Nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR)

Hơn năm mươi năm trở lại đây máy cộng hưởng từ hạt nhân (nuclear magnetic resonance), thường gọi là NMR, đã trở thành công nghệ ưu việt cho việc xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. Trong tất cả các phương pháp phổ nghiệm, duy nhất NMR một loại công cụ phân tích đầy đủ và sự giải thích trọn vẹn phổ như được mong đợi. Mặc dù số lượng lớn các mẫu cần thiết phải đo phổ khối và cùng với các dụng cụ hiện đại có thể thu được các dữ liệu tốt từ mẫu có trọng lượng ít hơn một milligram. Ngày nay máy quang phổ NMR hoạt động với các tầng số 100, 200, 400, 500 và ngay cả 800 và 900MHz, tương ứng với cường độ từ trường 2.3, 4.6, 9.4;…hay 18.8 T…Ứng dụng máy NMR để đo cấu trúc của hợp chất hữu cơ cần máy 100 500 MHz.

Nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) Hơn năm mươi năm trở lại đây máy cộng hưởng từ hạt nhân (nuclear magnetic resonance), thường gọi là NMR, đã trở thành công nghệ ưu việt cho việc xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. Trong tất cả các phương pháp phổ nghiệm, duy nhất NMR một loại công cụ phân tích đầy đủ và sự giải thích trọn vẹn phổ như được mong đợi. Mặc dù số lượng lớn các mẫu cần thiết phải đo phổ khối và cùng với các dụng cụ hiện đại có thể thu được các dữ liệu tốt từ mẫu có trọng lượng ít hơn một milligram. Ngày nay máy quang phổ NMR hoạt động với các tầng số 100, 200, 400, 500 và ngay cả 800 và 900MHz, tương ứng với cường độ từ trường 2.3, 4.6, 9.4;…hay 18.8 T…Ứng dụng máy NMR để đo cấu trúc của hợp chất hữu cơ cần máy 100 - 500 MHz. I. Máy cộng hưởng từ hạt nhân NMR 1.Giới thiệu máy cộng hưởng từ hạt nhân 1.1 Hiện tượng cộng hưởng từ hạt nhân Khi mẫu chất khảo sát có chứa những hạt nhân mang từ tính được đặt vào giữa hai cực của một nam châm mạnh hạt nhân 1 H hoặc hạt nhân 13 C định hướng song song cùng chiều hoặc ngược chiều với từ trường của nam châm. Nếu hạt nhân này được chiếu bởi một bức xạ điện từ thích hợp, sẽ có sự hấp thu năng lượng sẽ xảy ra và lúc đó spin trạng thái năng lượng thấp sẽ nhảy chuyển lên spin trạng thái cao hơn. Khi có hiện tượng nhảy spin như thế, người ta nói là hạt nhân đã có sự cộng hưởng với bức xạ chiếu vào, từ đó có tên gọi là cộng hưởng từ hạt nhân. 1.2 Cấu tạo gồm có 6 bộ phận + Một nam châm +Máy chỉnh cường độ từ trường +Máy phát sóng radio +Máy thu ghi nhận sự hấp thu năng lượng song radio của mẫu chất khảo sát +Máy ghi nhận cộng hưởng và chuyển thành đồ thị (phổ NMR) 1.3 Nguyên tắc hoạt động và kỹ thuật thực nghiệm + Phần quan trọng nhất trong phổ kế NMR là nam châm từ (magnet), bộ phận phát sóng radio (radio frequency, rf) và bộ phát hiện (detector). Hợp chất được nghiên cứu được đựng trong ống đựng mẫu - ống thủy tinh dài khoảng 15 cm và có đường kính khoảng 5 mm – đặt trong từ trường ngoài Bo. Bộ phận phát song radio tạo ra rf và tín hiệu kích thích được phát hiện qua bộ phận thu (receiver), sau khi khuếch đại (amplier) và chuyển qua mặt phẳng x-y, phổ NMR có thể ghi lại (record) và tần số cộng hưởng có thể đo. + Hai kỹ thuật thực nghiệm NMR có giá trị là CW và FT ♥ CW là máy quét sóng liên tục (continuous wave) có nghĩa là trong suốt quá trình đo phổ NMR tần số υ của rf thay đổi liên tục. ♥ FT là máy biến đổi Fourier (Fourier transformation) trong đó sự kích thích hạt nhân xuyên qua một xung động rf, một trường rf mạnh (~50 Watt) trong khoảng thời gian ngắn (5 – 10 µs). 1.4 Phép đo phổ Phổ CW bây giờ chỉ dung để đo phổ 1H với mẫu 50 mg hay nhiều hơn đối với hỗn hợp phản ứng để xác định sơ bộ lượng sản phẩm. Phổ FT được lấy dung với lượng mẫu ít hơn cũng như cho độ chính xác và độ phân giải cao, thong thường đophổ 13C cần 50-100 mg bây giờ chỉ cần 1-10 mg. tuy vậy lúc đó cần nhiều xung (pulse, scan) hơn, với phổ 1H cần ít hơn 0.1 mg nếu khối lượng phân tử chất khảo sát lớn hơn vài trăm. Mẫu được làm tinh khiết (trên 95%) khan và không chứa dung môi (chứa H) bằng cách hút chân không khoảng hơn một ngày. Mẫu được hòa tan trong một dung môi, thích hợp nhất là các dung môi không cho tín hiệu hoặc tín hiệu nằm ngoài vùng tín hiệu chất khảo sát NMR. Các dung môi thường dungflaf CCl 4 , CDCl 3 , d 6 -DMSO [(CD 3 ) 2 SO] và D 2 O, sự lựa chọn dung môi được xác định bởi độ tan của chất cần khảo sát. Dung dịch được cho hoàn toàn vào ống tròn, đường kính khoảng 5 mm, chiều cao dung dịch khoảng 2-3 cm. Dung dịch phải không chứa tạp chất thuận từ và chất không tan, cũng như không nhớt, nếu không phổ cho độ phân giải kém. Sau đó cho TMS (tetramethylsilan) vào dung dịch làm chất chuẩn có độ dịch chuyển hóa học bằng 0. Ống dung dịch được cho vào máy NMR nằm trong cuộn xoắn giữa hai cực nam châm. Cuộn xoắn nối với bộ phận phát rf và bộ phận nhận. Nam châm được bật lên đến mức đồng nhất cao nhất có thể và ống đựng dung dịch được quay khoảng 30 vòng/giây xung quanh trục thẳng đứng để cải thiện hiệu quả đồng nhất. Phổ được lấy dung các thiết bị kiểm soát với các núm xoay tiếp xúc với thiết bị CW hay gắn với máy tính đối với máy FT sau đó phổ có thể chỉnh sữa và in. 2. Các khái niệm cơ bản về NMR 2.1 Tần số máy Nếu năng lượng giữa các trạng thái spin thấp, trạng thái m = -1/2 sẽ ưu tiên được chiếm và theo điều kiện của tần số Bohr, ∆E = hv = 2µ z B o = γhB o Hoặc tầng số vô tuyến: υ = γB o /2π ví dụ với cường độ từ trường B o = 11.7 Tesla ứng với máy NMR 500MHz thường sử dụng; với các proton γH = 2.675 x 10 8 T -1 S -1 Ta có: υ = 2.675 x 10 8 x 11.7/(2x3.14) = 500 x 10 6 Hz = 500MHz Tần số υ là tần số Larmor, đó cũng chính là tần số quay của nhân quanh trục từ trường B o ứng với một nhân xác định. Bảng υ (MHz) - B o (Tesla) Bo 1.4 1.9 2.3 4.7 7.1 11.7 14.1 υ 1 H 60 80 100 200 300 500 600 υ ( 13 C) 15.1 20.1 25.1 50.3 75.5 125.7 151 2.2 Độ dịch chuyển hóa học Trên phổ đồ, tại một vị trí mà một hạt nhân hấp thu năng lượng để có hiện tượng cộng hưởng được gọi là độ dịch chuyển hóa học. Phổ NMR được chia theo đơn vị delta (δ). Một đơn vị delta bằng 1 phần một triệu (ppm) của tần số hoạt động máy NMR. Độ dịch chuyển hóa học được tính theo công thức : δ (ppm) = (Độ dịch chuyển hóa học quan sát, tính từ TMS (Hz)/(tần số máy) Như vậy độ dịch chuyển hóa học không thay đổi ứng với các máy NMR có tần số hoạt động khác nhau. Máy NMR có tần số lớn sẽ cho các peak xa nhau dễ khảo sát hơn. Độ dịch chuyển hóa học của phổ 1 H: 0 – 14 ppm Độ dịch chuển hóa học của phổ 13 C: 0 – 220 ppm Các yếu tố ảnh hưởng đến độ dịch chuyển hóa học: liên kết hydro, nhiệt độ, dung môi, tần số máy,… 2.3 Hằng số ghép cặp Giả sử có n số proton tương đương Ha ở kề bên m số proton tương đương Hb thì hai proton này ghép từ nhau và trên phổ 1 H-NMR thấy proton H a cho tín hiệu là mũi đa, có tất cả m+1 mũi; proton H b cho tín hiệu mũi đa, có tất cả n+1 mũi (theo quy tắc n+1 trình bày sau). Do hai proton này ghép từ nhau nên khoảng cách giữa các mũi đa trong các tín hiệu của hai loại proton này sẽ bằng nhau. Khoảng cáh này gọi là hằng số ghép (coupling constant), ký hiệu J đơn vị Hz. Cách biểu diễn 2 proton Ha, Hb ghép từ với nhau là J ab Ví dụ: với phân tử ethylacetate: CH 3 CH 2 COOCH 3 . Trên phổ 1H-NMR cho 3 peak (3 nhóm tín hiệu). Nếu khuếch đại các peak thu được các peak rõ hơn. 3 tín hiệu là Quarlet, singlet, triplet là 3 tín hiệu của CH 3 , CH 2 , CH 3 . Độ dịch chuyển hóa học của các mũi đa được thể hiện chi tiết trên phổ đồ: Độ dịch chuyển hóa học của các peak đối với phổ 1 H NMR của Ethylacetate như sau: peak 1 2 3 4 5 6 7 8 δ (ppm) 4.0899 4.0757 4.0614 4.0471 1.9907 1.2211 1.2068 1.1925 Từ bảng số liệu ta tính được: vị trí peak và hằng số ghép cặp J = (δ n – δ n-1 ) x υ + Tại triplet peak 6, 7, 8, peak 7 được chọn làm tín hiệu với δ = 1.2068 (ppm) làm tròn với hai số lẻ δ = 1.21 ppm Hằng số ghép cặp J = (δ6-δ7) x 500 = (δ7-δ8) x 500 = 7.15 làm tròn với một số lẻ J = 7.1 Hz cường độ các peak trong nhóm theo %Int = 1:2:1 + Tại singlet peak 5 được chọ làm tín hiệu với δ = 1.9907 làm tròn với hai số lẻ δ = 1.99 ppm + Tại quarlet (1,2,3,4) vị trí chính giữa 1-4 hoặc 2-3 được chọn làm peak với δ = (f1+f4)/2 = (f2+f3)/2 = 4.0685 ppm làm tròn với hai số lẻ δ = 4.07 ppm Hằng số ghép cặp J = (δ1-δ2) x 500 = (δ2-δ3) x 500 = 7.15Hz làm tròn một chữ số lẻ J = 7.1 Hz Cường độ tương đối của các peak trong nhóm theo %Int = 8.4 : 24.8 : 25 : 8.6 Đối với phổ proton NMR của ethylacetate biểu diễn trong các bài báo cáo , bài viết như sau: 1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ) δ 1.21 (3H,t, J=7.1 Hz, CH 3 CH 2 -), 1.99 (3H,s,CH 3 CO 2 -), 4.07 (2H,q,J=7.1 Hz, CH 3 CH 2 -). II. Phân loại 1.NMR 1D Hình ảnh phổ được biểu diễn trên một trục nằm ngang có đơn vị là ppm lấy TMS làm mốc tại δ = 0 ppm ở phía phải của phổ đồ. 1.1 Phổ 1 H NMR Phổ 1 H NMR dùng để xác định có bao nhiêu nhóm H trong hợp chất cần khảo sát, dựa vào độ dịch chuyển hóa học có thể đoán được H được gắn vào vị trí nào của chất khảo sát. Ngoài ra kết hợp với phổ khối có thể đếm chính xác số H có trong hợp chất. Đối với phổ 1 H NMR peak dung môi CDCl 3 có độ dịch chuyển hóa học là 7.26 ppm. Độ dịch chuyển hóa học của một số nhóm có chưa H trong phổ 1 H NMR như sau: Nhóm chất CH3, CH2,CH bảo hòa CH3, CH2, CH bất bảo hòa có O C=C Vòng thơm C=O δ (ppm) 0 - 3 3 – 4.5 4.5 – 6.5 6.5 – 8.5 8.5 – 10 1.2 Phổ 13 C NMR kết hợp phổ DEPT 135, DEPT 90 Phổ 13C NMR cho chúng ta biết số loại C và xác định số C cũng như vị trí của các C trên cấu trúc hợp chất khảo sát. Trong số 3 loại cacbon thì -CH 3 , -CH 2 cho peak có cường độ mạnh hơn –CH. Độ dịch chuyển hóa học của cacbon thường lớn hơn 15-20 lần so với độ dịch chuyển của proton bởi vì nguyên tử cacbon gần với hydrogen gắn vào nó hơn là gần một nhóm che chắn (hoặc giảm chắn khác). Độ dịch chuyển hóa học của các loại C trong phổ 13 C NMR thường nằm trong các khoảng được trình bày như sau: Nhóm C CH,CH 2 ,CH 3 bảo hòa không O CH,CH 2 ,CH 3 bão hòa có O C=C C=O δ (ppm) 0 - 50 50 -100 100 - 150 150 – 220 + Phổ 13 C NMR DEPT 90 chỉ cho các peak CH và CH 3 trên phổ đồ (cho peak dương) + Phổ 13 C NMR DEPT 135 cho các peak CH, CH 2 , CH 3 trên phổ đồ trong đó peak CH 2 là peak hướng xuống Phổ DEPT không cho các peak của cacbon tứ cấp. 2.NMR 2D Hình ảnh biểu diễn có hai loại là đường: đường viền quanh và hình ngọn núi. Thường được biểu diễn dạng viền quanh hơn. 2.1 Phổ 1 H- 1 H COSY Đây là loại phổ cho biết mối tương quan giữa proton-proton với nhau: proton gem (germinal, hai proton cùng gắn trên một cacbon); proton vic (vicinal, hai proton gắn trên hai cacbon kề nhau). 2.2 Phổ 1 H- 13 C HETCOR Phổ COSY dị hạt nhân được gọi là HETCOR đây là phổ cho biết sự liên quan giữa các tín hiệu 1 H trục tung với tín hiệu của cacbon 13 C trục hoành. Do có độ dịch chuyển hóa học trên phổ 1 H NMR và 13 C NMR khác nhau trên hai chiều do đó nó không đối xứng qua đường chéo như phổ COSY. Trong phổ đồ của phổ HETCOR chỉ cho tín hiệu của các nhóm CHn với n>=1 ví dụ như: -CH, =CH,- CH 2 , -CH 3 , =CH 2 , tức không cho các tín hiệu của cacbon tứ cấp. Từ các peak của phổ 13C trục hoành kẻ xuống nếu gặp tín hiệu giao thì cacbon đó có thể có H gắn trực tiếp vào nó hoặc các H tương đương hóa học với nhau hay có sự tình cờ nào đó. 2.3 Phổ HSQC; Phổ HMQC Sử dụng kỹ thuật ngược lại với phổ HETCOR, phổ HSQC và HMQC khảo sát hạt nhân 1 H trục hoành ghép cặp với 13 C trục tung. Các tính hiệu trên phổ cũng như cách giải phổ tuuowng tự phổ HETCOR. 2.4 Phổ COLOC; Phổ HMBC + Phổ COLOC khảo sát các hợp chất có nhiều cacbon tứ cấp. phổ này dùng xác định 13 C một cách chính xác nhưng do ảnh hưởng của tương tác 1H,1H khó tiên đoán được cường độ các tín hiệu nên phổ này ít được sử dụng. + Phổ HMBC có ưu điểm thời gian đo ngắn hơn rất nhiều so với COLOC. Phổ HMBC nhằm xác định các proton nhằm vào các tín hiệu tương tác qua 2 và 3 nối không xuất hiện tín hiệu qua một nối. Phổ giúp gián tiếp biết được các khung sườn các cacbon thông qua các tương tác proton. 2.5 Phổ tương quan 13 C- 13 C INADEQUAT Phổ này cho thấy mối tương quan ngang qua nối nhờ phổ cho biết trong phân tử cacbon nào sẽ kề bên cacbon nào. Phổ 1D 13 C INADEQUAT thường ít sử dụng do khó xác định được mối lien hệ giữa 13 C, 13 C. Ngược lại phổ 2D 13 C INAQUAT lại rất hữu dụng có hình ảnh giống phổ COSY , có tín hiệu giao nhưng lại không có tín hiệu trên đường chéo, vì các tín hiệu này đã được lọc. Thông thường người ta ít sử dụng đến phổ này do tốn nhiều mẫu và thời gian ghi phổ tương đối phức tạp vì vậy chỉ có những hợp chất khó giải mới dùng đến. Ngoài các kỹ thuật ghi phổ NMR thường dùng để xác định các hợp chất hữu cơ, ngày nay còn có một số kỹ thuật khác hiện đại hơn để xác định các cấu trúc của protein hay các phân tử sinh học. Tài liệu tham khảo 1. PGS-TS Nguyễn Kim Phi Phụng (2005), Phổ NMR sử dụng trong phân tích hữu cơ,NXB Đại học quốc gia TPHCM. 2. TS Lê Thanh Phước Các Phương Pháp Phân Tích Phổ Nghiệm . Nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) Hơn năm mươi năm trở lại đây máy cộng hưởng từ hạt nhân (nuclear magnetic resonance) , thường gọi là NMR, đã