Nghiên cứu qui trình tổng hợp flavonoid được chiết tách từ cây thổ phục linh làm chất chống ung thư

LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn Cô giáo Lê Thị Hồng Nhung, đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện cho em hoàn thành đề tài này. MỤC LỤC MỞ ĐẦU Việt Nam là nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, ẩm ướt quanh năm; các nhà khoa học quốc tế đã xếp Việt Nam vào những nước “rừng mưa nhiệt đới”; với điều kiện thuận lợi, hệ thực vật Việt Nam đã phát triển rất đa dạng và phong phú với 12.000 loài thực vật bậc cao, không kể đến các loại nấm, tảo và rêu; nhiều loài trong số đó đã được sử dụng trong y học cổ truyền và các mục đích khác phục vụ đời sống của nhân dân Việt Nam trong suốt quá trình lịch sử tồn tại và phát triển của đất nước. Tìm kiếm, phát hiện và nghiên cứu các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao để ứng dụng trong y dược, nông nghiệp và các nhu cầu khác của đời sống con người là một trong những nghiệm vụ quan trọng đã và đang được các nhà khoa học trong nước và quốc tế hết sức quan tâm. Với việc phát hiện ra nhiều chất có hoạt tính sinh học quí giá từ thiên nhiên, các nhà khoa học đã có những đóng góp đáng kể trong việc tạo ra những biệt dược điều trị những bệnh nhiệt đới và các bệnh hiểm nghèo, kéo dài tuổi thọ và nâng cao chất lượng cuộc sống của con người. Thiên nhiên không chỉ là nguồn nguyên liệu cung cấp các hoạt chất quí hiếm để tạo ra các biệt dược mà còn cung cấp những chất đóng vai trò dẫn đường trong việc tổng hợp ra các loại thuốc mới có ý nghĩa khoa học, kinh tế xã hội cao… Cây Thổ phục linh có rất nhiều ứng dụng trong thực tế, như chữa phòng thấp, đau nhức xương, ngộ độc thủy ngân….Bên cạnh đó, các nghiên cứu dược lý đã tìm thấy khả năng sử dụng trong hóa học trị liệu của một số thành phần hóa học của vỏ và rễ cây. Thổ phục linh có nhiều tác dụng nên em quyết định chọn đề tài:” Nghiên cứu qui trình tổng hợp flavonoid được chiết tách từ cây Thổ phục linh làm chất chống ung thư”, từ đó xác định thành phần hóa học và tìm ra nguồn nguyên liệu quí cho ngành hóa dược. Phần I: TỔNG QUAN I.Cây thổ phục linh 1.1.Đặc điểm *Thổ Phục Linh có tên gọi Việt Nam khác là: cây Khúc khắc, Kim cang Tên khoa học là: Rhizoma Smilacis Glabrae * Nguồn gốc: Mô tả: Dây leo trườn dài 4- 5m (tới 10m), có nhiều cành mảnh không gai. Rễ củ vặn vẹo. Lá mọc so le, hình trái xoan bầu dục dài 5-12cm, rộng 1-5cm, mang 2 tua cuốn do lá kèm biến đổi, thường tiêu giảm thành mũi nhọn ngắn, có khi kéo dài; cuống lá dài 1cm; gân chính 3, hình cung. Cụm hoa ở nách lá. Tán đơn độc có 20-30 hoa. Hoa màu lục nhạt, cuống hoa dài hơn cuống tán. Hoa đực và hoa cái riêng rẽ. Quả mọng, hình cầu, gần như 3 góc, khi chín màu tím đen, chứa 3 hạt. Thổ Phục Linh là cây có biên độ sinh thái rộng: Cây ưa sáng song cũng có thể hơi chịu bóng, ưa ẩm nhưng có khả năng chịu hạn tốt. Cây thường mọc trong các quần thể hệ thứ sinh ở đồi cây bụi, đát sau nương rẫy, hay dưới tán rộng thông mới trồng. Độ cao phân bố từ vài chục mét lên tới 1000m so với mực nước biển. Sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm, ra hoa đầu tháng năm. Mùa ra quả tháng 8-12. Tuy nhiên chỉ những cây được chiếu sáng đầy đủ mới có nhiều hoa, quả. Tái sinh tự nhiên tốt từ hạt hoặc các phần còn lại sau khi bị chặt phá. Nơi sống và thu hái: Loài của Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc, Ðài Loan, Lào, Campuchia, Thái Lan và Việt Nam. Ở nước ta cây mọc ở vùng đồi núi, thung lũng, rừng thưa, leo lên các lùm bụi, phổ biến từ Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Thái, Vĩnh Phú, Hoà Bình, Ninh Bình, Thanh Hoá, Nghệ An tới Kon Tum, Lâm Ðồng, Khánh Hoà, Bình Thuận. Người ta thu hái thân rễ tươi quanh năm, tốt nhất là vào mùa hạ; cắt bỏ rễ con và gai, phơi hoặc sấy khô; hay có thể rửa sạch, ủ mềm 3 ngày rồi thái mỏng, phơi hay sấy khô. 1.2.Thành phần hóa học Thành phần hóa học chính là Saponin steroid. Lá và ngọn non chứa theo tỷ lệ g%: nước 83,3; protein 2,4; glucid 8,9; xơ 2,2; tro 1,2 và theo mg%: caroten 1,6; vitamin C 18. Trong thân rễ có nhiều tinh bột và có sitosterol, stigmasterol, smilax saponin, tigogenin. 1.2.1 Định nghĩa Saponin. Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật. Saponin cũng có trong một số động vật như hải sâm, cá sao. Saponin còn gọi là saponosid do chữ latin sapo = xà phòng (vì tạo bọt như xà phòng) 1.2.2.Cấu trúc hóa học SAPONIN AglyconeGlycone Saponin TriterpenoidsSaponin Steroids 1.2.2.1.Phần Glycone Phần đường nối vào OH ở C-3 của aglycon. Cho đến nay người ta biết khoảng 40 loại đường khác nhau như D-glucose, L-ramnose, D-fucose… Những đường này có các đặc tính sau: dễ bị thuỷ phân, cho phản ứng màu với thuốc thử Kele-Kiliani, thuốc thử Xanthydrol.Mạch đường có thể là monosacarit hoặc oligosacarit. Người ta nhân thấy rằng glucose bao giờ cũng ở phía cuối mạch. 1.2.2.2.Phần Aglycone(genin) a.Saponin Steroids  Nhóm spirostan: Ta xét 3 chất saponin làm ví dụ: : sarsasapogenin, smilagenin, tigogenin. Những chất này có 27 carbon như cholesterol, nhưng mạch nhánh từ C 20-27 tạo thành 2 vòng có oxy (16,22 và 22,26 diepoxy), một vòng là hydrofuran (vòng E) và một vòng là hydropyran (vòng F). Hai vòng này nối với nhau bởi 1 carbon chung ở C-22. Mạch nhánh này được gọi là mạch nhánh spiroacetal. Sarsasapogenin smilagenin tigogenin Ba chất trên là 3 đồng phân. Smilagenin và tigogenin khác nhau do cấu hình ở C-5. Còn sarsasapogenin và smilagenin thì khác nhau do cấu hình ở C-25. Sarsasapogenin có nhóm methyl ở C-25 hướng axial có cấu hình tuyệt đối 25S, smilagenin thì nhóm methyl ở C-25 hướng equatorial có cấu hình tuyệt đối 25R. Các sapogenin nhóm này có nối vòng C và D trans (khác với glycosid tim). Còn vòng A và B có thể là cis như ở chất sarsasapogenin và smilagenin hoặc có thể là trans như ở chất tigogenin. Công thức lập thể của 3 chất sarsasapogenin, smilagenin và tigogenin.Nhóm OH ở C3 thường hướng β, một số hướng α ví dụ các saponin của tỳ giải. Nhóm spirostan hiện nay được chú ý nhiều vì là nguồn nguyên liệu quan trọng để bán tổng hợp các thuốc steroid. Hai sapogenin quan trọng nhất là diosgenin (có chủ yếu trong các loài Dioscorea) và hecogenin (có chủ yếu trong các loài Agave). Ở dạng glycosid phần đường được nối vào OH ở C-3, một số ít trường hợp ở C1. Mạch đường thường phân nhánh và phức tạp. Ví dụ digitonin là một saponosid có trong cây digital, có mạch đường gồm 5 đơn vị đường và phân nhánh.  Nhóm furostan: Nhóm này có cấu trúc tương tự như nhóm spirostan chỉ khác là vòng F bị biến đổi. Trường hợp thứ nhất: vòng F mở và nhóm alcol bậc một ở C-26 được nối với đường glucose. Nếu glucose ở C-26 bị cắt (bởi enzym hoặc bởi acid) thì xảy ra sự đóng vòng F thành vòng hydropyran và chuyển thành dẫn chất nhóm spirostan. Ví dụ sarsaparillosid dưới tác dụng của enzym thủy phân cắt mạch glucose ở C-26 sẽ chuyển thành parillin. Trường hợp thứ hai: vòng F là vòng 5 cạnh do sự đóng vòng 22-25 epoxy ví dụ avenacosid có trong yến mạch (Avena L. Họ Lúa - Poaceae) Avenacosid A cũng có 2 mạch đường . Khi thủy phân cắt đường glucose ở C-26 thì cũng chuyển thành dẫn chất nhóm spirostan. Sarsaparillosid và avenacosid A đều có 2 mạch đường. Người ta gọi đây là các bidesmosid (desmos = mạch).  Nhóm aminofurostan: Ở đây vòng F mở như trường hợp sarsaparillosid nói ở trên nhưng ở vị trí C-3 đính nhóm NH2. Ví dụ jurubin, là saponin có trong Solanum paniculatum  Nhóm spirosolan : Nhóm này chỉ khác nhóm spirostan ở nguyên tử oxy của vòng F được thay bằng NH. Một điểm cần chú ý là ở đây có isomer ở C-22 (khác với nhóm spirostan). Ví dụ solasonin có trong cây cà Úc (= cà lá xẻ ) Solanum laciniatum có cấu trúc (25R) 22α còn tomatin là các saponin có trong cây cà chua thì có cấu trúc (25S) 22β.  Nhóm solanidan: Solanin có trong mầm khoai tây thuộc nhóm này. Ở đây 2 vòng E và F cùng chung 1C và 1N. Những chất thuộc 3 nhóm aminofurostan, spirosolan và solanidan đều có chứa N vừa mang tính alcaloid vừa mang tính glycosid nên được gọi là những chất glycoalcaloid.  Ngoài những nhóm saponin steroid kể trên người ta còn gặp một số saponin steroid có cấu trúc mạch nhánh khác ví dụ polypodosaponin và oslandin được Jizba phân lập 1971 từ thân rễ cây Polypodium vulgare L. Oslandin là một bidesmosid có vị ngọt. α-spinasterol glycosid có trong cây chè Camelia sinensis (L.) O. K.tze (Thea sinensis L.). b, Saponin triterpenoid Phần genin của loại này có 30 cacbon cấu tạo bới 6 nhóm hemiterpen. Người ta chia làm 2 loại: Saponin triterpenoid pentacyclic và Saponin triterpenoid tetracyclic  Saponin triterpenoid pentacyclic Loại này chia ra các nhóm: Olean, ursan, lupan, hopan * Nhóm Olean: Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên thuộc nhóm này. Phần aglycon thường có 5 vòng và thường là dẫn xuất của 3-β hydroxy olean 12 - ene, tức là β-amyrin. Một vài aglycon làm ví dụ: - Acid oleanolic: R1 = R2 = R4 = R5 = -CH3, R3 = -COOH. - Hederagenin: R2 = R4 = R5 = -CH3 , R1 = -CH2OH , R3 = -COOH . - Gypsogenin: R2 = R4 = R5 = -CH3 , R1 = -CHO , R3 = -COOH Mạch đường có thể nối vào C-3 theo dây nối acetal, có khi mạch đường nối vào C-28 theo dây nối ester. Gần đây người ta phân lập được các saponin có đến 10-11 đơn vị đường nếu kể cả 2 mạch, riêng một mạch có thể đến 6 đơn vị đường. * Nhóm ursan : Cấu trúc của nhóm ursan cũng tương tự như nhóm olean chỉ khác là nhóm methyl ở C-30 không đính vào vị trí C-20 mà lại đính ở vị trí C-19. Các sapogenin nhóm ursan thường là những dẫn chất của 3-β hydroxy ursan 12-ene, tức là α-amyrin. Những saponin của nhóm này ít gặp hơn nhóm olean. Cinchona glycosid A, Cinchona glycosid B có trong cây canh-ki-na, asiaticosid có trong rau má là những saponin của nhóm này. * Nhóm lupan (III): Cấu trúc của nhóm lupan có các vòng A,B,C,D giống như các nhóm trên, chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh, C-20 ở ngoài vòng và thường có nối đôi ở vị trí 20-29. Lấy một ví dụ là saponin có trong rễ cây Ô rô Acanthus iliciformis Linn.: [ α -L - arabinofuranosyl (1-4) β -D glucoropyranosid (1-3)]-3- β -hydroxy-lup-20(29) ene (IIIa). Một số saponin có trong cây ngũ gia bì chân chim cũng thuộc nhóm này. * Nhóm hopan (IV): Cấu trúc của nhóm hopan có các vòng A,B,C,D giống như các nhóm trên, chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh, C-22 ở ngoài vòng và nhóm methyl góc đính ở C-18 thay vì ở C-17. Saponin đầu tiên được biết là chất mollugocin A có trong cỏ thảm Mollugo hirta L.  Saponin triterpenoid tetracyclic Có 3 nhóm chính: dammaran*, lanostan*, cucurbitan. * Nhóm dammaran (V): Ðại diện là các saponin của nhân sâm. Phần aglycon gồm 4 vòng và một mạch nhánh. Khi tác dụng bởi acid thì mạch nhánh đóng vòng tạo thành vòng tetrahydropyran. Bằng các phương pháp đặc biệt để cắt phần đường, người ta đã thu được các genin thật. Hai genin chính là: protopanaxadiol và protopanaxatriol. Phần đường nối vào OH ở cabon số 3 hoặc có khi thêm 1 mạch nữa nối vào OH ở mạch nhánh. Saponin triterpenoid tetracyclic nhóm damaran còn gặp trong hạt táo (Ziziphus jujuba Mill.), rau đắng biển (Bacopa monnieri (L.) Wettst. * Nhóm lanostan (VI): Holothurin A, một trong những saponin có trong các loài hải sâm - Holothuria spp. là một ví dụ của nhóm này. Một nhóm phụ của nhóm lanostan là nhóm cycloartan có cấu trúc 9,19 cyclo (9β) lanostan. Các saponin abrusosid A, B, C, D có trong cam thảo dây Abrus precatorius là những saponin thuộc nhóm này. * Nhóm cucurbitan (VII). Phần lớn các saponin nhóm cucurbitan gặp trong họ Cucurbitaceae. Ở đây nhóm CH3 góc thay vì ở vị trí C10 lại đính ở C9. [...]... dùng cây Thổ phục linh để chế nước giải khát, giải độc cơ thể giúp tiêu hóa Gần đây, một số cơ sở nghiên cứu Y học cổ truyền của Trung Quốc đã có những bài thuốc dùng Thổ phục linh là chính để chữa nhiều bệnh đạt hiệu quả tốt Ví dụ như: - Thổ phục linh chữa viên tĩnh mạch nông huyết khối: Thổ phục linh 30g, Thư ng truật 15g, Tiểu hồi hương 10g, Đương qui 10g, Xuyên khung 10g, Ngũ linh chi 10g, Xích thư c... ngày - Thổ phục linh chữa Eczema: Nghiền Thổ phục linh thành bột mịn, đắp lên chỗ đau, mỗi ngày 3-5 lần, liên tục 5 ngày II Cây ban tràn 1.1 Đặc điểm 1.2 Thành phần hóa học 1.3 Công dụng 1.4 Tình hình nghiên cứu III Hợp chất Flavonoid 1.1 Định nghĩa, nguồn gốc  Định nghĩa Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thư ng gặp trong thực vật, phần lớn có màu vàng Về cấu trúc hóa học, flavonoid có khung... lư) 30 g Sắc uống ngày một thang - Ung thư đường tiêu hóa: Thổ phục linh 30 g, nấm hương 10 g, bạch truật 20 g Sắc uống ngày một thang - Ung thư hạch: Thổ phục linh 100 g, tán bột mịn để sắc nước uống hoặc thêm gạo nấu cháo ăn hằng ngày - Ngộ độc thủy ngân: Thổ phục linh 30 g, cam thảo bắc 10 g, đậu xanh (lục đậu) 20 g Sắc uống ngày một thang - Viêm da mủ: Thổ phục linh 30 g, bồ công anh, kim ngân hoa,... ngày, uống liên tiếp 7 thang Thư ng sau 4 kỳ kinh thì khỏi - Thổ phục linh chữa đau bụng kinh nguyệt: Thổ phục linh 30g, Hoàng bá 15g, Hạ khô thảo 15g, Bào sơn xuyên giáp 10g, Hải tảo 15g, Mẫu lệ 30g, Hương phụ 15g, Đương qui 15g, Đan sâm 15g, Trạch tả 190g, Ngưu tất 10g Sắc nước uống, mỗi ngày 1 thang chia làm 2 lần - Thổ phục linh chữa u nang buồng trứng: Lấy 30g Thổ phục linh, sắc lấy nước, để ấm,... thấp, gân xương đau nhức, tê buốt: Thổ phục linh 20 g, dây đau xương 20 g, thiên niên kiện, đương quy đều 8 g, bạch chỉ 6 g, cốt toái bổ 10 g Sắc uống ngày một thang - Viêm bàng quang: Thổ phục linh 30 g, mã đề 20 g, râu ngô Sắc uống ngày một thang - Ung thư bàng quang: Thổ phục linh 30 g, trà thụ căn 20 g, tề thái 20 g Sắc lấy nước pha với nước đường để uống Hoặc thổ phục linh tươi 60 g, bẹ móc (tông lư)... thành hợp chất có màu đỏ 2.2 Các phương pháp chiết suất và tổng hợp Flavonoid 2.2.1 Chiết suất Nguyên liệu được chiết với methanol, bốc hơi methanol trong chân không hay trên nồi cách thuỷ tới cạn Hoà tan cặn trong nước rồi chiết lại bằng ethyl acetat Bốc hơi dịch chiết ethyl acetat trên cách thuỷ tới cạn Hoà tan cặn trong methanol để chấm sắc ký hoặc có thể dùng dịch chiết methanol ban đầu làm dung... trong dung dịch kiềm loãng, dựa vào đó để chiết - Để chiết các dẫn chất ở dạng glycoside, người ta phải loại các chất thân dầu bằng ether dầu hỏa sau đó chiết bằng nước nóng hoặc methanol hoặc ethanol hay hỗn hợp cloruafom và ethanol - Dịch chiết đem làm đậm đặc dưới chân không ở nhiệt độ thấp (40-70 độ C) - Để phân lập từng chất flavonoid, người ta dùng phương pháp sắc khí cột * Chất hấp phụ: Chất. .. cam thảo nam 10 g, vỏ núc nác 15 g Sắc uống ngày một thang  Theo Tây y dùng làm thuốc tẩy máu, làm ra mồ hôi, chữa giang mai… Viện Quân y 108 đã dùng thổ phục linh và hạ khô thảo điều trị vảy nến và vó kết quả, để tài nghiên cứu khoa học được báo cáo cấp quốc gia  Tại Việt Nam, tên gọi của cây này được xác minh và đối chiếu từ năm 2005,2006 và kinh nghiệm sử dụng của gia đình cụ Âm Kông, của đồng bào... pháp chung nào để chiết suất các flavonoid vì chúng rất khác nhau về độ tan trong nước và trong các dung môi hữu cơ VD: Với các chất anthocyanin thư ng kém bền vững nhất là các acyl anthocyanin được acyl hóa với các acid aliphatic do đó người ta thư ng chiết bằng methanol có mặt của các acid yếu như acid acetic, acid citric,… - Các dẫn chất flavon, flavonol có nhóm -OH tự do ở vị trí thứ 7 tan được trong... Màu thay đổi tùy theo pH  Độ tan Các flavonoid glycosid và flavonoid sulfat: tan tốt trong nước, cồn nước Aglycol flavonoid: tan trong dung môi hữu cơ Dẫn xuất flavonoid có nhóm 7-OH dễ tan trong kiềm loãng b.Tính chất hóa học Tính chất của nhóm chức –OH (hợp chất đa phenol): tạo phức với các ion kim loại, phản ứng với muối diazoni (-OH số 7) Tính chất của khung cấu tạo: Tính oxy hóa và tính khử  . cứu qui trình tổng hợp flavonoid được chiết tách từ cây Thổ phục linh làm chất chống ung thư , từ đó xác định thành phần hóa học và tìm ra nguồn nguyên liệu quí cho ngành hóa dược. Phần I: TỔNG. 30 g. Sắc uống ngày một thang. - Ung thư đường tiêu hóa: Thổ phục linh 30 g, nấm hương 10 g, bạch truật 20 g. Sắc uống ngày một thang. - Ung thư hạch: Thổ phục linh 100 g, tán bột mịn để sắc nước. nghiên cứu III. Hợp chất Flavonoid 1.1 Định nghĩa, nguồn gốc.  Định nghĩa. Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thư ng gặp trong thực vật, phần lớn có màu vàng. Về cấu trúc hóa học, flavonoid