5

-3- Tổng quan 1. TỔNG QUAN 1.1 Thông đỏ Lâm Đồng - Taxus wallichiana Zucc. (Himalayan Yew) 1.1.1 Đặc điểm sinh học 1.1.1.1 Đặc điểm hình thái [1] Thông đỏ là thực vật hạt trần, thuộc loại gỗ thường xanh, cao đến 20m. Thân có vỏ màu hồng xám, phân nhiều cành mảnh, khi non màu lục. Lá mọc so le, thường xếp 2 dãy như 1 lá kép. Lá có hình dải rất hẹp, dáng cong, dài 2,5 - 3,5 cm, rộng 2 - 3 mm, gốc thuôn, đầu nhọn, mặt trên lõm như lòng thuyền, mặt dưới có hai dãy lổ khí. Thông đỏ có nón đực và nón cái khác gốc, mọc ở kẽ lá. Hột thông đỏ hình trứng, vỏ cứng, được bao bọc bởi áo màu đỏ để hở đầu. Hình 1.1 Cành lá và hột thông đỏ Lâm Đồng. 1.1.1.2 Đặc điểm tái sinh [22] Thông đỏ có mùa ra hoa từ tháng 8 - 12 và đến tháng 6,7 năm sau thì tạo hột và hột chín từ tháng 9 đến tháng 12, đôi khi hột còn tồn tại đến tháng 2,3 năm sau. Hột thường chín rộ trong khoảng một tháng. Hột chín mọng có màu đỏ rực rỡ, thịt mềm nhiều nước, hấp dẫn nhiều loại côn trùng và động vật, nhất là các loài chim, sóc, khỉ, . Khi chín, hột rụng xung quanh gốc cây mẹ một khoảng cách không xa lắm 5 – 30 m và nẩy mầm khi có điều kiện thuận lợi. -4- Tổng quan 1.1.1.3 Điều kiện sinh thái [22] Thông đỏ Lâm Đồng phân bố ở nơi có biên độ nhiệt độ bình quân từ 19,1 o C đến 22,3 o C và lượng mưa bình quân khoảng 1600 – 1800 mm/năm với mùa mưa bắt đầu từ tháng 4 đến tháng 10 và mùa khô từ tháng 11 đến tháng 3 năm sau. Ẩm độ không khí bình quân/tháng dao động từ 71 đến 86%. Tổng số giờ nắng bình quân khoảng 2.328 giờ/năm. Về thổ nhưỡng, các quần thể thông đỏ thường mọc trên các loại đất nâu vàng phát triển trên đá đaxit, đất vàng đỏ trên đá granit hay phiến thạch hoặc đất nâu đỏ trên nền Bazan. 1.1.2 Phân bố Taxus wallichiana Zucc. (T. wallichiana Zucc.) phân bố hẹp, ở các dãy phía đông Himalaya đến Tây nam Trung Quốc (Đông Nam Tibet, Sichuan, Yunnan), Đông và Trung Nepal, Tây bắc Ấn Độ (Assam, Manipur, Khasia Hills, Tây Bengal), Myanmar, Bhutan [55], Đài Loan, Indonesia, Philippines, Việt Nam [33]. Tại Lâm Đồng, thông đỏ được tìm thấy ở một số địa điểm sau:  Thành phố Đà Lạt: thông đỏ phân bố ở Xuân Trường, cao độ 1428 – 1454 m, độ dốc 20 - 45°, nằm cách trung tâm thành phố 17 km về hướng Đông, giáp huyện Đơn Dương. Thông đỏ còn được tìm thấy tại khu vực Bang Bi cách trung tâm thành phố 5 km về hướng Tây-Bắc ở độ cao khoảng 1.450 m, độ dốc > 25°.  Huyện Lạc Dương thông đỏ phân bố ở khu vực Cổng Trời, Lán Tranh và Klong Lanh thuộc các tiểu khu 101, 102, 103, 124, 125 (Ban Quản lý rừng đặc dụng Bi Đoup- Núi Bà), có cao độ từ 1.508 – 1.713 m, độ dốc > 25°, cách Đà Lạt khoảng 35 km.  Huyện Đức Trọng thông đỏ phân bố ở khu vực Núi Voi - Cần Reo-Tuyền lâm thuộc tiểu khu 277, 269 (Ban Quản lý rừng Hiệp Thạnh- Huyện Đức Trọng), có cao độ từ 1298 – 1402 m, độ dốc 15 –25°, cách Đà Lạt khoảng 20 km và cách quốc lộ 19 khoảng 5 km về hướng Tây-Nam. -5- Tổng quan  Huyện Đơn Dương thông đỏ phân bố ở khu vực Hồ Tiên thuộc tiểu khu 324, 325 (Ban Quản lý rừng Công An Huyện Đơn Dương), có cao độ 1.450 – 1.520 m, độ dốc >15 o , cách Đà Lạt 39 km về hướng Đông nam và cách khu vực Núi Voi, Cần Reo khoảng 5 km đường chim bay. Hình 1.2: Sơ đồ phân bố của quần thể thông đỏ tại Lâm Đồng. 1.1.3 Hệ thống phân loại [46]  Ngành: Pinophyta o Lớp: Pinopsida  Bộ: Pinales  Họ: Taxaceae  Chi: Taxus  Loài: Taxus wallichiana Zucc. -6- Tổng quan Taxus có bốn loài ở Bắc Mỹ (Taxus brevifolia Nutt., Taxus canadensis Willd., Taxus floridana Nutt., Taxus globosa Schlecht.), một loài tại Châu Âu và Đông Á (Taxus baccata L.) và rất nhiều loài khác phân bố dọc Đông và Đông Nam Á. Việc phân loại các loài Taxus ở khu vực Đông và Đông Nam Á khá phức tạp và vẫn chưa thống nhất. Theo De Laubenfels (1988), ngoại trừ Taxus cuspidata Siebold & Zucc. thì tất cả các thông đỏ có ở Trung Quốc và Đông Dương đều là Taxus sumatrana (Miq.) de Laub. Tuy nhiên, hệ thống phân loại này không nhận được sự ủng hộ của các tác giả khác. Các tác giả Li và Fu (1997) đã phân loại các mẫu thông đỏ mà họ thu thập được từ Xizang (Tibet) và từ khu vực trung Nepal về hướng tây, đến Pakistan và Afghanistan là Taxus fuana Nan Li & R. R. Mill. Trong một nghiên cứu khác sau đó với các mẫu thông đỏ từ Trung Quốc, nhóm tác giả Fu, Li và Mill (1999) đã xác định thêm loài T. wallichiana Zucc. với ba thứ khác nhau là T. wallichiana var. wallichiana, T. wallichiana var. chinensis (Pilg.) Florin and T. wallichiana var. mairei (Lemée and H. Lév.) L. K. Fu & Nan Li. 1.1.4 Giá trị sử dụng Các loài thông đỏ nói chung đều có giá trị kinh tế cao. Gỗ thông đỏ là gỗ quý, thường dùng làm đồ gỗ gia dụng. Trong dân gian, các bộ tộc thiểu số người Mỹ sử dụng gỗ của cây thông đỏ làm cung, nêm, dùi cui, chèo, lưỡi cày, rìu, cán lao, giáo, khung trống, điêu khắc và nhiều công cụ hữu ích khác [22]. Tại Pakistan, người ta còn dùng gỗ thông đỏ để đóng quan tài vì loại gỗ này có khả năng chống lại sự thối rữa [67]. Trong y học dân gian Trung Quốc, thông đỏ được coi là có tác dụng tiêu tích, thông kinh mạch, giảm đau, hạ sốt. Trong y học cổ truyền Ấn Độ, cao lá khô và cao vỏ thông đỏ được dùng trị hen. Ở Thổ Nhĩ Kỳ, thông đỏ được dân gian dùng để chữa bệnh tim [1]. -7- Tổng quan Tuy thông đỏ đã được sử dụng từ rất lâu trên thế giới, nhưng mãi cho đến những năm 1960, khi hợp chất Taxol chiết xuất từ vỏ cây Pacific yew (Taxus brevifolia) cho thấy có khả năng gây độc tế bào, thì chúng mới được các nhà khoa học, đặc biệt là trong lĩnh vực dược phẩm, quan tâm. Ngày nay, Taxol từ thông đỏ được biết đến như một hoạt chất có khả năng chống nhiều loại ung thư như ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư gan, phổi và máu [44]. Tuy nhu cầu cao, nhưng hiệu suất chiết xuất Taxol lại rất thấp. Để thu được 1kg Taxol, người ta phải sử dụng đến 10,000 kg vỏ thông đỏ Taxus brevifolia; và để có được một liều thuốc taxol, người ta phải sử dụng toàn bộ vỏ của 6 cây này [58]. Điều này rất dễ dẫn đến sự khai thác quá mức nguồn tài nguyên thông đỏ trên thế giới. Thực tế đó thúc đẩy các nhà khoa học đi tìm giải pháp thay thế cho việc sử dụng taxol nguyên thủy từ thông đỏ. Ngày nay, khoa học đã chứng minh taxol có thể được bán tổng hợp từ các tiền chất taxoid. Do đó, bên cạnh Taxol, giờ đây giới khoa học còn tập trung nghiên cứu nhằm chiết xuất ra những tiền chất trong con đường sinh tổng hợp Taxol như baccatin III, 10-acetylbaccatin III (10-DAB)… Tại Việt Nam, Taxol và tiền chất 10-DAB là hai hợp chất được nghiên cứu chiết xuất nhiều nhất từ lá Taxus wallichiana Zucc. với hàm lượng trong khoảng dao động từ 0.007% - 0.013% [22] và có thể cao đến 0.02% - 0.03% [9]. 1.1.5 Vấn đề bảo tồn và nhân giống thông đỏ tại Việt Nam Thông đỏ có giá trị sử dụng cao, nhu cầu lớn, nhưng khả năng tái sinh tự nhiên thì rất thấp, do đó chúng được xếp vào nhóm có nguy cơ tuyệt chủng “CR C2a” ở nước ta. Theo khảo sát của nhóm tác giả Lê Đình Khả (2006) thì thông đỏ Lâm Đồng chỉ còn khoảng 200 cây [4]. Thông đỏ Lâm Đồng, Taxus wallichiana Zucc., còn được ghi rõ trong nghị định 32/2006/NĐ-CP của chính phủ là “Thực vật rừng nguy cấp, quý hiếm, cấm khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại”. Mặc dù quý hiếm và có nguy cơ tuyệt chủng, nhưng loài thực vật này chỉ được ghi nhận và bảo tồn tại một nơi duy nhất là vườn quốc gia Bidoup. Trong khi đó, những -8- Tổng quan quần thể thông đỏ khác như Núi Voi thì vẫn chưa được quan tâm bảo tồn đúng mức và đang phải chịu cảnh lâm tặc hoành hành. Tuy nhiên, cũng như thế giới, nhiều nhà khoa học Việt Nam đã và đang quan tâm rất nhiều đến các quần thể thông đỏ trong nước. Nhiều công trình khoa học tập trung nghiên cứu vấn đề tái sinh, nhân giống nhằm bảo tồn và tạo nguồn nguyên liệu ly trích taxol và 10-DAB cho ngành dược phẩm. Tại trung tâm nghiên cứu lâm sinh Lâm Đồng, Trung tâm trồng và phát triển cây thuốc Đà Lạt – Vimedimex, các nhà khoa học bước đầu đã thành công trong việc nhân giống thông đỏ bằng kỹ thuật giâm hom. Ngoài ra, những điều kiện về sinh thái, dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của thông đỏ cũng như thời gian thu hái thích hợp cũng được quan tâm nghiên cứu tại các trung tâm trên. Hình 1.3: Thông đỏ được nhân giống bằng kỹ thuật giâm hom tại Vimedimex Viện sinh học nhiệt đới với nhóm nghiên cứu của PGS.TS Trần Văn Minh, Phân viện sinh học Đà Lạt với nhóm nghiên cứu của TS Dương Tấn Nhật, Khoa Sinh – -9- Tổng quan Trường đại học KHTN Tp.HCM với nhóm nghiên cứu của PGS. TS Bùi Trang Việt là đại diện cho một số nơi đang nghiên cứu về những vấn đề nhân giống in-vitro cây thông đỏ Lâm Đồng. Bên cạnh việc tập trung nghiên cứu các vấn đề liên quan đến tái sinh, nhân giống, giới khoa học trong nước cũng nghiên cứu song song các vấn đề liên quan đến sự định lượng, ly trích taxol và 10-DAB từ nguồn dược liệu này. Có thể kể ra đây là nhóm nghiên cứu của TS. Trần Công Luận, thuộc Trung tâm sâm và dược liệu Tp.HCM với những nghiên cứu xung quanh vấn đề xây dựng quy trình định lượng taxol và 10-DAB từ lá thông đỏ, hay khảo sát sự biến động hàm lượng taxol và 10- DAB trong lá thông đỏ theo sự khác biệt về quần thể nơi thu hái, về loài, về tuổi và về thời gian thu hái… 1.2 DNA lục lạp (cpDNA) ở thực vật 1.2.1 Bộ gen lục lạp [54] DNA lục lạp, ký hiệu là cpDNA (Chloroplast DNA), là DNA sợi đôi, có chiều dài trong khoảng 35-217 kb tùy loài thực vật, trong đó phần đông các loài có DNA dài khoảng 115-165 kb. Chỉ một phần trên bộ gen lục lạp có dạng vòng như mô tả trước đây. Trong mỗi tế bào thực vật có chứa 1,000 – 10,000 bản sao cpDNA. Các gen thuộc cpDNA có tính bảo tồn cao và có thể được chia thành 3 nhóm như sau: Nhóm một là các gen mã hóa những yếu tố thuộc hệ thống quang hợp như phytosystem (psaA, psaB, psbA, psbB .), cytochrome b6f (petA, petB .), ATP synthase (atpA, atpB .) Rubisco (rbcL) và NAD(P)H dehydrogenase (ndhA, ndhB .); Nhóm hai là các gen mã hóa cho các rRNA (rrn16, rrn5 .), trnA (trnH, trnK .), RNA polymerase (rpoA, rpoB .), ribosomal subunit genes (rps2, rps3 .); Và nhóm ba gồm các khung đọc mở ORF gọi là ycfs (chưa rõ chức năng), và các gen mã hóa protein như matK, cemA . -10- Tổng quan 1.2.2 Vùng giữa hai gen trnL-trnF trong nghiên cứu di truyền quần thể Trên cpDNA có rất nhiều gen và vùng giữa hai gen được xem như những marker tiến hóa quan trọng và được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về hệ thống phát sinh loài hay khoảng cách di truyền giữa các quần thể. Điển hình là các gen rbcL, ndhF, matK, atpB, rpl16 và vùng không mã hóa trnL intron hay khoảng giữa hai gen trnL-trnF [54]. trnL là gen mã hóa cho tRNA (UAA), trnF là gen mã hóa cho tRNA (GAA). Khoảng giữa hai gen trnL–trnF thường được dùng cho mục đích tái thiết lại những giả thuyết về các mối quan hệ di truyền ở các mức phân loại khác nhau. Liên quan tới thông đỏ, ở cấp họ, vùng này được sử dụng trong phân tích mối quan hệ giữa hai họ taxodiaceae và cupressaceae [40]; ở cấp loài, vùng này được sử dụng trong việc định danh phân loại các loài Taxus baccata, Taxus canadensis, Taxus cuspidata [26] hay trong việc phân tích sự phát sinh loài của Taxus wallichiana thuộc Trung Quốc và miền bắc Việt Nam [33]. 1.3 Sự đa dạng di truyền [21] Sự đa dạng di truyền trong loài thường bị ảnh hưởng bởi những tập tính sinh sản của các cá thể trong quần thể. Một quần thể là một nhóm cá thể giao phối với nhau để sản sinh ra các thế hệ con cái hữu thụ. Một quần thể có thể chỉ vài cá thể đến hàng triệu cá thể. Các cá thể trong một quần thể thường có bộ gen khác nhau, dù chỉ là rất ít. Gen là một đơn vị di truyền. Những dạng khác nhau của một gen được gọi là allen. Tập hợp một nhóm allen trên một vùng nhiễm sắc thể (NST) được gọi là một hallotype. Sự khác nhau giữa các allen của cùng một gen thường là do đột biến. Tổng các gen và allen trong một quần thể là nguồn gen của quần thể và những tổ hợp của các allen mà mỗi cá thể có được gọi là kiểu di truyền. Kiểu hình của mỗi cá thể được thể hiện bằng các tính chất về hình thái, sinh lý, hóa sinh và được đặc trưng bởi các kiểu di truyền trong từng môi trường nhất định. -11- Tổng quan Số lượng khác biệt nhau về gen trong một quần thể được xác định bởi số gen trong vốn gen đó mà có nhiều hơn một allen (được gọi là các gen đa hình) và số các allen cho mỗi một gen đa hình. Sự tồn tại của các gen đa hình cho phép các cá thể trong quần thể có thể có kiểu gen dị hợp tử, điều đó có nghĩa là các cá thể có thể nhận được những allen khác nhau từ các gen trong mỗi bố mẹ. Sự khác biệt về gen cho phép các loài thích ứng được với sự thay đổi của môi trường. Nói chung, những loài quý hiếm thường đơn điệu về gen hơn so với những loài phổ biến, phân bố rộng và hậu quả là những loài quý hiếm thường rất nhạy cảm với sự biến đổi môi trường và dễ bị tuyệt chủng. Hình 1.4: Sự tương tác giữa kiểu gen và môi trường trong việc quy định kiểu hình cá thể sinh vật. 1.3.1 Biến dị di truyền và cấu trúc di truyền Biến dị di truyền là một trong những đặc điểm phổ biến của hầu hết các sinh vật. Mục tiêu chính của việc bảo tồn sinh học là sự duy trì về đa dạng di truyền trong quần thể. Đa dạng di truyền có vai trò rất quan trọng trong sự sống còn của quần thể Cùng kiểu gen Khác kiểu gen Môi trường giống nhau Kiểu hình khác nhau Môi trường khác nhau Kiểu hình khác nhau -12- Tổng quan bởi vì nó giúp cho quần thể phát triển và thích nghi trước những thay đổi của môi trường. Do đó, biến dị di truyền là nền tảng cho quá trình tiến hóa. Cấu trúc di truyền là sự phân bố tỉ lệ của các dạng di truyền như là số allen hay kiểu hình trong quần thể. Bất cứ sự thay đổi nào về cấu trúc di truyền của một quần thể đều liên quan đến ít nhất một vị trí của gen và điều này được xem như là điều kiện của sự tiến hóa. Tác nhân làm thay đổi cấu trúc di truyền của một quần thể được gọi là nhân tố tiến hóa, bao gồm: đột biến, dòng chảy và sự di chuyển của gen, sự phân mảnh di truyền, chọn lọc tự nhiên và hệ thống giao phối. Nói một cách khác, các nhân tố tiến hóa có tác động phối hợp với nhau lên cấu trúc di truyền của tất cả các cá thể sinh vật trong quần thể. Sự biến đổi về cấu trúc di truyền không thể tìm thấy ở một cá thể riêng lẻ mà nó chỉ xảy ra ở cấp độ quần thể. Từ thông tin di truyền của một sinh vật có thể truyền cho con cháu của chúng tạo nên nhiều kiểu hình khác nhau. Việc theo dõi về cấu trúc di truyền trong một quần thể hay vài quần thể đòi hỏi phải điều tra nghiên cứu về hệ thống di truyền và tiến hóa. 1.3.2 Dòng chảy của gen Hệ thống dòng chảy của gen được mô tả bằng sự trao đổi của các thông tin di truyền ở trong và giữa các quần thể. Vì thực vật không di chuyển được, nên cơ quan giao tử cái cũng ở dạng cố định. Do đó, có hai hướng nghiên cứu cơ bản quan trọng cho sự biến động của gen chủ yếu là sự di chuyển của hạt phấn và hạt giống. Dòng chảy của gen về sự di chuyển của hạt phấn có ý nghĩa hạn hẹp, còn sự di chuyển của cả hạt phấn và hạt giống thì có ý nghĩa rất lớn. Điều này như là một nhân tố thiết yếu cho không gian cấu trúc di truyền của sự phân bố các loài trong một khu vực. 1.3.3 Đặc điểm của các loài cây rừng Cây rừng đóng vai trò quan trọng về di sản và di truyền do có độ đa dạng di truyền cao và là nơi bảo tồn các nguồn gen quý. Các loài cây rừng đặc trưng bởi tần suất các dị hợp tử và mức đa dạng sinh học rất cao. Chúng được ghi nhận cho quá trình tái sinh diễn ra rất lâu khoảng hàng trăm năm. Một trong những đặc điểm quan [...]... mairei [24], để ước lượng liên hệ cây sinh loài của Taxaceae [62], để khảo sát sự đa dạng di truyền trong quần thể Taxus canadensis [53 ], Taxus cuspidata var Nana [43], Taxus wallichiana Zucc vùng đông bắc Ấn Độ [56 ] và Taxus wallichiana Zucc khu vực Hi mã lạp sơn [ 45] 1.4.2 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) marker RFLP được định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới... như bảo tồn các quần thể thực vật Các kỹ thuật này cho phép khảo sát để thu lượng lớn dữ liệu về sự biến Tổng quan - 15 ổi trong quần thể và loài nghiên cứu Marker phân tử đầu tiên được phát triển là RFLP (1980), tiếp đến là RAPD (1990) 1.4.1 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) marker [57 , 66] RAPD ra đời vào năm 1990 do nhóm nghiên cứu của William và cộng sự Theo William, từ RAPD là từ viết tắt của... số nghiên cứu ban đầu [37] cho thấy khả năng tích trữ taxol của các loài khác nhau trong cùng một chi Taxus là khác nhau, thậm chí khả năng này còn khác nhau giữa các cây trong cùng một loài [9, 22, 35] Do đó, việc chọn được đúng dòng mẹ ban đầu có khả năng sinh taxol cao dùng để nhân giống làm nguồn nguyên liệu cung cấp taxol cho ngành dược phẩm là việc làm tối cần thiết Quần thể với tính đa dạng... số lượng và trật tự các oligonucleotid được chọn lọc ở các đầu nối ta có thể nhận được những đoạn DNA được nhân bản khác nhau Sản phẩm được phân tích trên gel polyacrymide, kết quả thu được thường là 50 - 100 băng DNA trên mẫu thí nghiệm Kỹ thuật AFLP là phương pháp xác định đa hình cao, tiết kiệm thời gian, dễ dàng lập lại và có thể sử dụng để phân tích DNA ở bất kỳ mức độ nào do đó được đánh giá . 102, 103, 124, 1 25 (Ban Quản lý rừng đặc dụng Bi Đoup- Núi Bà), có cao độ từ 1 .50 8 – 1.713 m, độ dốc > 25 , cách Đà Lạt khoảng 35 km.  Huyện Đức. cao độ từ 1298 – 1402 m, độ dốc 15 – 25 , cách Đà Lạt khoảng 20 km và cách quốc lộ 19 khoảng 5 km về hướng Tây-Nam. -5- Tổng quan  Huyện Đơn