7

-29- Kết quả & Bàn luận 3. KẾT QUẢ & BÀN LUẬN 3.1 Đa dạng di truyền thông đỏ Lâm Đồng qua khảo sát bằng kỹ thuật RAPD 3.1.1 Kết quả đa hình thu được sau phản ứng RAPD-PCR 3.1.1.1 Sàng lọc mồi Sử dụng 9 mẫu ngẫu nhiên gồm BD1, BD2, BD3, TQ, XT, NV1, NV2, NV3, NV4 cho phản ứng RAPD-PCR với 27 mồi 10-mer oligonucleotide để sàng lọc các mồi hữu hiệu dùng cho nghiên cứu. Một số mồi có sẵn trong phòng thí nghiệm và số khác được tham khảo từ tác giả Collins [26]. Hầu hết 27 mồi đều cho kết quả đa hình trên 9 mẫu. Tuy nhiên, chỉ có 08 mồi: OPA-07, OPA-12, OPC-06, OPN-09, OPP-04, OPX-04, OPX-14, OPX-15 cho kết quả với các băng phân biệt rõ, riêng biệt, nên được chọn để sử dụng cho phản ứng RAPD-PCR trên toàn bộ 50 mẫu nghiên cứu. 3.1.1.2 Kết quả khuyếch đại DNA với mồi ngẫu nhiên Để phát hiện sự đa hình, 08 mồi sau sàng lọc đã được sử dụng trong phản ứng PCR trên DNA genome thu được từ các mẫu lá của 50 cây thông đỏ. Sản phẩm khuếch đại tạo ra từ những mồi này được phân tách bằng điện di 130 phút, 90 voltage trên gel polyacrylamide 10%, nhuộm ethidium bromide và hiển thị dưới đèn UV. Kết quả tổng hợp trong Bảng 3.1 cho thấy tổng số băng khuyếch đại thu được sau phản ứng PCR là 66. Như vậy, trung bình mỗi mồi khuyếch đại được 8.25 băng. Số băng khuyếch đại được từ các mồi dao động trong khoảng 7-11 băng. Có 63 trong số 66 băng là đa hình, chiếm tỉ lệ 95.31%. Tỉ lệ băng đa hình dao động trong khoảng 75% - 100% giữa các mồi. -30- Kết quả & Bàn luận Tuy tỉ lệ băng đa hình cao, nhưng không mồi nào có thể được sử dụng làm marker để nhận diện các mẫu khác nhau từ các quần thể khác nhau. Ngoại trừ mồi OPA-07 có ba băng chỉ xuất hiện duy nhất một lần, đó là băng 490 bp trên mẫu NV25 (số 39), băng 400 bp trên mẫu TQ (số 13) và băng 280 bp trên mẫu HT7 (số 07). Các băng này có thể sử dụng làm marker để phân biệt ba mẫu trên với các mẫu còn lại. Bảng 3.1: Kết quả RAPD của 50 mẫu thông đỏ với tám mồi chọn lọc. Tên mồi Trình tự Tổng Số băng Tỉ lệ băng đa OPA-7 5’-GAAACGGGTG-3’ 10 10 100 OPA-12 5’-TCGGCGATAG-3’ 7 7 100 OPC-6 5’-GAACGGACTC-3’ 7 7 100 OPN-9 5’-TGCCGG CTTG-3’ 8 8 100 OPP-4 5’-GTGTCTCAGG-3’ 8 7 87.5 OPX-4 5’-CCGCTACCGA-3’ 11 11 100 OPX-14 5’-ACAGGTGCTG-3’ 7 7 100 OPX-15 5’-CAGACAAGCC-3’ 8 6 75 Tổng cộng 66 63 Trung bình 8.25 7.88 95.31 -31- Kết quả & Bàn luận Hình 3.1: Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPA-07 Hình 3.2: Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPA-12 -32- Kết quả & Bàn luận Hình 3.3: Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPC-06 Hình 3.4: Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPN-09 -33- Kết quả & Bàn luận Hình 3.5: Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPP-04 Hình 3.6: Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPX-04 -34- Kết quả & Bàn luận Hình 3.7: Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPX-14 Hình 3.8: Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPX-15 -35- Kết quả & Bàn luận 3.1.2 Tương quan di truyền giữa các mẫu khảo sát dựa trên hệ số tương ứng đơn giản (SM coefficient) Tương quan di truyền giữa các mẫu được tính toán bằng phần mềm NTSYS-pc 2.1 dựa trên hệ số tương ứng đơn giản SM (Simple matching coefficient). Kết quả Bảng B, phần phụ lục, cho thấy 50 mẫu khảo sát tạo thành 1225 cặp, với hệ số tương quan di truyền từng cặp nằm trong khoảng 44% – 92%. Trung vị (median) tính được là 70%. 615/1225 cặp có hệ số tương quan thấp hơn 70% và 610/1225 cặp có hệ số tương quan từ 70% trở lên. Hệ số tương quan di truyền xuất hiện với tần suất nhiều nhất (mode) là 68%, với 100/1225 cặp. Cặp mẫu khác nhau nhiều nhất là HT7 & NV16 (44%) và cặp tương đồng nhiều nhất là NV21 và NV22 (92%). HT5 và NV16 là hai mẫu có hệ số tương quan di truyền thấp nhất (khoảng cách di truyền xa nhất) so với toàn bộ mẫu khảo sát. HT5 tạo ra các hệ số tương quan di truyền trong khoảng 45% - 68% với 49 mẫu còn lại. NV16 tạo ra các hệ số tương quan di truyền trong khoảng 44% - 70%. Ba mẫu từ Bidoup tạo ra 3 hệ số tương quan di truyền 85%, 73% và 79% tương ứng giữa từng cặp BD1 & BD2, BD1 & BD3 và BD2 & BD3. Điều đó cho thấy có nhiều khác biệt giữa BD3 khi so với BD1&BD2. 08 mẫu từ Hồ Tiên tạo ra 28 hệ số tương quan di truyền trong khoảng 47% - 86%, xa nhau nhất là HT5 & HT7 (47%), gần nhất là hai mẫu HT3 & HT4 (86%). HT5 là mẫu có tương quan di truyền thấp nhất với các mẫu còn lại, với hệ số tương quan di truyền trung bình chỉ ở mức 56%. 36 mẫu từ Núi Voi có hệ số tương quan di truyền trong khoảng 50% - 92%, xa nhau nhất (50%) là hai cặp mẫu NV2 & NV16, NV14 & NV16, và gần nhau nhất là cặp mẫu NV21 & NV22 (92%). Mẫu TQ được xem là T. chinensis có hệ số tương quan di truyền với các mẫu còn lại từ Lâm Đồng ở mức trung bình, trong khoảng 52% - 67%. -36- Kết quả & Bàn luận Kết quả phân tích của NTSYS bên trên cho thấy hầu hết các mẫu khảo sát khá gần nhau về khoảng cách di truyền. Điều này cũng hoàn toàn hợp lý vì đa số các mẫu đều được thu thập từ các vùng rừng núi của Lâm Đồng – nơi mà theo ghi nhận của các nhà Lâm học nước ta là chỉ có sự tồn tại của một loài thông đỏ, thông đỏ nam – Taxus wallichiana Zucc. Thêm vào đó, thông đỏ là cây gỗ lâu năm, thụ phấn nhờ gió, hạt được phát tán nhờ động vật, nên về lý thuyết chúng sẽ không có tính đa dạng cao về mặt di truyền. Tính đa dạng di truyền thấp cũng được các nhà khoa học trên thế giới công bố đối với các quần thể Taxus khác như T. wallichiana vùng Đông Bắc Ấn Độ [56], T. wallichiana khu vực phía tây Himalaya [45], T. fuana vùng Pakistan [58], khi sử dụng các marker phân tử RAPDs và AFLP. 3.1.3 Phân nhóm di truyền các mẫu thông đỏ khảo sát Ma trận hệ số tương quan di truyền được dùng làm dữ liệu đầu vào để xếp nhóm cho 50 mẫu khảo sát, sử dụng phần mềm NTSYS-pc 2.1, theo phương pháp SAHN. Kết quả thu được ở Bảng 3.2 và Hình 3.9 cho thấy nếu xét ở mức độ 60% tương quan di truyền thì toàn bộ mẫu khảo sát tạo ra một nhóm lớn với 47 mẫu, một nhóm nhỏ với hai mẫu TQ & NV16 và 1 mẫu đơn lẻ là HT5. Xét ở mức độ 68% tương quan di truyền thì 47 mẫu trong cùng một nhóm ở trên sẽ phân thành 2 nhóm A và B:  Nhóm A gồm 5 mẫu: HT6, NT, NV9, NV5, NV18  Nhóm B gồm toàn bộ 42 mẫu còn lại. Tuy nhiên, ở mức 69% tương quan di truyền thì nhóm B lại được phân thành hai nhóm nhỏ B1 và B2: o B1 là nhóm của 6 mẫu HT còn lại của quần thể Hồ Tiên. o B2 gồm 36 mẫu còn lại và tiếp tục phân nhánh thành 2 tiểu nhóm nhỏ ở mức 69.5%. Tiểu nhóm B2a chỉ chứa 2 mẫu NV14 và NV15. Tiểu nhóm B2b bao gồm 34 mẫu còn lại và chia thành 2 phân nhóm nhỏ B2b1 và B2b2 khi xét ở mức khoảng 70.5% tương quan di truyền. -37- Kết quả & Bàn luận Bảng 3.2: Sự phân nhóm di truyền của 50 mẫu khảo sát. Phân nhóm Nhóm Nhóm nhỏ Tiểu nhóm Tiểu nhóm nhỏ Mẫu I HT5 II TQ, NV16 A HT6, NT, NV9, NV5, NV18 B1 HT1, HT2, HT8, HT3, HT4, HT7 B2a NV14, NV15 B2b1 NV6, NV8, NV7, NV11, NV10, NV12, NV13 III B B2 B2b B2b2 BD1, BD2, XT, BD3, NV1, NV2, NV34, NV4, NV27, NV35, NV32, NV33, NV19, NV21, NV22, NV20, NV23, NV24, NV26, NV25, NV29, NV17, NV36, NV3, NV30, NV28, NV31 Tuy các mẫu khảo sát có tương quan di truyền cao, nhưng vẫn có sự phân nhóm giữa các mẫu được thu thập giữa các vùng khác nhau. Cụ thể là đa số các mẫu từ Hồ Tiên đều thuộc cùng 1 nhóm trong khi đa số các mẫu thu thập từ Núi Voi cũng tập hợp thành một nhóm khác. Kết quả này thể hiện khoảng cách di truyền giữa các mẫu trong cùng một vùng nhỏ hơn khoảng cách di truyền giữa các vùng địa lý với nhau. Kết quả này cho thấy có sự tương quan giữa khoảng cách địa lý và khoảng cách di truyền giữa các cá thể thông đỏ Lâm Đồng. -38- Kết quả & Bàn luận Coefficient 0.56 0.60 0.64 0.68 0.72 0.76 0.80 0.84 0.88 0.92 HT1 HT2 HT8 HT3 HT4 HT7 BD1 BD2 XT BD3 NV1 NV2 NV34 NV4 NV27 NV35 NV32 NV33 NV19 NV21 NV22 NV20 NV23 NV24 NV26 NV25 NV29 NV17 NV36 NV3 NV30 NV28 NV31 NV6 NV8 NV7 NV11 NV10 NV12 NV13 NV14 NV15 HT6 NT NV9 NV5 NV18 TQ NV16 HT5 Hình 3.9: Sơ đồ hình cây thể hiện mối tương quan về di truyền giữa 50 mẫu thông đỏ trên cơ sở kiểu gen III II I A B B 1 B 2 B 2a B 2b B 2b1 B 2b2 [...]... GATTTTCTTTTGTCTTTTTAGTTGACC-TGAGCTCAGGCTGTGCTCTAGGATGAT GATTTTCTTTTGTCTTTTTAGTTGACC-TGAGCTCAGGCTGGGCTCTAGGATGAT GATTTTCTTTTGTCTTTTTAGTTGACCCTGAGCTCAGGCTGTGCTCTAGGATGAT *************************** ********** * ** ********** 76 9 77 1 77 0 77 1 77 0 77 0 77 0 77 0 76 9 77 0 77 2 Hình 3.12: Sự sắp xếp chuỗi nucleotide vùng trình tự trnL-trnF TQ NV14 NV21 NV32 HT4 NV13 XT NT NV2 HT5 BD3 0.01 Hình 3.13: Mối tương quan vùng trình tự trnL-trnF của các cá thể... 0.3 176 ± 0.0292 0.1298 ± 0.0038 0.40 87 0.5914 0.3454 OPC-06 0.3692 ± 0.0253 0. 175 7 ± 0.0046 0. 475 9 0.5240 0.4543 OPA- 07 0.2592 ± 0.0258 0. 079 7 ± 0.0045 0.3 075 0.6925 0.2220 OPA-12 0.2583 ± 0.0292 0.1108 ± 0.0061 0.4290 0. 571 1 0. 375 6 OPP-04 0.1824 ± 0.0288 0.0884 ± 0.0028 0.4846 0.5155 0. 470 0 OPN-09 0.38 17 ± 0.0 172 0.1596 ± 0.0024 0.4181 0.5820 0.3591 OPX-14 0.2863 ± 0.0416 0.1205 ± 0.0053 0.4209 0. 578 9... AATTGATAATGGTAACTTACCAATCCAAAAGTATAATTTAAAAAGGGAAATAAAAAAA-G AATTGATAATGGTAACTCAC-AATCCAAAAGTATAAATTAAAAAGGGAAATAAAAAAAAG ***************** ** *************** ********************* * 71 5 71 7 71 6 71 7 71 6 71 6 71 6 71 6 71 5 71 6 71 7 NV13 XT NV32 HT4 NV14 NV21 NV2 NT BD3 HT5 TQ GATTTTCTTTTGTCTTTTTAGTTGACC-TGAGCTCAGGTTCTGCGCTAGGATGAT GATTTTCTTTTGTCTTTTTAGTTGACC-TGAGCTCAGGTTCTGCGCTAGGATGAT GATTTTCTTTTGTCTTTTTAGTTGACC-TGAGCTCAGGTTCTGCGCTAGGATGAT... AAATCCGTTGGTTTTATAAACCGTGAGGGTTCAAGTCCCTCTATCCCCAGGTGTATTTCC AAATCCGTTGGTTTTATAAACCGTGAGGGTTCAAGTCCCTCTATCCCCAGGTGTATTTCC ****************************************************** *** 478 479 479 480 479 479 479 479 478 479 479 NV13 XT NV32 HT4 NV14 NV21 NV2 NT BD3 HT5 TQ GAATTAAAGAAAGATCAAATATTATTACTCTTGACAATTTTATAAGCAATCC-AGAATAT GAATTAAAGAAAGATCAAATATTATTACTCTTGACAATTTTATAAGCAATCCCAGAATAT GAATTAAAGAAAGATCAAATATTATTACTCTTGACAATTTTATAAGCAATCC-AGAATAT... là 0.2930 (±0.0300), dao động trong khoảng 0.1824 (OPP-04) đến 0.38 17 (OPN-09) giữa các mồi Hệ số đa dạng di truyền tính theo quần thể là 0.12 07 (±0.0048), dao động trong khoảng 0. 079 7 (OPA- 07) đến 0. 175 7 (OPC-06) giữa các mồi Biến động di truyền bên trong quần thể tính được là Hs/Ht = 41.99%, dao động trong khoảng từ 30 .75 % (OPA- 07) đến 48.46% (OPP-04) giữa các mồi Trong khi đó, mức độ khác biệt di... AGATATAACATTTG-TGTATGTATAATTGTATTATACATACAATTTAAATTTATAATAGA AGATATAACATTTGATAGATGTATAATTGTATTATACATACAATTTAAATTTATAATAGA ************** * ****************************************** 656 658 6 57 658 6 57 6 57 6 57 6 57 656 6 57 658 NV13 XT NV32 HT4 NV14 NV21 NV2 NT BD3 HT5 TQ AATTGATAATGGTAACTTACCAATCCAAAAGTATAATTTAAAAAGGGAAATAAAAAAA-G AATTGATAATGGTAACTTACCAATCCAAAAGTATAATTTAAAAAGGGAAATAAAAAAA-G AATTGATAATGGTAACTTACCAATCCAAAAGTATAATTTAAAAAGGGAAATAAAAAAA-G... chinensis 1319 100% 0.0 97% BD3 T wallichiana var mairei 1330 99% 0.0 98% HT5 T wallichiana var mairei 1400 100% 0.0 99% NT T wallichiana var mairei 1411 100% 0.0 99% NV2 T wallichiana var mairei 1400 100% 0.0 99% NV13 T wallichiana var mairei 1415 100% 0.0 99% NV14 T wallichiana var mairei 14 17 100% 0.0 99% NV21 T wallichiana var mairei 14 17 100% 0.0 99% HT4 T wallichiana var mairei 14 17 100% 0.0 99% XT... Trong khi đó, mức độ khác biệt di truyền giữa các quần thể là Gst = 58.81%, dao động trong khoảng từ 51.55% (OPP-04) đến 69.25% (OPA- 07) giữa các mồi Hệ số dòng chảy gen trung bình cho toàn bộ mẫu trên 8 mồi là 0.3500, dao động trong khoảng từ 0.2220 (OPA- 07) đến 0. 470 0 (OPP-04) giữa các mồi Với Gst > Hs/Ht, sự đa dạng di truyền tính được giữa các quần thể thông đỏ Lâm Đồng lớn hơn sự đa dạng di truyền... GAATTAAAGAAAGATCAAATATTATTACTCTTGACAATTTTATAAGCAATCC-AGAATAT GAATTAAAGAAAGATCAAATGTTATTACTCTTGTCAACTTTCTAAGCACTCC-AGAATAT ******************** ************ *** *** ****** *** ******* 5 37 539 538 539 538 538 538 538 5 37 538 538 NV13 XT NV32 HT4 NV14 NV21 NV2 NT BD3 HT5 TQ AGAGCTATATTCCCATAAATTTAGAAAGGTTGATCGTAAGATCAACTCATACATTTTGTC AGAGCTATATTCCCATAAATTTAGAAAGGTTGATCGTAAGATCAACTCATACATTTTGTC AGAGCTATATTCCCATAAATTTAGAAAGGTTGATCGTAAGATCAACTCATACATTTTGTC... AGAGCTATATTCCCATAAATTTAGAAAGGTTGATCGTAAGATCAACTCATACATTTTGTC AGAGTTATATTCCCATAAATTTAGAAAGGTTGATCGTAAGATCAAATCTTTCATTTTGTC **** **************************************** ** * ********* 5 97 599 598 599 598 598 598 598 5 97 598 598 Kết quả & Bàn luận -44NV13 XT NV32 HT4 NV14 NV21 NV2 NT BD3 HT5 TQ AGATATAACATTTG-TGTATGTATAATTGTATTATACATACAATTTAAATTTATAATAGA AGATATAACATTTG-TGTATGTATAATTGTATTATACATACAATTTAAATTTATAATAGA . đến 0.38 17 (OPN-09) giữa các mồi. Hệ số đa dạng di truyền tính theo quần thể là 0.12 07 (±0.0048), dao động trong khoảng 0. 079 7 (OPA- 07) đến 0. 175 7 (OPC-06). OPX-04 0.3 176 ± 0.0292 0.1298 ± 0.0038 0.40 87 0.5914 0.3454 OPC-06 0.3692 ± 0.0253 0. 175 7 ± 0.0046 0. 475 9 0.5240 0.4543 OPA- 07 0.2592 ±