Enzym laø moät loaïi protein ñöôïc sinh vaät toånghôïp neân vaø tham gia vaøo caùc phaûn öùng sinh hoïc. _Ñaëc tính sinh hoïc chung cuûa enzym: Ñöôïc taïo ra trong teá baøo sinh vaät Tham gia phaûn öùng caû trong teá baøo soáng vaø caû khi enzyme ñöôïc taùch khoûi teá baøo soáng. Tham gia phaûn öùng trong ñieàu lieän nhieät ñoä oân hoaø. Coù theå tham gia xuùc taùc caùc phaûn öùng caùc phaûn öùng trong vaø ngoaøi cô theå töø giai ñoaïn ñaàu ñeán giai ñoaïn giaûi phoùnghoaøn toaøn naêng löôïng döï tröû trong caùc hôïp chaát hoaù hoïc. Coù theå thöïc hieän 1 phaûn öùng. haûn öùng enzym laø nhöõng phaûn öùng tieâu hao naêng löôïng raát ít. Enzym chòu söï ñieàu khieån bôûi gen vaø caùc ñieàu kieän phaûn öùng.
Seminar Hệ enzym pectinase - 1 - MỤC LỤC: • I. Enzyme 2 I.1.Khái niệm 2 I.2 . Phân loại enzyme 2 II. Pectin 3 II.1. Giới thiệu 3 II.2 . Phân loại 4 II.3. Cấu tạo 6 II.4. Tính chất chung của pectin 7 III. Pectinase 7 III.1 . Giới thiệu 7 III.2 . Khái niệm 8 III.3. Trung tâm hoạt động của enzyme pectinase 8 III.4. Phân loại 8 IV. Cơ chế tác dụng 10 IV.1 . Pectinesterase (PE) 10 IV.2 . Polygalacturonase (PG) 12 IV.3. Pectate lyase (PEL) 18 IV.4. Ý nghóa về mặt kỹ thuật của các endo-enzyme 19 V. Nguồn thu nhận enzyme pectinase 23 V.1.Thực vật 23 V.2.Vi sinh vật 25 VI. Các phương pháp thu nhận enzyme pectinase: 30 VI.1. Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh trường bề mặt 30 VI.2. Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh trường bề sâu 30 VI.2.1 Phương pháp hiếu khí 30 VI.2.2 Phương pháp yếm khí 31 VI.3. .Phương pháp ni cấy các chủng nấm mốc và tách chiết enzyme pectinase từ mơi trường ni cấy 32 VII.Xác định hoạt tính enzyme pectinase 33 VII.1.Phương pháp xác định hoạt độ enzim pectinaza 33 VII.2.Phương pháp khảo sát điều kiện thu nhận và đặc tính của enzyme pectinase ( tác nhân tủa , nhiệt độ , pH tối ưu) 35 VII.3.Phương pháp tinh sạch enzyme pectinase 35 VIII. Vai trò và ứng dụng của enzyme pectinase 36 Tài liệu tham khảo 44 Seminar Hệ enzym pectinase - 2 - I.TỔNG QUAN VỀ ENZYME I.1.Khái niệm:[1] _Enzym là một loại protein được sinh vật tổng hợp nên và tham gia vào các phản ứng sinh học. _Đặc tính sinh học chung của enzym: * Được tạo ra trong tế bào sinh vật * Tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả khi enzyme được tách khỏi tế bào sống. *Tham gia phản ứng trong điều liện nhiệt độ ôn hoà. *Có thể tham gia xúc tác các phản ứng các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phónghoàn toàn năng lượng dự trử trong các hợp chất hoá học. * Có thể thực hiện 1 phản ứng. * hản ứng enzym là những phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít. * Enzym chòu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng. I.2 . Phân loại enzyme:[1] • Lớp • Phản ứng xúc tác • 1. Oxidoreductase • nhận và loại H • 2. Transferase • Chuyển vò các nhóm • 3. Hydrolase • Phản ứng thuỷ phân • 4. Lyase • Phản ứng phân cắt • 5. Isomerase • Phản ứng đồng phân hoá • 6. Ligase • Tạo thành liên kết sử dụng ATP • Bảng 1: Phân loại enzyme Dựa vào sự phân lớp này mà ngưới ta có mã số cho từng loại enzyme Ví dụ : Enzym pctinesterase có mã số là E.C.3.1.1.11 nghóa là enzym thuộc lớp hydrolase, có liên kết este Một số nguồn enzyme và enzym quan trọng : • Nguồn ĐV: Catalase, Chymotrypsin, Lipase, Trypsin… • Nguồn TV: amylase, ficin… • Nguồn VK: Asparaginase, Protease … • Nguồn nấm sợi: Lactase, Lipase,… • Nguồn nấm men: Invertase, Lactase,… Seminar Hệ enzym pectinase - 3 - II. PECTIN II.1. Giới thiệu:[1+2+8] _Pectin là cơ chất của enzyme pectinase. Pectin là polysaccharide dò thể. Về bản chất hoá học, pectin là polygalacturonic được phân bố rộng rãi trong các mô thực vật, hoà tan trong dòch thực vật. Có nhiều trong các loại quả, củ, đặc biệt là trong cùi trắng của bưởi, cam, chanh. _Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng, mạch chính của phân tử do các acid galacturonic kết hợp với nhau bằng liên kết α-1,4-glucosid tạo nên. _Pectin khác với các carbonhydrate thông thường vì thành phần chủ yếu của nó không phải là đường đơn mà là một acid có tên là acid galacturonic. _Pectin gồm một mạch chính có thay đổi nhưng có tỷ lệ lớn các đơn vò acid D-galacturonic đã được methyl hoá và được gọi là acid pectic (acid polygalacturonic). Hình 1: Mạch pectin Hình 2: Hai phân tử D-galcturonic acid nối với nhau bằng liên kết glucoside Seminar Hệ enzym pectinase - 4 - II.2. Phân loại:[1] _ Pectin là tên gọi chung bao gồm: protopectin, acid pectic, acid pectinic, pectin hoà tan. Trong quá trình tìm hiểu thì thấy có nhiều cách phân loại: Cách 1: _Pectin có nhiều ở phần vỏ của quả, củ hay thân cây, trong thực vật pectin tồn tại 2 dạng: • Dạng protopectin: không tan trong nước, tồn tại chủ yếu ở thành tế bào, thường ở dạng liên kết với polysaccharide khác như araban, tinh bột, cellulose… Protopectin tạo cho quả xanh, có độ cứng nhất đònh. Không thể tách protopectin ở trạng thái chưa biến đổi. Người ta cho rằng protopectin là hợp chất giữa pectin với araban, galactan, hay tinh bột. Protopectin là thành phần quan trọng của chất gian bào, làm nhiệm vụ liên kết giữa các tế bào thực vật với nhau. Trong thành phần protopectin có các phân tử pectin, phân tử cellulosase, các ion Ca 2+ , Mg 2+ , các gốc acid photphoric, acid acetic và đường. Dưới tác dụng của acid, bazơ, t 0 hoặc enzyme protopectinase thì protopectin giải phóng ra pectin hoà tan. • Dạng pectin hoà tan: chủ yếu ở dòch tế bào. Là este methylic của acid polygalacturonic cao phân tử. Khoảng 2/3 nhóm cacboxyl của acid polygalacturonic được este hoá bằng methanol. A. pectinic: là acid polygalacturonic cao phân tử trong đó 1 phần nhỏ nhóm cacboxyl được este hoá bằng methanol. A.pectic: là acid polygalacturonic cao phân tử đã phân tử đã hoàn toàn giải phóng khỏi nhóm metoxyl, nghóa là trong 1 đơn vò acid galacturonic có 1 nhóm cacboxyl tự do. Hình 3: Galacturonic acid Seminar Heọ enzym pectinase - 5 - Hỡnh 4: acid pectic Hỡnh 5: Acid pectic vụựi cau muoỏi Mg vaứ Ca Hỡnh 6: a) Galacturonic acid b) Pectic acid Seminar Hệ enzym pectinase - 6 - Cách 2: chia là 3 loại _ High metyl este pectin (HM pectin): tỷ lệ các gốc este metilic cao (>50%). _Low metyl este petin (LM pectin): tỷ lệ các gốc este metilic thấp hơn (<50%). Việc thay đổi quy trình chiết tách, hay gia tăng việc xử lý các gốc aicd galactuonric sẽ tạo ra LM pectin. _Amidared pectin (pectin amin): trong quá trình sản xuất, khi xử lý pectin cùng với ammoniac sẽ tạo thành pectin amin. Pectin amin có thuận lợi đặc biệt trong nhiều quy trình ứng dụng. II.3. Cấu tạo: _Khối lượng phân tử pectin dao động từ 20.000-200.000 dal phụ thuộc vào nguồn pectin. _Cấu tạo pectin chủ yếu là 1 mạch chính, gồm các gốc acid α-D- galacturonic liên kất với nhau bằng liên kết 1,4-glucosid, còn gọi là acid polygalacturonic hay acid pectic. Pectic hoà tan trong tự nhiên là este methylic của pectic. _Công thức nguyên của galacturoic: C 6 H 10 O 7 _Trong thực tế, không phải bao giờ tất cả các nhóm –COOH ở C 6 của acid galcturonic cũng bò methyl hoá tạo este methylic, mà đôi khi 1 số nhóm – COOH bò decacboxyl hoá (khử CO 2 ), 1 số nhóm COOH được thay thế bằng kim loại, cũng có lúc nguyên dạng –COOH. II.4. Tính chất chung của pectin: _Pectin là 1 dạng glucid cao phân tử có cấu trúc mạch xoắn và có phân tử lượng rất cao. _Pectin mang tính keo nhầy, nhưng khác với 1 số chất nhầy khác như gelatin, pectin chuyển sang thể keo chỉ khi có đường và acid hay kim loại hoá trò cao. _Pectin được tách từ thân thực vật, vỏ quả. Pectin ở dạng khô có màu trắng ngà hay màu nâu, điều đó còn tuỳ thuộc vào từng loại nguyên liệu. _Pectin là chất bột màu trắng xám nhạt, tan trong nước, không khử oxy. _Pectin không tan trong rượu và các dung môi hữu cơ khác. Pectin tan trong nó, ammoniac, kiềm, cacbonat natri, etylendiamin và trong glycerin nóng. _Đặc tính quan trọng của pectin khi có mặt acid và đường tạo thành chất keo hay nói cách khác pectin được este hoá cao sẽ tạo ra gel đặc khi ở trong dung dòch đường và trong môi trường acid có nồng độ 65%. Vì vậy đặc tính này được ứng dụng trong sản xuất mứt kẹo. _Pectin hoà tan, dưới tác dụng của liềm loãng hay enzyme pectinase sẽ giải phóng nhóm metoxyl tạo thành rượu methylic và acid pectic tự do. Seminar Hệ enzym pectinase - 7 - _Pectin tan trong nước, nhất là nước nóng, được tủa nhờ rượu và những chất tan hữu cơ khác. _Khi tăng mức độ este hoá bằng methanol hay giảm khối lượng thì độ hoà tan ở trong nước tăng lên. Khi đó độ nhớt của dung dòch pectin sẽ tăng lên. _Một tính chất cũng rất hay của pectin là acid pectic khi kết hợp với ion Ca 2+ sẽ tạo thành Canxipectat kết tủa. Tính chất này được ứng dụng để đònh lượng pectin. _Pectin dễ dàng bò kết tủa, hay bò đông đặc bởi etanol, isopropanol, acetone, sunfatamon, clorua nhôm, muối Cu, muối Ca… _Tính chất đặc biệt của pectin là dung dòch pectin bò làm đông đặc bởi 1 loại men đặc biệt là pectat, pectase có trong dòch của carot. Pectin dưới tác dụng của pectase sẽ biến thành acid pectic. Acid pectic tan trong kiềm, các muối tan, riêng pectat Canxi không tan. Enzym pectinase có trong lúa mạch lại có tác dụng ngược lại với pectat nghóa là nếu có pectinase thì pectat không làm pectin đông đặc nữa, pectinase còn có thể hoà tan kết tủa của acid do pectat gây nên, và hiện tượng này kèm theo sự giải phóng các đường khử oxy. _Tuỳ theo thời gian và nhiệt độ pectin được tách hoàn toàn hay 1 phần khỏi cellulose hay hemicellulose mà ta có tính chất khác nhau. Muốn loại pectin khỏi hemicellulose ta tác dụng lên nguyên liệu dung dòch oxalate ammonium và dung dòch này chỉ hoà tan được pectin mà thôi. _Pectin giữa vai trò quan trọng trong quá trình chín của quả khi quả còn xanh và đang phát triển. Protopectin phân tán ở thành tế bào, và có tỷ lệ khá cao có tác dụng làm quả cứng, khi quả bắt đầu chín thì protopectin chuyển sang dạng pectin hoà tan dưới tác dụng của acid hữu cơ và enzyme protopectinase có trong quả. Quả càng chín càng mềm, pectin hoà tan tăng cao, và ngược lại protopectin không tan sẽ giảm dần. _Độ bền vững của pectin trước các enzyme sẽ được tăng lên khi có mặt cation, đặc biệt là Al 3+ và Fe 3+ . Tăng nhiệt độ lên 100 0 C pectin bò phân tách, nếu có thêm ion Cl - thì quá trình đó tiến hành nhanh hơn. III.PECTINASE: • III.1.Giới thiệu: • _1840 E.Fremi phát hiện ra enzym pectase trong nước ép cà rốt. • _ Sau đó G. Bertrand và A. Mallevre tìm thấy trong nước ép cà chua • _Enzym pectinase do E. Poourquelot và H. Herisseu phát hiện trong đại mạch nảy mầm vào khoảng năm 1898. • Seminar Hệ enzym pectinase - 8 - III.2. Khái niệm: _Enzym pectinase là enzyme xúc tác sự phân huỷ các polyme pectin. Sản phẩm tạo thành: acid galacturonic, galactose, arabinose, metanol… Là nhóm enzyme được ứng dụng rộng rãi sau protease và amylase. _Enzym pectinase có ở thực vật bậc cao và các sản phẩm của VSV. Ở thực vật bậc cao: có nhiều trong lá, khoai tây, chanh, cỏ chẻ ba, trong các loại qủa thường có enzyme pectinesterase. _Trong tự nhiên có nhiều ở nấm mốc, vi khuẩn phân giải pectin. _Sự phân huỷ pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín . Vì vậy enzyme pectinase có vai trò hết sức quan trọng trong qúa trình bảo quản trái cây và rau qủa. Việc kiểm soát enzyme này trong cà chua chuyển gen là 1 ví dụ điển hình trong việc ứng dụng RNA chuyển gen đối mã để thao tác sự biểu hiện gen. Enzyme pectinase được ứng dụng nhiều trong qúa trình chế biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nước hoa qủa. (Việc kiểm soát hoạt động của enzym pectinase cũng có thể điều chỉnh bằng độ nhớt của sản phẩm) III.3. Trung tâm hoạt động của enzym pectinase: E.pectinase chứa vùng có 8-10 vòng xoắn β kép về phía phải với hai vòng tạo thành khe liên kết với cơ chất • Trung tâm hoạt động của enzym này chứa a.a Aspartate và Lysine.Có 1 Histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đến khả năng xúc tác của enzym. Nhiệt đđộ tối ưu của enzym pectinase khoảng từ 45-55 o C III.4.Phân loại: Dựa vào tính đặc hiệu, cơ chế tác dụng, kiểu phản ứng, pH tối ưu của enzym, 1966 Koller và Neukom phâân loại chia pectinase thành hai nhóm chính: Hydrolase và transeliminase . - Nhóm thứ nhất: Hydrolase (xúc tác cho quá trình thủy phân) gồm • Pectinesterase (PE) có tên hệ thống là pectin-petihydrolase (E.C.3.1.1.11) Seminar Hệ enzym pectinase - 9 - Hình 7: Pectinesterase • Polygalaturonase (PG) có tên hệ thống là poly – 1,4 galaturonit- glucanohydrolase, mã số (E.C.3.2.1.15). Dựa vào tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng lên cơ chất, H.Deuel và E.Stulz (1958) đã chia polygalacturonase thành 2 nhóm nhỏ. Mỗi nhóm có 2 kiểu : • Polymethylgalacturonase (PMG): có tên hệ thống là poly α-1,4- galactunonic-methylsteglucanohydrolase(E.C.3.2.1.11). PMG tacù dụng lên acid polymethyulgalacturonic đã được methyl hoá (tức là pectin). PMG được phân thành 2 kiểu: * Kiểu 1: endo glucosidase-polymethylgalacturonase (viết tắt là endo- PMG-I) * Kiểu 3: enxo glucosidase-polymethylgalacturonase (viết tắt là endo- PMG-III) • Polygalacturonase (PG) tác dụng lên acid pectic hoặc pectinic, gồm 2 kiểu: * Kiểu 2: endo glucosidase-polygalacturonase (viết tắt là endo-PG-II) * Kiểu 4: enxo glucosidase-polygalacturonase (viết tắt là enxo-PG-IV) - Nhóm thứ hai: Transeliminase (T.E), gồm: • Pectin-transeliminase (PTE): có tên hệ thống là poly--1,4-galcturonic- methylesteglucanoliase (E.C.4.2.99.8). Các enzyme này lại được chia làm 2 loại: * Endo-pectintraseliminase kiểu I (viết tắt là endo-PTE-I) * Exo-pectintraseliminase kiểu III (viết tắt là endo-PTE-II) Seminar Hệ enzym pectinase - 10 - • Polygalacturonate-transeliminase (PGTE): Có tên hệ thống là poly-- 1,4-D-galacturonic-glucanoliase (E.C.4.2.99.3). PGTE này được chia làm 2 loại: * Endo-polygalacturonate-transeliminase kiểu II (Endo-PGTE-II) * Endo-polygalacturonate-transeliminase kiểu IV (Endo-PGTE-IV) Hình 8: Polygalacturonase IV.CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA ENZYM PECTINASE: IV.1. Enzym pectinesterase (E.C.3.1.1.11) (PE): _Enzym này xúc tác sự thủy phân liên kết ester phức tạp của pectin và protopectin, sản phẩm tạo thành là rượu methylic và acid pectinic hay acid polygalacturonic. Người ta nhận thấy rằng PE chỉ phân cách liên kết ester giữa các nhóm metoxyl và COOH tự do. PE có ái lực với nhóm metoxyl ở vị trí thứ 5 lớn với các nhóm ở vị trí thứ 3 và 7. Như vậy sự phân cách nhóm metoxyl sẽ xảy ra một cách tuần tự bắt đđầu từ nhóm COOH tự do. Kết quả là tạo thành acid pectic hoặc acid pectinic và rượu methanol. _Nghiên cứu cơ chế tác dụng pectinesterase, người ta thấy rằng metoxyl bị xà phòng hoá, sau đđó thủy phân tiếp liên kết ester tiến hành dọc theo phân tử pectin. _Pectinesterese tách gốc methyl khỏi phân tử pectin làm lộ ra các nhóm carboxyl rất hoạt đđộng, dễ kết hợp với các ion kim loại (ví dụ Ca 2+ )đđể tạo thành các muối không hoà tan, kết lắng lại và có thể tách ra dễ dàng. . sạch enzyme pectinase 35 VIII. Vai trò và ứng dụng của enzyme pectinase 36 Tài liệu tham khảo 44 Seminar Hệ enzym pectinase - 2 - I.TỔNG QUAN VỀ ENZYME I.1.Khái niệm:[1] _Enzym. thuật của các endo-enzyme 19 V. Nguồn thu nhận enzyme pectinase 23 V.1.Thực vật 23 V.2.Vi sinh vật 25 VI. Các phương pháp thu nhận enzyme pectinase: 30 VI.1. Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh. hiện trong đại mạch nảy mầm vào khoảng năm 1898. • Seminar Hệ enzym pectinase - 8 - III.2. Khái niệm: _Enzym pectinase là enzyme xúc tác sự phân huỷ các polyme pectin. Sản phẩm tạo thành: