táo biển và vi khuẩn quana họp Trona thực vật bậc cao hệ thông quang hợp có cấu tạo rất phức tạp và ch a nhiều loại chlorophyll khác nhau Ọuá trình tách các chlorophyll ra khỏi nhau rất khó khăn và phức... c 4 cao hơn so với chu trình c 6 1.1.2 Chlorophyll 1.1.2.1 Cấu tạo và tính chất c a chlorophyll a Cau tao Có 5 loại chlorophyll bao gồm chlorophyll a, chlorophyll b, chlorophyll c, chlorophyll d chlorophyll e 0 thực vật bậc cao chỉ có 2 loại chlorophvll a và b; còn chlorophyll c d e có ơ vi sinh vật, rong tảo vi khuân Vê công thức câu tạo phân tứ chlorophyll a chia ra hai phân: nhân chlorophyll và đuôi... phân tử hữu cơ Các chlorophyll hấp thụ và biến quang năna thành hoá năng với hiệu suất cao Các hệ thống quang hợp (PS) (hình 1.2) được phân loại theo cấu trúc c a trung tâm phản ứng chia thành PSI c a VI khuẩn lam, PSII c a thực vật bậc cao và PS c a vi khuân t a đêu bao gồm bốn thành phần chính là ăng-ten thu sáng, trung tâm phản ứng, trung tâm chuyển điện tử và bộ máy cố định cacbon (3' ' 1 3 & cyì... trúc và chức năng tương đồng với các tiêu đơn vị L và M c a trung tâm phản ứng ở vi khuẩn N ăng lượng ánh sáng được hấp thụ bởi LHCII và chuyển vào trung tâm phản ứng bởi protein -chlorophyll CP43 và CP47 Quá trình chuyển dời điện tích thực hiện bởi phức họp c a mangan để ôxi h a nước và giải phóng oxi vào khí quyển Trong PS I, các protein PsaA và PsaB tạo thành một heterodimer giống PSII M ồi PsaA và. .. cứu tách chiết Chlorophyll a ra khỏi Tảo lam một cách hiệu quà ớ qui m ô phòng thí nghiệm và từ đó chuyển h a Chlorophyll a thành các dẫn xuất có hoạt tính sinh học (chlorin-e6-trimetyl este) Chúng tôi hy vọng sẽ sử dụng những kết quả thu được trong quá trình thực hiện đề tài làm tiền đề cho những nghiên cứu sau, phục vụ cho mục đích chuyển h a Chlorophyll a thành những hợp chất có thể sử dụng làm. .. chất có thể sử dụng làm thuốc ch a trị ung thư bằng liệu pháp quang, một phương pháp tiên tiến hiện đang được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng 2 C H Ư Ơ N G 1 : TÒNG QUAN 1 1 C ấu tạo và tính chất c a hộ q u a n g họp 1 1 1 C ấu tạo và tính chat c a hệ q u a n g họp ở thự c vật và vi khuẩn Quang hợp là cơ sở năng lượng cua sự sốne trên trái đất Chỉorophvll... trời và chuyển quansi năng thành h a năng bời trung tâm phan ứng trong hệ quang họp c a vi khuẩn và thực vật dưới dạng N A D PH và ATP được sử dụng đề tổng họp cacbohydrat (hình 1.1) Anoxygenic Reducing power Oxygenic Carbon Energy •G power Carbon H S • / \ W* Y i A 3P ^ A / t ^ W k \ 1 i P A /V \ hv ' L ^W \ n v hv V ĩ SO/ (CH?0)n Ị p0 , “ 'A TP 'CHO;, ATP Hình 1.1: Năng lượng bức xạ trong tổng hợp của . chuyển h a thành ch lonn-e ó-triinetyl este để làm hoạt chất ch a trị ung thư bằng liệu pháp quang. N ội (htiĩo: • Ngh iên cứu quá trình chiết tách liên tục chlorophyll a từ vi khuẩn lam và thực. tài làm tiền đề cho những nghiên cứu sau, phục vụ cho mục đích chuyển h a Chlorophyll a thành những hợp chất có thể sử dụng làm thuốc ch a trị ung thư bằng liệu pháp quang, một phương pháp. consecutive chlorophyll a from cyanobacteria and transformation chlorophyll a to pheophythine a. Study on process o f isolation interruption chlorophyll a from cyanobacteria and transformation direct