Nghiên cứu ảnh hởng của khoảng cách siêu âm đến kết quả thu tế bào trứng từ bò sống và tạo phôi in vitro Nguyễn Văn Lý, Phan Lê Sơn, Nguyễn Thị Thoa, Nguyễn Khánh Vân, Phan Văn Kiểm, Vũ Ngọc Hiệu và Lu Ngọc Anh Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Động vật Summary Ovum Pick-up was conducted once per week or twice per week on 5 dairy cross-breed cows with 276 times of ovary. 1112 oocytes were aspirated with the average of 4,03 oocytes per ovary and the oocytes classified as grade A, B, C and D were 35,97%; 33,09%, 4,86% and 26,08%, respectively. There was significant difference between oocytes graded as A, B, C and D (P<0,05). From 768 oocytes matured in vitro, 71,2% oocytes were matured. After incubation with sperm, 66,91% oocytes were inseminated. From those, 53,93% zygotes cleaved and 39,85% zygotes developed to morulae and blastocyst stages. Among 20 in vitro produced embryos were transferred, 5 calves (25,0%) were born. In conclusion, there was no difference in the average number of oocytes collected once or twice per week, but the percentage of oocytes collected twice per week was higher than that of once per week in development into moralae and blastocyst stage. Key words: Ovum Pick-up, TTON 1. Đặt vấn đề Sản xuất phôi in vitro bằng nguồn tế bào trứng khai thác từ bò sống là một trong những phơng pháp mới nâng cao hiệu quả công nghệ phôi. Phơng pháp siêu âm thu tế bào trứng cho phép thu đợc những tế bào trứng cha thành thục từ những gia súc cái đã đợc biết rõ nguồn gốc. Khi siêu âm thu tế bào trứng lặp lại kết hợp với việc cải tiến kỹ thuật tạo phôi in vitro có thể khai thác nhiều lần để tận dụng tối đa tiềm năng sinh sản của con cái, đặc biệt là những con có giá trị di truyền cao. Phơng pháp siêu âm hút tế bào trứng trên bò sống và tạo phôi in vitro lần đầu tiên đợc nghiên cứu tại Viện Chăn nuôi từ năm 2005. Đây là phơng pháp tiên tiến, đòi hỏi thiết bị siêu âm đắt tiền và trình độ cao của ngời thao tác. Kết quả thu tế bào trứng và chất lợng tế bào trứng thu đợc phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Để nâng cao hiệu quả của kỹ thuật siêu âm thu tế bào trứng và tạo phôi in vitro, chúng tôi đã tiến hành đề tài: Nghiên cứu ảnh hởng của khoảng cách siêu âm đến kết quả thu tế bào trứng từ bò sống và tạo phôi in vitro. 2. Mục tiêu của đề tài Nâng cao số lợng, chất lợng tế bào trứng thu đợc 3. Vật liệu, nội dung và phơng pháp nghiên cứu 3.1. Vật liệu - Bò dùng để siêu âm hút tế bào trứng là bò lai hớng sữa (F2, F3) (n=5), có năng suất sữa trên 5000 lít/chu kỳ, thể trọng > 400kg, điểm thể trạng 3-3,5. Những bò này đợc cho ăn 40kg cỏ tơi và 4kg thức ăn tinh/ngày và đợc nuôi nhốt tại Trạm nghiên cứu thử nghiệm thức ăn chăn nuôi - Viện Chăn nuôi. - Tinh cọng rạ HF nhập từ Mỹ có hoạt lực trên 40%, có năng suất sữa trên 10.000 lít/chu kỳ. Loại tinh này đã đợc kiểm tra năng suất qua đời sau. - Bò nhận phôi là bò Lai Sind và bò lai hớng sữa (F2, F3) có thể trọng >250kg, có chu kỳ sinh lý sinh sản bình thờng và không mắc các bệnh về đờng sinh dục. 3.2. Nội dung nghiên cứu Thu tế bào trứng từ bò sống một tuần một lần hoặc hai lần. Tạo phôi in vitro bằng tế bào trứng thu đợc từ bò sống Cấy phôi tạo ra in vitro cho bò nhận động dục đồng pha 3.3. Phơng pháp nghiên cứu Những con bò tốt đã đợc chọn lựa về mặt di truyền sẽ đợc sử dụng máy siêu âm hoặc khám qua trực tràng để xác định khả năng cho tế bào trứng, từ đó tiến hành thu tế bào trứng. Hút tế bào trứng đợc thực hiện mỗi tuần một lần hoặc 2 lần. Quá trình hút tế bào trứng đợc tiến hành nh sau: Cho bò vào giá cố định, lấy hết phân ra, rửa sạch, sát khuẩn âm hộ và khu vực xung quanh. Chuẩn bị hệ thống máy siêu âm, nối đầu dò âm đạo vào máy siêu âm. Nối kim hút tế bào trứng (kim 16G dài 55 cm), đặt máy tạo áp suất ở 120 mmHg, tơng đơng tốc độ dòng chảy 25 ml/phút. Chuẩn bị môi trờng hút tế bào trứng (mDPBS của Sigma) có bổ sung 50 iu/ml heparin và 5% huyết thanh bê và kháng sinh (100.000iu penicilin/ml + 100àl streptomycin/ml) duy trì ở nhiệt độ 37 0 C bằng máy ổn nhiệt. Nhẹ nhàng cho đầu dò siêu âm có gắn hệ thống dẫn kim vào âm đạo, cho tay qua trực tràng xác định vị trí của buồng trứng, vị trí các nang trứng rồi đa buồng trứng về phía đầu quét của đầu dò, quan sát các nang trứng trên màn hình máy siêu âm, đếm số nang trứng có mặt trên buồng trứng, Trớc khi hút dịch nang trứng, hút một ít dung dịch hút trứng để làm trơn hệ thống kim và ống dẫn. Sau khi chọc hút 2 - 4 nang trứng, rút kim ra, hút dung dịch thu tế bào trứng để tế bào trứng chảy vào ống falcon, tiến hành hút lặp lại đến khi không còn nhìn thấy nang trứng nào trên buồng trứng thì chuyển qua buồng trứng đối diện. Dịch hút đợc thu vào ống ly tâm 50ml và duy trì ở nhiệt độ 37 0 C bằng máy ổn nhiệt. Sau khi hút xong một buồng trứng, đa ngay về phòng thí nghiệm, lọc bằng cốc lọc Emcon có đờng kính lỗ lọc 20àm, khoảng 10ml dung dịch còn lại đợc chuyển vào đĩa petri vô trùng có đờng kính 90mm để soi tìm tế bào trứng dới kính hiển vi soi nổi. Tế bào trứng thu đợc đợc đánh giá phân loại theo phơng pháp của Wright và Lindner (1989). Sau khi đánh giá phân loại, tế bào trứng đợc nuôi thành thục trong môi trờng TCM-199 có bổ sung 5% huyết thanh bê mới sinh trong 24 giờ, tiếp theo chúng đợc chuyển qua môi trờng thụ tinh BO với mật độ tinh trùng 6,25x10 6 /ml trong 5 giờ. Sau quá trình thụ tinh, hợp tử đợc tách tế bào cumulus và chuyển sang nuôi trong môi trờng nuôi CR1 có bổ sung axit amin, huyết thanh bê mới sinh và albumin huyết thanh bò. Sau 7 ngày nuôi, những phôi dâu, phôi nang có chất lợng tốt đợc lựa chọn để cấy cho bò nhận động dục đồng pha hoặc đông lạnh bảo quản. Sau 3 tháng, khám thai qua trực tràng để xác định tỷ lệ có chửa. 3.4. Xử lý số liệu Số liệu đợc xử lý theo phơng pháp thống kê sinh học có sử dụng phần mềm Excel version 5.0 và Minitab Release 12. 3.5. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm đợc tiến hành tại Viện Chăn nuôi từ tháng 2/2006 đến tháng 12/2006 4. Kết quả và thảo luận 4.1. Kết quả thu tế bào trứng từ bò sống Trong tổng số 276 lợt buồng trứng bò sống đợc thu tế bào trứng bằng phơng pháp siêu âm, số tế bào trứng thu đợc là 1112, trung bình thu đợc 4,03 tế bào trứng/buồng trứng (Bảng 1). Bảng 1 . Thu tế bào trứng từ bò sống Chỉ tiêu Kết quả Số lợt buồng trứng siêu âm 276 Tổng số tế bào trứng thu đợc 1112 Tế bào trứng thu đợc/buồng trứng (XSE) 4,031,41 Số nang trứng trung bình/buồng trứng trong thí nghiệm của chúng tôi thấp hơn so với số nang trứng trung bình/buồng trứng trong báo cáo của Rizos và cs. (2005) ở cả bò hậu bị và bò cái sau đẻ (10,4 và 7,8 nang trứng/buồng trứng tơng ứng). Tuy nhiên, số tế bào trứng trung bình thu đợc/buồng trứng trong thí nghiệm của chúng tôi không sai khác nhiều so với kết quả các tác giả này (3,98 so với 4,7 ở bò hậu bị và 2,8 ở bò sau đẻ). 4.2. ảnh hởng của khoảng cách thu tế bào trứng lặp lại Không có sự khác biệt về số lợng tế bào trứng thu đợc/buồng trứng bò cái/tuần giữa phơng pháp siêu âm một lần một tuần so với hai lần một tuần. Với khoảng cách siêu âm một lần/tuần, số lợng tế bào trứng trung bình thu đợc/buồng trứng là 5,1. Trong khi đó, ở quy trình siêu âm 2 lần/tuần, số lợng tế bào trứng trung bình thu đợc là 5,28 (Bảng 2). Bảng 2 . ảnh hởng của khoảng cách lặp lại đến kết quả thu tế bào trứng Tế bào trứng thu đợc Khoảng cách siêu âm Số lợt buồng trứng siêu âm n X 1 lần/tuần 156 795 5,10a 2 lần/tuần 120 317 5,28a a: Chữ cái cùng cột giống nhau, giá trị sai khác không có ý nghĩa (P>0,05) Kết quả siêu âm thu tế bào trứng lặp lại của chúng tôi còn thấp hơn kết quả của một số tác giả khác đã công bố. De Roover và cs. (2005) báo cáo trung bình thu đợc 5,6 tế bào trứng/buồng trứng/lần siêu âm. Theo Reis và cs. (2002), từ 24 bò hậu bị, bằng phơng pháp siêu âm thu tế bào trứng lặp lại, các tác giả đã tiến hành chọc hút 8 lần trong tổng số 3234 nang trứng và thu đợc 1241 tế bào trứng (38,4% tơng ứng). Trung bình thu đợc 7,2 tế bào trứng/bò/lần siêu âm thứ nhất và 5,7 tế bào trứng/bò/lần siêu âm lặp lại. Các tác giả Viana và cs. (2004) đã sử dụng 2 quy trình siêu âm hút tế bào trứng từ bò cái Gir và thấy rằng số lợng tế bào trứng thu đợc ở quy trình siêu âm 1lần/tuần là 8,9 tế bào trứng (chọc hút trên 11,6 nang) lớn hơn ở quy trình siêu âm 2lần/tuần là 7,0 tế bào trứng (chọc hút trên 12,1 nang) điều này tơng ứng với tỷ lệ thu tế bào trứng ở quy trình thứ nhất là lớn hơn ở quy trình thứ hai (74,3% so với 59,0%). Nh vậy, ở quy trình siêu âm 1lần/tuần tỷ lệ thu tế bào trứng của các tác giả là cao hơn của chúng tôi (74,3% so với 71,03%) còn ở quy trình siêu âm thứ 2lần/tuần tỷ lệ thu tế bào trứng của các tác giả lại cho kết quả thấp hơn của chúng tôi (59,0% so với 71,03%). 4.3. Kết quả phân loại tế bào trứng thu đợc từ bò sống Sau khi thu đợc, tế bào trứng đợc chọn lọc, phân loại dựa vào chất lợng tế bào cumulus và sự đồng nhất của khối nhân theo phơng pháp của Loos và cs. (1989). Kết quả phân loại tế bào trứng đợc trình bày ở Bảng 3. Bảng 3 . Phân loại chất lợng tế bào trứng thu đợc Tế bào trứng thu đợc Chất lợng n % Loại A 400 35,97a Loại B 368 33,09b Loại C 54 4,86d Loại D 290 26,06c Loại sử dụng (A,B) 768 69,06 Chung 1112 100,0 a,b,c,d: Các chữ cái cùng cột khác nhau, giá trị sai khác có ý nghĩa (P<0,05) Bảng 3 cho thấy có sự khác nhau về tỷ lệ tế bào trứng thu đợc. Chất lợng tế bào trứng loại A là cao nhất, chiếm tỷ lệ 35,97%%, tiếp theo là tế bào trứng loại B và D (33,09% và 26,06% tơng ứng); tỷ lệ tế bào trứng loại C thu đợc là thấp nhất, đạt 4,86%. Nh vậy, tế bào trứng có thể sử dụng đợc đạt 69,06% (768/1112). Tỷ lệ tế bào trứng loại A và B của chúng tôi cao hơn so với kết quả của một số tác giả khác đã báo cáo. Tỷ lệ tế bào trứng loại A và B của chúng tôi (60,39%; 154/255) cao hơn tỷ lệ tế bào trứng loại I và II của các tác giả Viana và cs. (2004) khi sử dụng quy trình siêu âm mỗi tuần một lần (29,0%) và 2 lần một tuần (35%). Tuy nhiên, kết quả của chúng tôi còn thấp hơn so với kết quả của Reis và cs. (2002) đã báo cáo. Theo các tác giả này, tỷ lệ tế bào trứng loại I và II thu đợc ở lần siêu âm 1 và 2 tơng ứng là 54,9% và 46,8%. 4.4. ảnh hởng của khoảng cách siêu âm đến chất lợng tế bào trứng thu đợc Tỷ lệ tế bào trứng loại A và B ở phơng pháp thu tế bào trứng 2 lần một tuần cao hơn so với một lần một tuần (38,6%; 35,75% so với 34,9%; 32,04%, tơng ứng). Ngợc lại, tế bào trứng loại D ở phơng pháp thu tế bào trứng 2 lần một tuần thấp hơn so với một lần một tuần (20,88% so với 28,14%) (Bảng 4). Bảng 4. ảnh hởng của khoảng cách siêu âm đến chất lợng tế bào trứng thu đợc Chất lợng tế bào trứng Loại A Loại B Loại C Loại D Khoảng cách siêu âm N % n % n % n % 1 lần/tuần 278 34,9a 255 32,04a 39 4,90a 224 28,14a 2 lần/tuần 122 38,6b 113 35,75b 15 4,75a 66 20,88b Chung 400 36,08 368 24,31 54 13,33 290 26,28 a,b,c,d: Các chữ cái cùng cột khác nhau, giá trị sai khác có ý nghĩa (P<0,05) Kết quả thu tế bào trứng loại loại A, B của chúng ở phơng pháp thu tế bào trứng 1 lần một tuần (66,9%) và hai lần một tuần (74,3) cao hơn tỷ lệ tế bào trứng loại I và II của các tác giả Viana và cs. (2004) khi các tác giả này sử dụng quy trình siêu âm hút tế bào trứng một tuần một lần (29,0%) và 2 lần một tuần (35%). 4.5. ảnh hởng của khoảng cách siêu âm đến kết quả tạo phôi in vitro Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã sử dụng 394 tế bào trứng đợc thu một tuần một lần và 153 tế bào trứng đợc thu hai lần một tuần để nuôi thành thục, thụ tinh và nuôi hợp tử phát triển đến giai đoạn phôi dâu, phôi nang. Kết quả cho thấy không có sự khác biệt về tỷ lệ hợp tử phân chia giữa tế bào trứng đợc thu một lần một tuần và tế bào trứng đợc thu hai lần một tuần (53,8% so với 54,24%), nhng có sự khác nhau về tỷ lệ hợp tử phát triển đến giai đoạn phôi dâu, phôi nang (38,83% so với 42,48%) (Bảng 5). Bảng 5 . ảnh hởng của khoảng cách siêu âm đến kết quả tạo phôi in vitro Phát triển của tế bào trứng in vitro Tế bào trứng phân chia Tế bào trứng phát triển Khoảng cách siêu âm Số tế bào trứng nuôi n % n % 1lần/tuần 394 212 53,80a 153 38,83a 2lần/tuần 153 83 54,24a 65 42,48b Chung 547 295 53,93 218 39,85 a,b: Các chữ cái cùng cột khác nhau, giá trị sai khác có ý nghĩa (P<0,05) Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của Viana và cs. (2004) đã báo cáo. Theo các tác giả này, tỷ lệ hợp tử phân chia giữa tế bào trứng đợc thu một lần một tuần và tế bào trứng đợc thu hai lần một tuần tơng ứng là 68,8% so với 68,6%), nhng có sự khác nhau về tỷ lệ hợp tử phát triển đến giai đoạn phôi nang (31.8% so với 21,6%, tơng ứng) 4.6. Kết quả tạo phôi và cấy phôi tạo ra in vitro Từ 768 tế bào trứng loại A, B và C thu đợc từ bò sống bằng kỹ thuật siêu âm, đã có 547 (71,2%) tế bào trứng thành thục, 366 (66,91%) tế bào trứng thụ tinh, 295 (53,93%) hợp tử phân chia và 218 (39,95%) phôi dâu/phôi nang loại A, B và C thu đợc. Trong 20 phôi dâu/phôi nang loại A và B đợc cấy cho bò nhận động dục đồng pha, đã có 6 trờng hợp có chửa, đạt tỷ lệ 30,0% và đã có 5 bê ra đời (Bảng 6). Kết quả hợp tử phân chia trong nghiên cứu của chúng tôi còn thấp hơn so với kết quả của một số tác giả khác đã báo cáo khi sử dụng tế bào trứng thu từ bò sống (Galli và cs. 2001: 64,4%; Reis và cs. 2002: 81,1%; Rizos và cs. 2005: 80,8%). Tuy nhiên, Tỷ lệ hợp tử phát triển trong nghiên cứu của chúng tôi (39,85%) cao hơn tỷ lệ của của Galli và cs. (2001) (25,39% ) đã công bố. Tỷ lệ có chửa (30,0%) trong nghiên cứu của chúng tôi còn thấp hơn so tỷ lệ của Galli và cs. (2001) đã báo cáo (55,4%). Bảng 6. Kết quả tạo phôi và cấy phôi tạo ra từ tế bào trứng thu từ bò sống Kết quả Chỉ tiêu n % Tế bào trứng đợc nuôi thành thục in vitro 768 100,0 Tế bào trứng thành thục in vitro 547 71,2 Tế bào trứng thụ tinh/tế bào trứng thành thục 366 66,91 Hợp tử phân chia/tế bào trứng thành thục 295 53,93 Hợp tử phát triển/tế bào trứng thành thục 218 39,85 Cấy cho bò nhận động dục đồng pha (n) 20 100,0 Bò có chửa 6 30,33 Bê sinh ra 5 25,0 5. Kết luận và kiến nghị 5.1. Kết luận Không có sự khác biệt về số lợng tế bào trứng trung bình thu đợc/bò/tuần giữa phơng pháp siêu âm thu tế bào trứng lần một tuần so với hai lần một tuần (5,10 so với 5,28). Tuy nhiên, có sự khác nhau về tỷ lệ hợp tử phát triển đến giai đoạn phôi dâu, phôi nang giữa phơng pháp siêu âm thu tế bào trứng lần một tuần so với hai lần một tuần (38,83% so với 42,48%). 5.2. Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu để tăng số lợng tế bào trứng thu đợc/lần siêu âm thu tế bào trứng. Tài liệu tham khảo 1. De Roover, R., Genicot, G., Leonard, S., Bols, P. and Dessy, F. (2005). Ovum pick up and in vitro embryo production in cows superstimulated with an individually adapted superstimulation protocol. Animal Reproduction Science 86: 13 – 25. 2. Galli, C; Crotti, G; Notari, C; Turini, P; Duchi, R; Lazzari, G. (2001). Embryo Production by ovum pick up from live donors. Theriogenology 55: 1341-1357. 3. Reis , A., Steines, M.E., Watt, R.G., Dolman, D.F., McEvoy, T.G. (2002). Embryo production using defined oocyte maturation and zygote culture media following repeated ovum pick-up (OPU) from FSH-stimulated Simmental heifers. Animal Reproduction Science 72: 137-151. 4. Rizos, D., Burke, L., Duffy, P., Wade, M., Mee, J.F., O'Farrell, K.J., MarSiurtain, M., Boland, M.P. and Lonergan, P. (2005). Comparisons between nulliparous heifers and cows as oocyte donors for embryo production in vitrro. Theriogenology 63: 939-949. 5. Viana, JHM. Camargo, LSA., Ferreira, A.M. (2004). Short intervals between ultrasonographically guided follicle aspiration improve oocyte quality but do not prevent establishment of dominant follicle in the Gir breed of cattle. Animal Reproduction Science 84: 1-12. . cao của ngời thao tác. Kết quả thu tế bào trứng và chất lợng tế bào trứng thu đợc phụ thu c vào nhiều yếu tố. Để nâng cao hiệu quả của kỹ thu t siêu âm thu tế bào trứng và tạo phôi in vitro, . hành đề tài: Nghiên cứu ảnh hởng của khoảng cách siêu âm đến kết quả thu tế bào trứng từ bò sống và tạo phôi in vitro. 2. Mục tiêu của đề tài Nâng cao số lợng, chất lợng tế bào trứng thu đợc 3 tạo phôi và cấy phôi tạo ra từ tế bào trứng thu từ bò sống Kết quả Chỉ tiêu n % Tế bào trứng đợc nuôi thành thục in vitro 768 100,0 Tế bào trứng thành thục in vitro 547 71,2 Tế bào trứng