Bài giảng SẮC KÝ LỎNG HI ỆU NĂNG CAO

SẮC KÝ LỎNG HI ỆU NĂNG CAO HPLC PGS Phạm gia Huệ Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-High performance liquid chromatography) còn được gọi là sắc ký lỏng cao áp, hoặc chỉ đơn giản gọi là sắc ký lỏng vì ngày nay nó đã trở thành quá thông dụng. HPLC ra đời khi người ta sản xuất được chất nhồi cột có cỡ hạt khoảng 10 µm hay nhỏ hơn (5 và 3 µm), có hiệu suất tách rất cao. Cỡ hạt bé đòi hỏi dùng bơm để nén dung môi qua cột. Với loại chất nhồi mới này và hệ thống máy vi tính, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ra đời. UPLC (Ultra performance liquid chromatography) hay sắc ký lỏng siêu hiệu năng với hạt chất nhồi cột có đường kính dưới 2 µm, có hiệu suất tách cao hơn nữa. 1. Quá trình sắc ký và các đại lượng đặc trưng 1.1 Một số khái niệm mở đầu 1.1.1. Định nghĩa: Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp. Trong sắc ký các chất khác nhau được tách dựa trên sự phân chia khác nhau của chúng vào hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau : một pha tĩnh và một pha động. Pha tĩnh được nhồi trên cột, pha động đi qua cột. Khi hỗn hợp cần tách được pha động kéo qua cột, chất nào có ái lực mạnh hơn với pha tĩnh sẽ di chuyển chậm hơn, vì vậy các chất có thể tách khỏi nhau. 1.1.2. Quá trình sắc ký: Quá trình tách sắc ký thường bao gồm 3 giai đoạn chính: a. Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh: đưa hỗn hợp lên cột. b. Cho pha động chạy qua pha tĩnh: dung môi qua cột, kéo theo các chất di chuyển trên pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau và có vị trí khác nhau trên cột tạo thành sắc đồ (sắc ký đồ). Giai đoạn này gọi là khai triển sắc ký (development). Nếu tiếp tục cho pha động chạy thì các chất có thể lần lượt bị kéo ra ngoài ra khỏi cột. Đó là quá trình rửa giải (elution) và dung môi dùng được là dung môi rửa giải (eluent) dịch hứng được ở cuối cột gọi là dịch rửa giải (eluate). Nếu các chất được tách trên pha tĩnh (sắc ký khai triển) ta có thể lấy từng phần pha tĩnh có mang chất (phân đoạn bột trên cột) đem chiết lấy chất. Nếu các chất được tách ra ngoài pha tĩnh (sắc ký rửa giải) ta có thể hứng lấy các phân đoạn dịch rửa giải có chất. c. Phát hiện các chất : các chất màu có thể phát hiện dễ dàng, các chất không màu có thể phát hiện bằng đèn tử ngoại hay bằng các thuốc thử. Trong sắc ký rửa giải có thể phát hiện các chất khi chúng đi ra khỏi cột bằng cách cho dung dịch rửa giải đi qua một bộ phận phát hiện gọi là detectơ (detector) đặt sau cột. 1 1.1.3. Phân loại các phương pháp sắc ký. -Sắc ký hấp phụ (adsorption chromatography): pha tĩnh là chất rắn có khả năng hấp phụ. Pha động có thể là chất lỏng hay chất khí. -Sắc ký phân bố (partition chromatography): pha tĩnh được giữ trên bề mặt một chất rắn gọi là chất mang (support), chất mang phải là chất trơ, không tham gia vào quá trình sắc ký. Pha động có thể là chất lỏng hay chất khí. -Sắc ký trao đổi ion (ion-exchange chromatography): pha tĩnh là chất nhựa trao đổi ion (hợp chất cao phân tử có mang những ion có khả năng trao đổi với các ion cùng dấu của hỗn hợp sắc ký). -Sắc ký theo loại cỡ (size-exclusion chromatography) còn gọi là sắc ký trên gel. Các phân tử cỡ lớn sẽ được loại, các phân tử nhỏ hơn sẽ được tách theo kích thước, phân tử bé di chuyển chậm. Các phương pháp sắc ký khác: sắc ký ái lực, sắc ký điện… Ghi chú: Trong sắc ký khí, chủ yếu là sắc ký phân bố và sắc ký hấp phụ 1.2. Cơ sở lý thuyết sắc ký (Giới thiệu sơ lược): Có hai yếu tố quyết định quá trình tách sắc ký : - Tốc độ di chuyển của các chất: Các chất khác nhau phải có tốc độ di chuyển khác nhau, cho các pic ở vị trí khác nhau trên sắc đồ. - Sự mở rộng dải hay sự doãng pic (band broadening, peak spreading), do các tiểu phân của cùng một chất di chuyển với tốc độ khác nhau. Hai pic ở gần nhau trên sắc đồ nếu bị doãng nhiều sẽ trùm lên nhau (xen phủ lên nhau), không tách được khỏi nhau. Ta hãy xét hai vấn đề nêu trên : 1.2.1. Tốc độ di chuyển của các chất: 1.2.1.1. Tốc độ di chuyển của một chất: Tốc độ di chuyển của một chất có thể được mô tả bởi các đại lượng về sự lưu giữ của chất đó trên pha tĩnh (thời gian lưu, hê). a- Thời gian lưu (retention time): Trên sắc đồ, trục tung chỉ cường độ tín hiệu của detectơ, trục hoành là trục thời gian (hoặc thể tích dung môi). Hãy quan sát sắc đồ, trường hợp có một chất (hình 1). Thời gian lưu t R (phút) là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký,tới detectơ và cho pic trên sắc đồ (tính từ lúc tiêm đến lúc xuất hiện đỉnh của pic). t 0 : là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ (là chất di chuyển với tốc độ của pha động). t 0 thường được gọi là thời gian chết. t R càng lớn, chất tan bị lưu giữ càng mạnh và di chuyển càng chậm. b-Thời gian lưu hiệu chính t’ R được tính theo công thức: t’ R = t R - t 0 2 w Thời gian, phút w = chiều rộng pic đường nền t o Tín hiệu đến detector Hình 1: Sắc đồ một chất 1.2.1.2. Tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất: Được đặc trưng bởi đại lượng thừa số chọn lọc hay hệ số chọn lọc α (selectivity factor), còn gọi là hệ số tách: α = ' ' RA RB t t Theo qui ước, B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A vì vậy α luôn luôn lớn hơn 1. α còn được gọi là độ lưu giữ tỷ đối (relative retention). Để tách riêng hai chất, cần có >1, thường chọn α trong khoảng 1,05 đến 2,0. α càng lớn hai chất càng tách ra khỏi nhau với α quá lớn thời gian phân tích sẽ kéo dài. 1.2.2. Sự doãng píc và hình dáng píc. Như trên đã trình bày, hình dáng của pic và sự doãng píc liên quan chặt chẽ đến sự tách sắc ký. Hình dáng lý tưởng của píc là píc đối xứng. Trên thực tế píc sắc ký thường chỉ gần đối xứng. Để đánh giá tính bất đối của píc người ta dùng hệ số bất đối AF (Asymmetry Factor). AF = b / a h b = phần chiều rộng phía sau của píc. a = phần chiều rộng phía trước của píc. a b w 1/10 = a+b = chiều rộng của píc được 10% h đo ở 1/10 chiều cao của píc. Hình 2 Tính bất đối của pic w Thời gian, phút w = chiều rộng pic đường nền t o Tín hiệu đến detector 3 t R Tiêm Một cột được nhồi tốt sẽ có AF trong khoảng 0,9 -1,1.(xác địnhAF với píc của các chất chuẩn). Cũng có thể dùng hệ số đối xứng SF (symmetry factor): SF= w 1/20 / 2a trong đó w 1/20 được đo ở 1/20 chiều cao của pic Sự doãng píc (peak spreading) hay sự mở rộng dải là một hiện tượng đặc biệt quan trọng trong sắc ký và được nghiên cứu qua thuyết về đĩa và thuyết động học. Sự doãng píc là kết quả của sự di chuyển nhanh chậm khác nhau của các phân tử của cùng một chất trong khi đi qua cột sắc ký. Các píc ra muộn bao giờ cũng tù hơn. Một cột sắc kí tốt (hiệu lực cao) sẽ cho các píc nhọn (ít bị doãng). 1.2.3 - Hiệu lực của cột và đĩa lý thuyết: Hiệu lực của cột (column efficiency ) thường được đo bằng hai thông số : số đĩa lý thuyết N và chiều cao đĩa lý thuyết H (hay HETP). Ta có thể coi như cột sắc ký được chia thành N phần mỏng hay N lớp, ở mỗi lớp sự phân bố chất tan vào hai pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng mới (sắc ký là một quá trình động, thực ra pha động chảy liên tục và thời gian không đủ để thiết lập trạng thái cân bằng). Những phần mỏng (hay lớp)giả định này được gọi là đĩa lý thuyết (vì không có thực).Nếu cột sắc ký có chiều dài là L thì ta có biểu thức: H = L / N Trong đó N : là số đĩa lý thuyết của cột. L : chiều dài cột H : là chiều cao của đĩa lý thuyết. Cột có N lớn (hay có H nhỏ) là cột có hiệu lực cao. a. Chiều cao đĩa lý thuyết và sự doãng píc. Ta có thể xác định H và N dựa vào thực nghiệm. Hình 3 Pic sắc ký (a) so sánh với đường cong phân bố chuẩn Gauss (b) Dựa vào sắc đồ (xem hình 3a) ta có thể tính số đĩa lý thuyết N N = 16 2         b R W t trong đó W b = chiều rộng píc ở đáy píc. 4 t R Trục thời gian t R Trục thời gian Tín hiệu đo hay N = 5,54 2 2/1         W t R với W 1/2 = chiều rộng píc đo ở nửa chiều cao của pic. Và từ đó tính H : H = L/N Qua đây ta thấy rõ : khi cột có hiệu lực cao (H nhỏ N lớn) thì W b nhỏ (độ doãng píc nhỏ). b. Độ phân giải và các yếu tố ảnh hưởng (sự tách hai chất). Độ phân giải (Resolution) là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký. Xét trường hợp tách hai chất A và B (xem hình 4) Độ phân giải R S được định nghĩa như sau: R S = )(2/1 AB RARB WW tt + − hay R S = AB RARB WW tt ,2/1,2/1 )(18,1 + − trong đó W là chiều rộng pic ở đáy và W 1/2 là chiều rộng pic ở nửa chiều cao Hình 4 R S và sự tách 2 pic Với hai pic có độ lớn tương đương thì: R s = 0,75 hai pic không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều. R s = 1,0 hai pic tách khá tốt,còn xen phủ nhau 4% R s =1,5 hai pic tách gần hoàn toàn (chỉ xen phủ 0,3%) 1.2.4. Trường hợp tách nhiều chất, ảnh hưởng của thành phần dung môi và nhiệt độ. Khi có nhiều chất cần tách, trong sẵc ký lỏng thường có thể thay đổi thành phần dung môi để tách riêng được tất cả các chất trong hỗn hợp. Có thể phải thay đổi loại dung môi, cũng có thể chỉ cần thay đổi tỷ lệ giữa các thành phần. 1.2.4.1 Rửa giải đẳng dòng (isocratic elution, rửa giải thường) : Đó là cách dùng một hệ dung môi có thành xác định trong suốt quá trình phân tích. Hình 5 dưới đây cho sắc đồ của 4 lần phân tích 1 hỗn hợp 5 chất, mỗi lần dùng 1 pha động có thành phần khác. 5 Hình 5. ảnh hưởng của thành phần pha động (hỗn hợp methanol-nước) đến việc tách hỗn hợp 5 chất Hình 5 cho thấy việc thay đổi thành phần dung môi có thể ảnh hưởng đến quá trình tách mạnh mẽ như thế nào (thêm một ít nước vào Methanol 60% để có Methanol 50%: các pic 1,2,3,4,5 lần lượt được tách trên sắc đồ (c). Trong 4 hệ dung môi, hệ c (50% methanol) là thích hợp nhất vì các pic được tách tốt và chỉ cần 10 phút, hệ d tách rất tốt nhưng thời gian phân tích cần đến 20 phút. 1.2.4.2. Rửa giải gradient (gradient elution), chương trình hoá dung môi (solvent programming) Trong nhiều trường hợp, rửa giải đẳng dòng (dùng một hệ dung môi có thành phần không đổi) không giải được bài toán tách các chất. Trong những trường hợp này, người ta phải thay đổi thành phần dung môi ngay trong quá trình phân tích (chương trình hoá dung môi hay rửa giải gradient). Xem hình 6. Hình 7 Rửa giải gradient cho phép tách hỗn hợp 10 chất, hình (b) 6 1 2 3 4 5 7 6 8 Trên hình 7 ta thấy nếu rửa giải với một hệ dung môi có thành phần cố định (sắc đồ a) trong số 10 chất, thì 5 chất đầu không tách được (các pic quá gần nhau) trong khi 5 chất sau ra chậm và quá tù. Bằng phương pháp chương trình hoá dung môi (thành phần dung môi biến đổi dần trong quá trình chạy sắc ký, bắt đầu từ một hệ dung môi yếu hơn và kết thúc bằng một hệ mạnh hơn so với hệ dung môi dùng ở sắc đồ a) ta có sắc đồ b ở đó các pic được phân bố đều và tách rất tốt. Chương trình dung môi có thể chia làm nhiều đoạn với các kiểu biến đổi thành phần dung môi khác nhau. Để giải các bài toán tách nhiều chất với yêu cầu thời gian phân tích càng ngắn càng tốt, nếu không thể chọn một điều kiện sắc ký thích hợp, ta có thể dùng phương pháp biến đổi dần dần điều kiện sắc ký theo một chương trình nào đó. Trong sắc ký lỏng, hay dùng chương trình hoá dung môi (rửa giải gradient). Trong sắc ký khí, thường dùng phương pháp chương trình nhiệt độ. 2. Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: Hình 8 giới thiệu sơ đồ nguyên tắc chung cho các máy HPLC Hình 8 1-Bình chứa dung môi ; 2- Lọc dung môi 3- Bơm cao áp; 4- Bộ tiêm mẫu5- Cột sắc ký; 6- detectơ ; 7 - Máy ghi tín hiệu; 8 – Bình hứng. 2.1. Bình chứa dung môi và hệ thống sử lý dung môi: Cần lọc loại các hạt vẩn trong dung môi và đuổi khí hoà tan trong dung môi. Khí hoà tan có thể làm biến dạng các pic và sinh bọt khí làm nhiễu đường nền làm xuất hiện các pic lạ Có thể đuổi khí dung môi bằng nhiều cách: dùng siêu âm, đun và khuấy, sục khí trơ như heli, lọc dưới áp suất giảm Trong phương pháp rửa giải thường chỉ cần một bình dung môi .Trong phương pháp rửa giải gradient, thường dùng 2,3,4 bình chứa các dung môi khác 7 nhau và hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp của các loại dung môi trên được trộn với tỷ lệ biến đổi theo chương trình đã định. 2.2. Hệ thống bơm: Các đơn vị áp suất hay dùng trong HPLC: 1Pa = 1 Nm -2 ; 1 bar = 10 5 Pa; 1 psi = 0,4536 × 9,81 / 0,0254 2 = 6897 Pa; 1 at = 1 kg cm -2 = 1,01 bar Trong phân tích hay dùng loại bơm dòng không đổi (constant flow).Bơm kiểu piston là loại được dùng phổ biến, để khử xung người ta dùng bơm có hai piston bơm luân phiên. Loại sau được dùng phổ biến vì có nhiều ưu điểm. 2.3. Hệ tiêm mẫu: Phương pháp phổ biến là dùng van tiêm có vòng chứa mẫu (sample loop) với dung tích xác định và chính xác. Có thể thay đổi các vòng mẫu dung tích khác nhau: 5 đến 500 µl. Loại 20µl được dùng phổ biến. Tiêm bằng van tiêm có độ chính xác cao. Hình 9 Mô tả một loại van tiêm Van tiêm có hai vị trí của rô-to, vị trí (a) để nạp mẫu (load) vào vòng mẫu, vị trí (b) để tiêm mẫu (inject) bằng cách cho dung môi qua vòng mẫu để đưa mẫu lên cột. 2.4. Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao Cột bằng thuỷ tinh dùng ở áp suất thấp (dưới 50 at), được bọc trong một vỏ thép. Cột bằng thép không gỉ được dùng phổ biến. Cột phân tích thường dài 10-30 cm có đường kính trong 4-10 mm, hạt chất nhồi cỡ 5-10 µm. Với chất nhồi cỡ 3-5 µm có thể dùng các cột ngắn (3-10 cm) và nhỏ (1- 4,6 mm). Loại cột này có hiệu lực rất cao, có số đĩa lý thuyết lên đến 100.000 đĩa cho 1 m cột. Đường kính ngoài của cột thường là 1/4 inch. Cột điều chế có thể có kích thước lớn hơn cột phân tích nhiều lần. Cột bán điều chế nhỏ nhất(để tách lấy lượng nhỏ chất để đem phân tích) thường có đường kính trong 9-12 mm dài 50 cm hoặc hơn nữa. 8 Hình 9. Van tiêm mẫu: 1- Vòng chứa mẫu, 2- Bình dung môi và bơm, 3- Cột sắc ký 4- Nơi nạp mẫu vào vòng chứa mẫu 5- Phần mẫu còn thừa Chất nhồi cột thường là silicagel hoặc có bọc một lớp mỏng chất hữu cơ. Bên cạnh silicagel người ta còn dùng những hạt khác: nhôm oxyt, polyme xốp, chất trao đổi ion. 2.5. Detector: Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu được ghi trên sắc đồ. Các loại detector được dùng phổ biến là: - Detector đo chỉ số khúc xạ (RI) là detector vạn năng nhưng kém nhạy. - Detector huỳnh quang và detector điện hoá có độ nhạy độ chọn lọc cao hay dùng trong phân tích vết và phân tích y sinh học. - Detector tử ngoại-khả kiến (UV-Vis), còn gọi là detector hấp thụ quang, dùng đèn deuterium (đo ở 190-400 nm) và đèn wolfram (đo ở 380-600 nm), có thể làm việc ở bước sóng tùy chọn theo tính chất hấp thụ ánh sáng của chất muốn phát hiện. Loại này hiện nay được dùng nhiều nhất. - Detector chuỗi diod (mảng diod) DAD hay PDA là detector hấp thụ quang nhưng cho phép đo đồng thời tại nhiều bước sóng (đo phổ UV) trong quá trình săc ký, cho phép đánh giá độ tinh khiết của pic và góp phần xác định định tính thêm chắc chắn. - Detector khối phổ. Chát phân tích được ion hóa. Các ion mảnh/ion con (của phân tử) hay ion phân tử/ion mẹ được phát hiện. Detector này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Hệ thống sắc ký-khối phổ có thư viện phổ khối cho phép xác định nhiều chất chưa biết. 3. Các phương pháp sắc ký 3.1. Sắc ký phân bố (Partition chromatography) Gồm 2 loại: Phương pháp sắc ký lỏng-lỏng và sắc ký pha liên kết - Sắc ký lỏng-lỏng (LLC) pha tĩnh là chất lỏng được bao trên bề mặt của các hạt chất mang(support). Pha tĩnh thường được dung môi hoà tan và mất dần. Hiện tượng này làm cột mất dần hiệu lực (cột chảy máu). Ngày nay phương này ít được dùng. Một ví dụ: tách thuốc trừ sâu dùng β-β’oxydipropionitril (ODPN) làm pha tĩnh, isooctan làm pha động. - Sắc ký pha liên kết (BPC - Bonded phase chromatography). ở đây pha tĩnh được gắn hoấ học (liên kết) với chất mang (hạt silicagel) tạo nên hợp chất cơ- siloxan: CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 | | | | - Si - OH + Cl - Si – R → - Si – O – Si – R + HCl | | | | CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 Nhóm silanol của silicagel Dẫn chất Clorosilan Dẫn chất Siloxan - Nếu R là một nhóm ít phân cực như octyl (C 8 ), octadecyl (C 18 ) hay phenyl và dung môi phân cực như methanol, acetonitril thì có sắc ký pha đảo (pha ngược) 9 Ở đây pha tĩnh ít phân cực hơn pha động, trái với truyền thống của sắc ký trước đây là pha tĩnh phân cực hơn pha động. - Nếu R là nhóm khá phân cực như alkylamin - (CH 2 )n NH 2 hay alkylnitril - (CH 2) n CN và dung môi ít phân cực như hexan thì ta có sắc ký pha thuận (pha thường). Hiện nay sắc ký pha đảo được dùng hết sức rộng rãi vì nó cho kết quả tách tốt với rất nhiều đối tượng tách. Cơ chế tách trong sắc ký pha liên kết là khá phức tạp, còn nhiều điều tranh cãi. - Cách chọn pha: thường chọn pha tĩnh có tính phân cực giống các chất cần tách, và khác với pha động. - Thứ tự rửa giải: Trong sắc ký pha thuận các chất ít phân cực ra trước.Trong sắc ký pha đảo các chất phân cực ra trước rồi đến các chất ít và không phân cực ra sau. - Ứng dụng: sắc ký lỏng phân bố hiệu năng cao được dùng trong việc tách các chất thuộc nhiều lĩnh vực như: dược, sinh hóa, thực phẩm (Đường nhân tạo, chất chống oxy hoá, chất phụ gia, aflatoxin), độc chất (thuốc trừ sâu, diệt cỏ). Ghi chú: Các chất khá phân cực, các ion có khối lượng nhỏ khó bị lưu giữ trên pha tĩnh ít phân cực của sắc ký pha đảo. Các ion có thể tác dụng với các thuốc thử là ion đối (trái dấu) có trong pha động, tạo thành cặp ion trung hoà điện và có thể được lưu giữ trên pha tĩnh. Đó là cơ sở của phương pháp sắc ký pha đảo tạo cặp ion. 3.2. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng – rắn: LSC) Là phương pháp phát triển sớm nhất và được dùng phổ biến.Trong phương pháp này chất tan bị giữ trên bề mặt pha tĩnh tức là chất hấp phụ và bị dung môi đẩy ra (phản hấp phụ). Sắc ký hấp phụ cũng thường được gọi là sắc ký pha thuận (normal phase) -Các pha tĩnh và động: pha tĩnh là những bột mịn, xốp, có diện tích bề mặt riêng lớn (Spherisorb S 10W: 220 m 2 /g). Silicagel và nhôm oxyd là những chất được dùng nhiều trong sắc ký hấp phụ nhưng silicagel là chất được ưa dùng hơn cả. Ở đây các chất càng phân cực càng bị lưu giữ mạnh và ra chậm khi rửa giải. Về pha động bảng 1 dưới đây cho ta một dãy một số các dung môi với sức rửa giải tăng dần: Hexan, benzen, cloroform, aceton, butanol, methanol. Alcol metylic Dãy này xếp theo khả năng đẩy các chất ra khỏi chất hấp phụ. Có thể dùng hỗn hợp vào dung môi theo tỷ lệ thích hợp. 3.3. Sắc ký trao đổi ion: Là phương pháp sắc ký trong đó các nhựa trao đổi ion. - Nhựa trao đổi ion (ionit). Đó là những hợp chất cao phân tử có chứa nhóm chức có khả năng trao đổi ion (nhóm trao đổi) - Nhựa trao đổi cation (cationit) có 2 loại: Cationit acid mạnh có nhóm -SO 3 H và được ứng dụng rộng rãi, cationit acid yếu có nhóm - COOH. - Nhựa trao đổi anion (anionit) cũng có 2 loại: Anionit base mạnh có nhóm amoni bậc 4 - N(CH 3 ) 3 + OH - và anionit yếu có nhóm trao đổi là các amin bậc 2 hay 3 . 10 [...]... các pic ứng với các chất của hỗn hợp trên sắc đồ Sắc ký điều chế (Preparative chromatography): 13 Sắc ký điều chế thường được dùng trong sắc ký lỏng, để tách lấy một lượng chất tinh khiết đem dùng trong nghiên cứu phân tích (như xác định cáu trúc, tính chất lý hoá của một chất chưa biết) Để làm sắc ký điều chế , người ta tiêm một lượng mẫu đủ lớn Sau khi sắc ký, hứng lấy dịch rửa giải (phần ứng với... dung môi tinh khiết thích hợp hay trong dung môi pha động của phương pháp sắc ký Đem các dung dịch chuẩn chạy sắc ký, đo chiều cao hoặc diện tích pic rồi lập đường chuẩn tức là đường biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích hay chiều cao của pic đối với nồng độ Thông thường người ta sử dụng các đường chuẩn có dạng đường thẳng Sau đó đem chạy sắc ký dung dịch mẫu thử Dựa vào diện tích hay chiều cao của pic... CỦA SẮC KÝ TRONG PHÂN TÍCH Cần lưu ý là sắc ký chỉ là phương pháp tách, và là phương pháp tách tinh tế và rất có hi u quả, được dùng rất phổ biến để nghiên cứu các thành phần trong một hỗn hợp, đặc biệt là các đối tượng tự nhiên Sau khi được tách và đi ra khỏi cột, chúng được đưa tới những detector và được phát hi n, được định tính, định lượng dựa trên những đặc tính khác của chúng như độ hấp thụ, chiết... 30 acid amin trên một sắc đồ phân tích dịch đạm thuỷ phân Việc định tính một chất dựa vào vị trí của pic của chất đó trên sắc đồ (tức là dựa vào thời gian lưu t R) Nếu một pic của một chất chưa biết X trên sắc đồ trùng với vị trí của pic của chất chuẩn A trên sắc đồ trong cùng điều kiện sắc ký, thì có thể chất X đó là A Kết luận X là A chỉ chắc chắn khi tiến hành sắc ký với nhiều hệ pha tĩnh và động... tinh khiết của mẫu thử (không được có các pic ứng với các tạp chất) 4.2 Định lượng : Sắc ký là phương pháp rất thuận lợi để định lượng một chất trong hỗn hợp vì chất đó được tách khỏi các chất khác, và đồng thời được định lượng dựa vào việc đo chiều cao hay diện tích của pic Với các pic nhọn thì phương pháp đo chiều cao cho kết quả chính xác hơn Khi pic tù hay lệch thường đo diện tích tốt hơn Hi n... mẫu nhiều lần để có được lượng chất mong muốn Điều cần chú ý ở đây là lượng mẫu tiêm lớn sẽ gây khó khăn cho việc tách riêng các chất vì các pic lớn thường xen phủ lẫn nhau 4.3 Sự kết hợp Sắc ký- Khối phổ Việc phối hợp giữa sắc ký khí với khối phổ (GC-MS) và giữa sắc ký lỏng với khối phổ (LC-MS) là một tiến bộ lớn trong kỹ thuật phân tích, cho các kết quả phân tích với độ nhạy và độ chính xác cao Các... pháp này được dung để tách các ion vô cơ và hữu cơ (1) (2) 3.4 Sắc ký lỏng trên gel (size exclusion; sk loại theo cỡ) Sắc ký loại theo cỡ (size exclusion chromatogrphy) là một phương pháp mới phát triển và được ứng dụng chủ yếu cho các chất có phân tử lượng lớn - Chất nhồi và các pha: chất nhồi ở đây là các hạt gel - Chất nhồi cho sắc ký loại theo cỡ là những hạt xốp của silicagel hay polime có kích... hay chiều cao của pic chất thử trên sắc đồ, đối chiếu với đường chuẩn có thể tìm được nồng độ chất thử Không được phép ngoại suy (extrapolation), nghĩa là nồng độ dung dịch thử đem chạy sắc ký không được nằm ngoài khoảng các dung dịch chuẩn đem sắc ký Trong phương pháp trên, chất chuẩn được gọi là chuẩn ngoại (external standard) vì nó không được đưa vào trong mẫu thử khi phân tích 4.2.2 Phương pháp đường... sa bẫy, rất khó ra Khi rửa giải các phân tử sẽ lần lượt ra theo cỡ từ lớn đến nhỏ Các gel ưa nước được dùng với pha động và dung dịch nước và phương pháp được gọi là sắc ký lọc trên gel (gel filtration chromatography) Nếu các gel kỵ nước thì dùng pha động là các dung môi hữu cơ không phân cực và phương pháp được gọi là sắc ký thẩm thấu trên gel (gel permeation chromatography) Có nhiều loại gel với các... addition) Khi cần định lượng một chất trong một môi trường phức tạp, còn gọi là có nền (matrix) phức tạp, như định lượng một chất trong huyết thanh, trong một dịch chiết cây cỏ, trong thực phẩm, người ta thường dùng phương pháp đường chuẩn thêm: thêm những lượng chất chuẩn khác nhau vào ngay trong mẫu thử rồi chạy sắc ký mẫu thử không thêm và các mẫu thử có thêm chuẩn Vẽ đường chuẩn diện tích (hay chiều cao) . SẮC KÝ LỎNG HI ỆU NĂNG CAO HPLC PGS Phạm gia Huệ Sắc ký lỏng hi u năng cao (HPLC-High performance liquid chromatography) còn được gọi là sắc ký lỏng cao áp, hoặc chỉ đơn giản gọi là sắc. chậm. Các phương pháp sắc ký khác: sắc ký ái lực, sắc ký điện… Ghi chú: Trong sắc ký khí, chủ yếu là sắc ký phân bố và sắc ký hấp phụ 1.2. Cơ sở lý thuyết sắc ký (Giới thiệu sơ lược): Có hai yếu. phương pháp sắc ký lỏng hi u năng cao ra đời. UPLC (Ultra performance liquid chromatography) hay sắc ký lỏng siêu hi u năng với hạt chất nhồi cột có đường kính dưới 2 µm, có hi u suất tách cao hơn