DAM SAO MAI (CHU BIEN), TRINH NGQC NAM,
Trang 3
SAO MAI, TRINH NGQC NAM, BÙI HỎNG QUAN
LE HONG THIA, DAO HONG HA
Thực tập
VI SINH VẬT HỌC
NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP
Trang 43 Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm
LỜI NHÀ XUẤT BẢN
Là khoa học nghiên cứu về các đặc điểm sinh học của các vỉ sinh vật - sinh vật có kích
thước hiển vi và siêu hiển vi, Vĩ sinh vật học có nhiệm vụ nghiên cứu các đặc điểm cơ bản vẻ hình
thải, cấu tạo, di truyền hoạt động sinh vật hóa học; nghiên cứu sự phân bố của vi sinh vật trong te
nhiên và mỗi quan hệ giữa chúng với môi trường và các sinh vật khác; nghiên cứu các biện pháp thích hợp đề sử dụng hiệu quả nhất vi sinh vật có lợi cũng như các biện pháp tích cực nhằm ngăn ngừa các vi sinh vật có hại
Cuốn sách "Thực tập Vi sinh vật học" được nhóm tác giả: TS Đàm Sao Mai (chủ biê
Trịnh Ngọc Nam, Lê Hồng Thía, Đào Hằng Hà, Bùi Hồng Quân biên soạn khá công phu, là một
tực rất đáng trân trọng trong việc giới thiệu các phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập trung vào các thí nghiệm nghiên cứa, xác định các vi sinh vật dùng trong công nghiệp thực phẩm và các phương pháp kiêm nghiệm vi sinh thực phẩm Sách cung cáp cho người đọc kiến thức thực hành cơ bản về vi sink hoc thực phẩm một cách tồn điện thơng qua việc trình bày các kĩ thuật kinh điền Bén cạnh đó, sách còn trình bày một số kĩ thuật phân tích hiện đại dựa trên nguyên tắc sinh học phân tử như PCR hoặc sử đụng test thie mhanh bằng hệ thống API He thống bài thí nghiệm được bồ trí hợp l, kiến thức của bài trước làm nền cho bài sau Trong mỗi bài đều có phần nhắc lại lí thuyết trọng tâm, giúp người đọc nắm được cơ sở lí thuyết của thí nghiệm Trình tự thao tác được trình bày cặn kẽ, hợp lí và mình họa rõ ràng Các bài thí nghiệm thực hiện qua nhiều công đoạn đều có sơ đồ trình tự thí nghiệm, giúp người đọc hình dưng rõ ràng tiễn trình thí nghiệm Ngoài ra,
phần Phụ lục có chỉ tiêu vi sinh của một số sản phẩm thực phẩm theo Tiêu chuẩn Việt Nam giúp
người đọc thông tin về giới han an toàn vì sinh trong thực phẩm Sách đáp ứng được những đòi hỏi cơ bản của công tác hướng dẫn thực hành: cung cấp cơ sở lí thuyết cơ bản, dự trù nguyên liệu, hóa chất, chuẩn bị dụng cụ, hướng dẫn trình tự tiến hành và các thao tác chuyên môn đặc biệt của thí
nghiệm, vì thí nghiệm vi sinh là thí nghiệm tỉnh tế, nhạy cảm, đòi hỏi sự cẩn trọng và độ chính xác
cao
Trên cơ sở kế thừa, nâng cao, đổi mới nội dung kiến thức, cuồn sách này thể hiện kết quả
tình thần làm việc khoa học nghiêm túc của các tác giả Trong quá trình biên soạn, các tác giả đã tham khảo, chọn lọc nhiều tài liệu, tuân thủ nguyên tắc trình bày rõ ràng, lôgích Vì vậy, cuốn sách là một tài liệu khoa học, hệ thống và cơ bản, rất có ích cho giáo viên hướng dẫn thực hành cũng
như sinh viên ngành công nghệ thực phẩm
Nhà xuất bản Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh trân trọng giới thiệu cuốn
sách "Thực tập Vi sinh vật học " đến đông đảo bạn đọc
NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP
Trang 5Thực tập Vĩ sinh vật học 4
LỜI MỞ ĐẦU
“Xung quanh chúng ta, ngoài các sinh vật lớn mà chúng ta có thé nhin thay được, còn có vô
vàn vi sinh vật nhỏ bé, muốn nhìn thấy chúng phải sử dụng kinh hiển vì, người ta gọi chúng là vi
sinh vật Vì sinh vật phân bồ rộng rãi trong tự nhiên và ảnh hưởng, rất lớn đến đời sống của con
người và mọi sinh vật khác Ngành khoa học nghiên cứu về hoạt động sống của các vỉ sinh vật được gọi là Vĩ sinh vật học
Vi sinh vat học phát triển rất nhanh, với nhiều lĩnh vực khác nhau: vỉ khuẩn học, nắm học,
tio học, virus học hay y sinh vi sinh vat hoc, vi sinh vật học thú y, vi sinh công nghiệp, vi sinh
nông nghiệp, vi sinh môi trường Mỗi lĩnh vực có đối tượng riêng, cần đi sâu nghiên cứu; song ở mức độ nhất định, các chuyên ngành trên đều có những điểm cơ bản giống nhau
Quyển sách này sẽ giúp sinh viên hiểu rõ hơn về một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật; trong đó, tập trung chủ yêu về Vì sinh đại cương và Vĩ sinh trong cong nghiệp thực phẩm
Tuy đã rất cô gắng trong quá trình biên soạn song không thể tránh khỏi nhiều khiểm khuyết, chúng tôi rất mong nhận được sự góp ý của quý độc giả để nội dung sách ngày càng
được nâng cao
Trang 65 Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm MỤC LỤC Lời nhà xuất bản Lời mở đầu Những quy tắc an toàn trong phòng thí nghiệm vi sinh vật Bài 1 Bài 2 Bài 3, Bài 4 Bài 5 Bài 6 Bài 7 Bài 8 Bài 9 Bai 10 Bài 11 Bài 12 Bài 13 Bài 14 Bài 15 Bài 16 Bài 17 Bài 18 Bài 19 Bài 20 Bài 21 Bài 22 Bài 23 Bài 24 Bài 25 Bài 26 Thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm và các phương pháp tiệt trùng vi sinh vật
Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy
Phuong pháp nuôi cấy vi sinh vật
Phương pháp quan sát vi sinh vật bằng kính hi Phương pháp nhuộm màu vi sinh vật
Phương pháp phân lập vi sinh vật
Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
Khảo sát sự sinh trưởng của vi sinh vật Đường cong sinh
trưởng của vi sinh vật
Khảo sắt sự ảnh hướng của các yếu tố môi trường đến sự sinh
trưởng của vi sinh vật
Khảo sát đặc tính sinh hóa của vĩ sinh vật Kiểm soát sự sinh trưởng của vỉ sinh vật
Xác định khả năng phân giai cellulose và hoat tinh enzyme
cellulase cita vi sinh vật -95
Định lượng ví sinh vat bing phương pháp đêm trực tiếp 101 Định lượng tổng VK hiếu khí trong thực phẩm bằng phương
pháp đếm khuẩn lạc 107
Định lượng Coliform bằng phương pháp MPN (Most probable number, 115 Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp dùng petrifilm 121
Ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất thực phẩm — Làm tương đậu 126 Ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất thực phẩm Làm rượu vang, 129
Phương pháp phân tích dinh lugng Escherichia coli trong thye pham 132
Phuong phap phan tich Salmonella spp trong thực phẩm 141 Phương pháp phân tích dinh luong Bacillus cereus trong thực phẩm 149
Phương pháp phân tích dinh lugng Staphylococcus aureus trong,
thực phẩm 157
Phương pháp phân tích Vibrio cholerae trong thực phẩm 163
Phuong phap phan tich Clostridium perfringens trong thyre pham „175
Phương pháp phân tích vi sinh vật trong thực phẩm bằng phương,
pháp PCR 180
XXác định nhanh vĩ sinh vật rong thực phẩm bằng hệ thống
Trang 7Thực tập Vĩ sinh vật học 6
Phụ lục
Bang tra MPN dùng cho loạt 9 ống ở ba nồng độ liên tỉ
‘Thuong quy kỹ thuật định tính và bán định lượng độc tổ vi nắm aflatoxin
“Thường quy kỹ thuật định danh nắm mốc aspergillus flavus, aspergillus
niger, aspergillus fumigatus trong thyc pham
“Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7042:2002 Bia hơi — beer ~ Specification “Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7041:2002 Đồ uống pha cl 92 193 200 quy
định kỹ thuật So/f drinks —.Specjficarion Hee 206 “Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7044:
Liqueur ~ Specification se 207
“Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7045:
Wine ~ Specjfication 208
Các chỉ tiêu vi sinh vật của sữa tươi tiệt trùng TCVN 7028:2002
Tiêu chuẳn Việt Nam TCVN 7108:2002 Sản phẩm sữa bột dành cho trẻ đến 12 tháng
kỹ thuật Dried milk for infants up-to 12 months age — Speciffeation 209
“Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5538:2002 (Soát xét lần 1) Sữa bột - quy định
ky thuat Milk powder — Speification oe Tiêu chuẳn Việt Nam TCVN 7030:2002 Sữa chua — quy định kỹ thuật
Yoghurt — Specification - Tiêu chuẳn Việt Nam TCVN 5539.2002 (Soát xét lần 1) Sữa đặc có đường — quy định kỹ thuat Sweetened condensed milk — Specification
“Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7029:2002 Sữa hoàn nguyên tiệt trùng — quy định kỹ thugt Sterilized reconstituted milk — Specification
Tiêu chudn Vigt Nam TCVN 7028:2002 Sữa trời tiệt tring — quy định kỹ thuat Sterilized fresh milk — Specification oe
“Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7049:2002 Thịt chế biến có xử lý nhỉ định kỹ thuật heat Treated processed meat — Specification
“Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7050:2002 Thi
định kỹ thuật Non — heat treated processed meat ~ Specification “Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7048:2002 Thịt hộp - quy định kỹ thuat Canned meat Specification ca
Trang 8Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 7
NHỮNG QUY TÁC AN TỒN TRONG PHỊNG THÍ
NGHIỆM VI SINH VẬT
Thao tác an toàn là yêu cầu cực kỳ quan trọng đối với thí nghiệm vi sinh vat Vi
sinh vật có kích thước nhỏ bé mà mắt thường không nhìn thấy được Trong quá trình làm thí nghiệm, chúng ta thường thao tác với số lượng rất lớn và đậm đặc tế bào vi sinh vật
Bên cạnh những giống, loài vi sinh vật có ích là những giống, loài có khả năng gây bệnh và có hại đối với sức khỏe con người Mặt khác, trong quá trình thí nghiệm chúng ta cũng, phải sử dụng nhiều loại hóa chất, trong đó có những hóa chất có độc tính Chính vì thé,
người làm thí nghiệm trong phòng thí nghiệm vi sinh vật cần tuân thủ các quy tắc cơ bản
sau đây
1.NHỮNG QUY ĐỊNH CHUNG
- Những người không có nhiệm vụ không được vào phòng thí nghiệm
~ Khi vào phòng thí nghiệm phải mặc áo blouse (cài khuy kín), cột tóc gọn gàng
- Không nói chuyện ồn ào, giữ gìn trật tự Không ăn uống, hút thuốc trong phòng
kiểm nghiệm
- Mang khẩu trang, găng tay khi thao tác với vi sinh vật và hóa chất
- Trên bàn thí nghiệm chỉ để vật dụng thí nghiệm, số ghi chép, giấy ghi chép Tất cả các vật dụng cá nhân, áo khoác, túi xách, sách vở phải dé đúng nơi quy định
- Trước và sau khi kết thúc thí nghiệm, phải sát trùng mặt bàn bằng các hóa chất sát trùng cồn 70% hoặc dung dịch khuẩn khác (lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%) đã chuẩn bị sẵn và lau khô bằng giấy vệ sinh
- Cần ghi chú tên chủng, ngày tháng thí nghiệm, người làm thí nghiệm lên tất cả các hộp petri, ống nghiệm
- Tuyệt đối không để canh trường hay vật phẩm có vi sinh vật dính lên quần áo,
sách vở và dụng cụ cá nhân Đồng thời cũng phải chú ý bảo vệ da và quần áo khỏi bị dính hóa chất và thuốc nhuộm
- Cần thận khi thao tác với đèn cồn hoặc đèn bunsen Tắt ngọn lửa khi chưa có nhu cầu sử dụng hoặc ngay sau khi thực hiện xong mỗi thao tác Tuyệt đối không dùng đèn cồn đề mỗi lửa đèn cồn
~ Sử dụng quả bóp cao su khi thao tác ống hút định lượng (pipette), tuyệt đối không hút bằng miệng
Trang 98 Thực tập Vĩ sinh vật học - Tat cả các vật liệu bị nhiễm bản, môi trường chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần phải
được khử trùng trước khi vứt bỏ hoặc sử dụng lại Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần được ngâm vào dung địch diệt khuẩn (nước javel) trước khi rửa và tái sử dụng
- Kết thúc thí nghiệm phải vệ sinh các thiết bị, dụng cụ đã sử dụng theo đúng quy trình va sắp xếp vào đúng nơi quy định
- Rửa tay sạch sẽ trước khi rời phòng thí nghiệm
- Tất cả các trường hợp tai nạn phải báo cáo cho cán bộ hướng dẫn thí nghiệm đẻ
kịp thời xử lý
Il MỘT SỐ LƯU Ý VỚI SINH VIÊN NHẢM ĐẠT KET QUA TOT TRONG THYC HANH VI SINH VAT
1 Trước khi thực hành
- Cần đọc trước nội dung toàn bài để hình dung được khối lượng công việc sẽ làm
- Hiểu rõ nguyên tắc, mục đích của các thí nghiệm
~ Đọc cẩn thận cách tiến hành thí nghiệm
2 Trong giờ thực hành
- Ghi chú cẩn thận những căn đặn của giảng viên về các thao tác và quy trình thực hành - Thực hiện thí nghiệm theo đúng hướng dẫn của giảng viên
Trong quá trình thí nghiệm có những thao tác, công đoạn không rõ cần hỏi lại giảng viên hướng dẫn
~ Ghi chép cẩn thận các chú ý quan trọng của thí nghiệm và kết quả của mỗi thí nghiệm 3 Kết thúc thực hành
- Làm báo cáo thực hành theo các yêu cầu trong mục V của từng bài thí nghiệm và theo yêu cầu của giảng viên
Trang 10
Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 9
Bài 1
THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH
VẬT VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG VI SINH VẬT
1 THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC
1 Tủ sấy (vacuum oven): điều chỉnh nhiệt độ từ 60”C - 200°C, dùng đẻ sấy khô, khử trùng các loại dụng cụ chịu được sức nóng khô, chủ yếu là dụng cụ thủy tỉnh, kim loại
Tùy vào đối tượng cần khử khuẩn mà sấy ở chế độ nhiệt và thời gian khác nhau, thường
sấy ở 160”C trong 2 giờ, hoặc 180”C trong 30 phút
Hình 1.1 Tử sáy
2.Tủ Ấm (ineubator or etuve): nhiệt độ từ 20”C — 60”C, có chế độ ôn định nhiệt độ, được sử dụng để nu‹ vi sinh vật tại nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trường và phát triển của chúng Tùy vào đối tượng nuôi cấy mà ủ ở nhiệt độ khác nhau để vi sinh vật có thể phát triển tốt Ví du: coliform 30°C trong 24 ~ 48 gid, E coli thích hợp ở 44`C trong 24 —48 giờ
3 Tit lanh hay ti mat (freezer); dùng bảo quản môi trường đã pha chế, gidng vi khuẩn, các chế phẩm sinh học (vaccin, huyết thanh, đĩa giấy kháng sinh ) hóa chất, thuốc thử đễ phân hủy ở nhiệt độ thường
4 Nồi hấp ướt (autoclave): Thiết bị này cấp nhiệt bằng hơi nước ở áp suất cao
(hơi nước bão hòa ở áp suất cao), được sử dụng để hấp khử trùng môi trường, một số nguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm, Tùy đối tượng mà sử dụng ở chế độ nhiệt độ và áp suất
thích hợp thường dùng ở 121 ”Œ/1 atm trong 15 phút; 127 “C/1.5 atm trong 30 phút với môi trường đất; hay 117”C/0.8 atm trong 15 phút với môi trường chứa nhiều đường, môi trường
Trang 1110 Thực tập Vĩ sinh vật hoc Bang 1.1 Tương quan giữa thể thích môi trường và thời gian háp tiệt trùng ở 121°C
Thể tích môi trường | Thời gian hấp tiệt trùng nuôi cấy (ml) tối thiểu (phú) 25 20 50 25 100 — 28 250 31 500 35 1000 40 2000 48 4000 63
Bảng 1.2 Tương quan giữa áp suất hơi (chỉ số của áp kế nôi hắp) và nhiệt độ
(Chi số áp kế của nội ápJ0,0 [02 |04 [03 ]06 [07 [08 [09 ]i0 ]i5 |20
suất (atm)
Nhiệt độ sôi nước(C) |100 J105 [H19 [H12 [H14 [D6 [17 [19 Hội |T27 ]134
Nhiệt độ sôi nước (CF) |212 |221 |230 |2344 |237 |24i |243 |246 |250 |261 |273
Hình 1.2 Nỗi hấp cao áp (Autoclave)
Trang 12Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 11
Hình 1.3 Cân phân tích (A4) và cân kỹ thuật (B)
6 Tủ cấy vô khuẩn có đèn cực tim (flux laminar): có không gian vô trùng được sử dụng để thao tác với vi sinh vật nhờ hệ thống đèn tử ngoại và bộ phận thôi khí vô trùng
Hình 1.4 Tủ cấy vô tràng
7 Máy ly tâm (centrifuge): dùng tách các chất ở các pha rắn - lỏng ra khỏi nhau như tách sinh khối tẾ bào ra khỏi môi trường nuôi cấy, tách hồng cầu, enzyme Khi sử dung, các ống ly tâm cần đặt đối xứng và nhất thiết là phải có khối lượng bằng nhau
Trang 1312 Thực tập Vĩ sinh vật học
8, Máy lắc (shaker): Thiết bị dùng để nuôi cấy, nhân giống vi sinh vật bằng cách
lắc các bình nuôi cấy theo các chiều khác nhau (lắc vòng và lắc ngang) một cách đều đặn để tăng lượng oxy hòa tan trong môi trường
Hình 1.6 Máy lắc
9 Kính hién vi (microscope): có vai trò rất quan trọng nghiên cứu vi sinh vật
Dùng nghiên cứu, quan sát tế bào vỉ sinh vật về đặc điềm hình thái, sinh lý nhờ vào khả năng phóng đại của kính (sẽ giới thiệu chỉ tiết ở bài sử dụng kính hiển vì)
Hình 1.7 Kính hiển vi quang hoc
10 Máy đo pH (pH meter): đo pH dung dịch, môi trường nuôi cấy vi sinh vật
A B
Trang 14Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 13 11 Máy cất nước (single/ double water stills): dùng để cất nước
+
12 Bể ỗn nhiệt (water bath): chứa nước và được cài đặt ở nhiệt độ nhất định để ổn định nhiệt độ cho những thí nghiệm cần sự ôn định về nhiệt độ
Hình 1.10 Bề ổn nhiệt
13 Nồi lên men (fermenter/bioreactor): thiết bị lên men nuôi cấy vi sinh vật
Trang 1514 Thực tập Vĩ sinh vật học
14 Các thiết bị khác như: máy đếm vi sinh vật, máy quang phỏ, sấy đông khô
15 Dụng cụ thí nghiệm
Dựng cụ thủy tỉnh có nhiều loại với nhiều kích cỡ khác nhau như bình tam giác,
ống nghiệm, đĩa petri, lam kính, đũa thủy tỉnh, que trang, ống đong, cốc đong, bình định
mức Yêu cầu phải sạch, trong, trung tính Trước khi dùng đựng môi trường phải được
sấy khô, làm nút bông và khử trùng trong tủ sấy khô
- Phiến kinh (lame): ding làm tiêu bản quan sát hình thái, sinh lý tế bao vi sinh vat - Lá kính (lamelle): dùng để đậy lên vết bôi trên tiêu bản cố định vi sinh vật trong quá trình nghiên cứu
- Hộp lồng (đĩa petri): dùng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi
cấy và phân lập của tế bào vi sinh vật
~ Que gạt (que trải): là dụng cụ để phân lập vi sinh vật theo phương pháp trải đĩa
- Que cấy: gồm có ba loại Que cấy đầu tròn: dùng để thao tác vi sinh trên đối
tượng đơn bào như vi khuẩn, nắm men Que cấy nhọn: dùng cấy sâu trên môi trường rắn
Que cấy móc: dùng để lấy khuẩn ty hay một đoạn tơ ni - Micro pipette: str dung khi can hut một lượng chính xác môi trường sử dụng trong, định lượng vi sinh vật
- Pipette Pasteur: dùng để lấy dung dich môi trường nuôi cấy
Các dựng cụ mới cần được ngâm nước hoặc dung dịch H;SO; loãng trong 24 giờ
Sau đó mới rửa lại bằng nước hoặc xà phòng nhiều lần cho đến khi pH trung tính
Các dụng cụ đã qua sử dụng còn chứa môi trường và vi sinh vật, cần khử trùng rồi
mới rửa sạch bằng xà phòng, phơi và sấy khô
Các đụng cụ bị bám bản cần được ngâm thêm với dung dịch sulfocromic vài giờ, sau đó rửa lại bằng nước sạch
Thanh phan dung dich sulfocromie
K;CrO; : 60g H;SO¿ : 66 ml
Nước cấtđến — : 1000 ml Cách pha
+ Hòa tan 60 g KzCrO; vào 700 ml nước cất, đặt bình vào chậu nước để tránh bị
bỏng khi bổ sung axit
+ Bồ sung từ từ 66 ml dung dịch axit H›SO¿ vào dung dịch KạCrO; trên đến khi tan
Trang 16Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 15
+ Bồ sung nước cất vừa đủ 1000 ml, Bảo quản trong bình tối màu, tránh ánh sáng để dùng dan,
- Dụng cụ sạch khi đưa lên ánh sáng không có vết mờ và vết bợn
- Các dụng cụ khác như: đèn cồn, giá ống nghiệm que cấy, kẹp, kéo, bơm tiêm
nhựa, đầu tuýp, bếp điệ
II CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG VI SINH VẬT
1 Nguyên tắc
Diệt trùng hay khử trùng là phương pháp nhằm ức chế hoặc loại bỏ, cuối cùng là
giết chết các vi sinh vật không mong muốn
Người ta thường khử trùng bằng hai phương pháp chính 2 Phương pháp
4) Phương pháp lý học Nhiệt khô
- Đối với dụng cụ cấy kim loại, đôi khi cả thủy tỉnh, phương pháp thường dùng là
đốt: đốt trực tiếp trên ngọn lửa hoặc nhúng cồn đốt
- Đối với dụng cụ thủy tỉnh có thể gói giấy và sấy ở 160°C trong 1-2 giờ hoặc 180°C trong 30 phuit Dụng cụ đưa vào sấy phải chịu được nhiệt độ cao và không buộc dây nhựa hoặc thun Nhiệt ẩm cho vật khử trùng vào nước sôi, nhiệt sẽ thám nhanh vào mẫu ệt tế bao sinh - Phương pháp luộ vật làm cho protein đông kết, dẫn đến giết chết vi sinh vật Tuy nhiên, chỉ dưỡng, bảo tử vẫn còn
~ Phương pháp Pasteur: chỉ diệt vi khuẩn gây bệnh (ký sinh), không điệt bào tử vi khuẩn hoại sinh Phương pháp này khơng điệt hồn tồn mảm bệnh mà chỉ chọn một vải
vi sinh vật đối kháng mạnh nhất Vì vậy, phải biết nhiệt độ và thời gian diệt trùng cho từng, loại vi sinh vật Phương pháp này thường dùng nhiệt độ 70-75°C trong thời gian 10-15 phút
~ Phương pháp Tyndall: đun cách thủy nhiều lần ở nhiệt độ 70-80°C, mỗi lần 30-60 phút và liên tiếp trong ba ngày liền
- Phương pháp hơi nước bão hòa ở áp suất cao: dùng autoclave Nhiệt độ và thời gian hấp tùy thuộc vào loại nguyên liệu cần hấp Thường dùng nhất ở nhiệt độ 121°C trong thời gian 15-30 phút
Diệt trùng bức xạ
Trang 1716 Thực tập Vĩ sinh vat hoc
- Tia 4m cực: dùng trong diệt trùng dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm Vật khử trùng phải bao gói kín
Sóng ngắn khi tác động với cường độ và thời gian thích hợp có thể phá vỡ tế bảo vỉ sinh vật, làm chết các tế bào sống
Điệt tràng bằng cách lọc
- Dụng cụ lọc thường là những màng xốp bằng sứ, aminate, cellulose có kích thước lỗ lọc từ 0,2-0,45uum, thường dùng dé lọc những vật phẩm lỏng không khử trùng bằng nhiệt được
- Đối với khử trùng không khí thì thiết bị khử trùng là một máy lọc khí có trang bị màng lọc hay hấp phụ vi khuẩn
b) Phương pháp hóa học
- Chat sát khuẩn ngoài da: xà phòng, cồn, iode, phẩm màu (phân lớn phẩm màu có
tác dụng sat khuan nhu: xanh methylene)
- Chat điệt khuẩn và tẩy uế: phenol, formol, hợp chất cloi
Ill THUC HANH CHUAN Bi DUNG CU THi NGHIEM 1 Chuẩn bị ống nghiệm
Dùng để chứa đựng dung địch với dung tích nhỏ, nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường lỏng hoặc môi trường thạch, thử các tính chất sinh hóa của vỉ sinh vật
ối với các ống nghiệm không có sẵn nắp (nắp nhựa, nắp cao su, nắp inox ), sinh viên tiến hành làm nút đậy bằng bông không thấm nước và bao gói bên ngoài bằng giấy 'Yêu cầu của nút đậy bằng bông và bao gói bên ngoài như sau
- Nút bông có độ chặt vừa phải đảm bảo độ kín và thuận tiện trong quá trình thao tác mở hoặc đậy Kích thước phần bên trong ống nghiệm của nút khoảng 1,5-2 cm, phần bên ngoài khoảng 0,5 cm Đầu của nút bông nhẫn, không gap nếp hoặc xù tơ bông
- Bao giấy phải trùm kín được phần nút bông của ống nghiệm với độ chặt vừa phải Mép giấy bên trong và ngoài phải được gap chéo đề thuận tiện cho quá trình tháo ra hoặc đậy hai
2 Chuan bi dia petri
Đĩa petri chủ yếu dùng để nuôi cấy, phân lập các chủng vi sinh vật hoặc làm các
test chẩn đoán, kháng sinh đồ khoanh giấy, các thử nghiệm tính cạnh tranh giữa các chủng vi sinh trên môi trường thạch đỉnh dưỡng, mà qua đó ta có thể quan sát được hình thái tính chất khuẩn lạc của quần thể vi sinh vật
Trang 18
Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 17
3 Chuẩn bị pipette
Dùng để đong, hút dung dịch cần có độ chính xác cao Có rất nhiều loại pipette thủy tỉnh khác nhau nhu pipette Pasteur, pipette có chia vạch thông thường được thiết kế cho phù hợp với mục đích nghiên cứu Hiện nay, trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu về vi sinh vật gây bệnh đều nghiêm cấm hut pipet bing mồm, thay vì thế người ta dùng qua boa bing cao su, quả bóp hút an toàn ba van, hoặc dùng pipette hút tự động (pipette aid) hoặc micropipette
Các pipette thủy tỉnh trước khi sử dụng, cần rửa sạch, nhét bông không thắm nước vào đuôi của Pipette để tránh tạp nhiễm khi sử dụng Pipette được bao gói bằng giấy hoặc đặt chung trong ống chứa pipette sau đó đem sấy hoặc hấp tiệt trùng
4 Chuẩn bị bình tam giác
Thường sử dụng đẻ chuẩn độ, chứa dựng môi trường, dung địch, nuôi cấy vỉ sinh vật, thực hiện các phản ứng Bình tam giác, thường có thể tích từ S0 ml đến 10 lít tủy theo
dung dịch chứa để chọn loại bình thích hợp Trước khi sử dụng, bình tam giác cần được rửa sạch, sấy khô va bao gói Nút đậy của bình có thể làm bằng bông không thấm nước Yêu cầu của nút đậy phải có độ chặt vừa phải, dầu của nút đậy phải tới phần cổ của bình đảm bảo độ kín và tránh tạp nhiễm tối đa
1V NHỮNG DIEM CAN LUU Y
- Không làm vụn bông không thấm khi làm nút đậy cho các dụng cụ như ống
nghiệm, bình tam giác
~ Khi nút bông gòn vào đuôi pipette, độ chặt phải vừa đủ, phải kiểm tra khả năng hút dung dich cua pipette sau khi nút xong
~ Kích thước nút đậy của ống nghiệm, bình tam giác phải phù hợp, tiện dụng
v BAO CAO THUC TAP
- Trình bày yêu cầu của việc bao gói dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật
~ Công dụng và cách sử dụng các dụng cụ, thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh vật
ệt trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Trang 19
18 Thực tập Vi sinh vat hoc
Bai2
PHUONG PHAP PHA CHE MOI TR
NUOI CAY VI SINH VAT
I NGUYEN TAC
Các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội
bào Môi trường đinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa - khử, áp suất thảm thấu của tế bao va sy én định độ pH của môi trường
'Yêu cầu của môi trường đinh dưỡng: có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết; có độ pH thích hợp; có độ nhớt nhất định; không chứa các yếu tố độc hại: hoàn tồn vơ trùng đảm bảo sự phát triển ôn định của vi sinh vật
Phân loại môi trường đỉnh dưỡng: người ta dựa trên các cơ sở khác nhau để phân loại môi trường
a) Phân loại theo nguôn gốc
- Môi trường tự nhiên: dịch nước chiết thịt, nước chiết khoai tây, máu động vật
~ Môi trường nhân tạo: Czapeck, Hansen, EMB
~ Môi trường bán tự nhiên: Potato glucose agar (PGA), giá đậu đường b) Phân loại theo trạng thái vật lý
- Môi trường lỏng: dạng lỏng, không có agar hay các chất làm giá thẻ khác trong thành phần môi trường - Môi trường rắn: mỗi 1000 ml môi trường có 15-20 g agar hay các chất làm giá thể - Môi trường bán lỏng (bán rắn): mỗi 1000 ml môi trường có 3-5 g agar hay các chất làm giá thẻ khác
©) Phân loại theo cơng dựng ~ Môi trường phân lập - Môi trường tăng sinh ~ Môi trường lưu giữ giống
~ Môi trường thử nghiệm sinh hóa
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật được pha chế theo nguy:
Trang 20Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 19
~ Để đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẳm thấu giữa môi trường và tế bảo vi sinh vật nên cần điều chỉnh tỷ lệ và nông độ các chất trong thành phần môi trường
~ Đảm bảo các điều kiện hóa lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật II DUNG CU, MOI TRUONG VA HOA CHAT 1 Dụng cụ
“Tên dụng cụ, thiết bị mỗi l
sr sinh viên) S8 lượng 1 m_ 1 2 5 3 _| Binh tam gidc tf 1 4 | Phéuthoy tinh 1 5 | Đũa khuấy thủy tỉnh ¬ 1 6 | Céc 100 ml 3 7| Cốc 500 ml 1 8 | Đĩacânnhựa 3 9 _| Binhtia —— dt 10 | Bếp điện 1 Dụng cụ dùng chung 11 | Máy dopH 1 12 | Cân kỹ thuật 1 13 | Cân phântích 1 14 _ | Noi hp cao dp 1 15 |Tủsấy 1 2 Môi trường và hóa chất
a) Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Trang 2120 Thuc tap Vi sinh vat hoc
b) Môi trường nuôi cấy nắm men Môi trường Hansen
- Glucose, maltose (hoặc đường kính): 50 g - Peptone: 10 g - K;HPO¿: 3 g - MgSO4.7H20: 2-5 g - Agar: 20 g - Thêm nước cất đủ: 1000 ml Lắc đều, điều chỉnh pH 6,0 + 0,2 Nấu sôi nhẹ để agar tan hoàn tồn phân phối mơi trường vào các dụng cụ để khử trùng ở 121C trong 30 phút
e) Môi trường nuôi cấy nắm mốc Môi trường Czapek - Saccarose: 30 g - NaNO3: 30 g - K;HPO¿:: 1 g - MgSOu: 0,5 g - FeSOa: 0.01 g - Thach (agar): 20 g; - Thêm nước cất đủ: 1000 ml pH 6,0 + 0,2 khử trùng 1 atm /30 phút 4d) Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
Trang 22Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 21
pH 7,2 + 7.4 khử trùng 1 atm trong thời gian 30 phút 4) Môi trường nuôi cấy tảo
Môi trường Tamiya - KNOs: 5,000 - MgSOx: 2,500 - KH;POs: 1,250 - FeSO,.7HạO : 0,003 - EDTA: 0,037 - Vi lugng AS: 1 mi - Agar : 20 g
- Nude cat dit 1000 ml
Thanh phan vi lugng AS - H;BO: 2,860 ~MnCl;4H;O: 1,810 - ZnSO¿.7H;O: 0,222 -MoO;: 176,4 ~ NH¿VO:: 229,6 - Nước cất đủ 1000 mÌ 3 Nguyên liệu khác - Giấy lọc - Bông không thấm ~ Bông thấm nước
II TIỀN HÀNH THÍ NGHIỆM
Làm mơi trường để thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồn;
thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng
Các bước chế tạo môi trường dinh dưỡng: 1 Chuẩn bị dụng cụ
Tắt ca các dụng cụ cần sử dụng trong suốt quá trình pha chế môi trường phải đượ:
chuẩn bị đầy đủ Các dụng cụ được rửa sạch, tráng bằng nước cất, sấy khô trước khi sì dụng
2 Cân đong hóa chất pha chế môi trường
Trang 2322 Thực tập Ví sinh vat hoc
chất đễ hút âm
3 Phối chế tạo môi trường nuôi cấy
- Các thành phần của môi trường được hòa tan riêng rẽ trong nước cắt trước khi phối
trộn
~ Phối trộn các thành phần theo trình tự nhất định tránh sự tương tác trực tiếp của các thành phần có thẻ phản ứng tạo kết tủa với nhau Phối trộn dựa trên nguyên tắc thẻ tích tăng dần
- Sau khi phối chế các thành phần, cần tiến hành lọc môi trường qua giấy lọc, bông thấm nước (đối với môi trường lỏng) hoặc vải màn (đối với môi trường đặc) đề làm trong
môi trường, đảm bảo việc quan sát vi sinh vật được dễ dàng
- Đối với môi trường rắn, sau khi phối trộn các thành phần, phải tiền hành nấu sôi
môi trường đề làm tan hoàn toàn agar trước khi phân phối vào dụng cụ chứa 4 Điều chỉnh độ pH của môi trường
~ Muốn điều chỉnh độ pH của môi trường có thể dùng HCI 10% hay NaCl 10%
Ngoài ra có thể dùng một số hóa chất khác như: HạPO¿, H;SO¿, KOH, NaHCO3, Na›CO:
~ Muốn kiểm tra độ pH của môi trường nên dùng máy đo pH (pH-metre) Phương pháp này nhanh nhạy và cho độ chính xác cao Trong phòng thí nghiệm có thể dùng chỉ thị
màu xanh bromotomol hay giấy quỷ để đo pH Phương pháp này tiện lợi, nhanh nhưng
không cho độ chính xác cao
5 Phân phối môi trường vào dụng cụ chứa
~ Môi trường sau khi pha chế xong thường được phân phối môi trường vào ống nghiệm, bình tam giác Trình tự phân phối gồm các bước sau
+ Môi trường cần được đun cho hóa chat lỏng rồi dé qua phéu thủy tỉnh vào các dụng cu
+ Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường, tay phải kẹp nút bông và kéo ra + Nhanh tay rót môi trường vào dụng cụ và đậy nút bông lại
ôi với ống nghiệm: Nếu dùng môi trường làm thạch nghiêng thì lượng môi trường cần được phân phối chiếm 1⁄4 thể tích của ống nghiệm Nếu làm thạch đứng thì lượng môi trường cần được phân phối từ 1/2 - 1⁄3 thẻ tích ống nghiệm
- Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng môi trường được phân phối chiếm 1/2 - 1⁄3 thể tích của bình
- Đối với đĩa petri, mdi trường chỉ được phân phối vào dia sau khi đã hp tiệt trùng Thẻ tích môi trường khoảng 12-15 mÌ mỗi đĩa lớp môi trường thạch dày khoảng 2 mm
~ Viết nhãn môi trường trên dụng cụ chứa, bao gồm các thông tin:
Trang 24Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 23
+ Ngày khử trùng + Người pha chế 6 Khử trùng môi trường,
~ Tùy theo tính chất và điều kiện cụ thể của từng loại môi trường mà có chế độ và phương pháp khử trùng khác nhau Môi trường thường được hắp tiệt trùng bằng nồi hấp cao áp Thời gian hấp tiệt trùng môi trường ở nhiệt độ 121°C phụ thuộc vào lượng môi
trường được phân phối vào dụng cụ chứa (xem Bài 1)
„.- Đối với môi trường có các thành phần dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao (vitamin, chất
kháng sinh, chất kích thích sinh trưởng ), cần hấp tiệt trùng môi trường trước, sau đó bỗ
sung các thành phần này sau khi hấp xong
~ Một số loại môi trường không được hắp tiệt trùng theo quy định của nhà sản xuất
(vi du: méi trudng Selenit cystine broth, Xylose lysin deoxycholate agar, Chromocult coliform agar ), cần chuẩn bị nước cắt vô trùng trước, sau đó pha chế và sử dụng ngay
Hình 2.1 Mội số dạng môi trường trong ông nghiệm và hộp petri
7 Làm thạch nghiêng, thạch đứng, đỗ thạch vào đĩa petri
Trang 2524 Thực tập Vĩ sinh vat hoc
đình nghiêng phải cách nút đậy 3-5 em Phần đáy phải có một phần thạch đứng 0,5-1 cm
~ Làm thạch đứng: đặt các ống nghiệm đã có môi trường làm thạch đứng vào giá, để yên cho đến khi môi trường nguội và đông đặc
- Đỗ thạch vào đĩa petri: môi trường vô trùng chứa trong ống nghiệm hoặc bình tam giác được rót vào phần đáy của đĩa petri Toàn bộ quy trình đỗ thạch vào đĩa petri đều thực hiện trong tủ cấy vô trùng hoặc trong phạm vi vô trùng của ngọn lửa đèn cồn
8,Kiểm tra độ vô trùng và bảo quản
- Môi trường sau khi pha chế xong, được đặt ở điều kiện nhiệt độ phòng 24 giờ Sau thời gian này kiểm tra độ vô trùng của môi trường bằng cách quan sát trạng thái môi trường
- Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ mát, hạn chế tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ từ 0-5°C và không đẻ môi trường bị khô Thời gian lưu trữ tối đa là 15 ngày
- Trước khi sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường người ta thường đặt chúng vào 37°C, trong 48-72 giờ Sau đó lấy ra quan sát, loại bỏ các ống có vi sinh vật phát triển và chỉ sử dụng những ống nghiệm, những đĩa petri có môi trường đạt yêu cầu
1V NHỮNG DIEM CAN LUU Y
- Khi pha chế môi trường rắn hoặc bán rắn, thành phần agar trong môi trường có thể bổ sung sau khi điều chỉnh pH của môi trường
- Đối với môi trường rắn hoặc bán rắn, cần phải nấu sôi để làm tan agar hoàn toàn
trước khi phân phối vào dụng cụ chứa
- Khi điều chỉnh pH, cần dùng từng lượng nhỏ các dung dịch điều chỉnh (dung địch NaOH, HCI) để tránh vượt quá pH cần pH môi trường cần được kiểm tra trước và sau khi
hấp tiệt trùng
Š môi
~ Các thao tác phân phối môi trường vào dụng cụ phải nhanh, gọn, khéo léo
trường không dính lên miệng dụng cụ hoặc nút bông và việc phân phối cần thực hiện xong trước khi môi trường bị đông đặc
v BAO CÁO THỰC TẬP
~ Trình bày khái niệm môi trường và phân loại môi trường nuôi
vi sinh vật - Trình bày quy trình pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật
~ Yêu cầu của môi trường trong đĩa petri, ống nghiệm thạch nghiêng và thạch đứng - Giải thích tạo sao không phân phối môi trường vào đĩa petri trước khi khử trùng?
Trang 26Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 25 Bài 3
PHƯƠNG PHÁP NUÔI CÁY VI SINH VẬT
I, NGUYEN TAC
Quá trình nuôi cấy vi sinh vật gồm hai khâi và nuôi, Cấy là những thao tác chuyển vi sinh vật từ môi trường đang sống sang môi trường thuận lợi hơn cho sự phát triển của chúng, Nuôi là quá trình đảm bảo và duy trì những điều kiện thuận lợi nhất cho sự
hoạt động và phát triển của vi sinh vật Hai khâu này luôn gắn bó với nhau trong quá trình
nghiên cứu và ứng dụng vỉ sinh vật
1 Mục đích của việc nuôi cấy
- Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các nguyên liệu và vật phẩm cần nghiên cứu
~ Tiến hành việc nhân giống các vi sinh vật một cách nhanh chóng
- Bảo tồn các giống vi sinh vật thuần khiết
~ Nghiên cứu các đặc tính sinh học và sự phát triển của từng loại vỉ sinh vật
2 Nguyên tắc nuôi cấy vi sinh vật
- Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp
nhiễm các vi sinh vật không mong muốn từ mơi trường ngồi
~ Mơi trường và dụng cụ nuôi cấy đều phải được khử trùng triệt dé
~ Duy trì tốt các điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, độ ảm ánh sáng, oxy ) đễ vi sinh vật
phát triển thuận lợi
II DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHÁT 1 Dụng cụ Tên dụng cụ, thiết R i
STT nhóm, rink viên) Đơnvitính | Số lượng
1 | Giá ông nghiệm Cái I
2_| Ong nghigm 18 Cái 1
3 [Cốc 100ml Cái 3
4 [Cốc 500ml Cái 1
3 |Dencdn Cai 1
6 | Que edy Cai 1
7_| Binh tia Cái 1
Dụng cụ dùng chung
8 TTuẩm Cái 1
9— [Tủ cấy vô trùng Cái 1
Trang 2726 Thực tập Vi sinh vật học
2 Môi trường, hóa chất
~ Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: đã được chuẩn bị ở Bài 2, bao gồm các loại
+ Môi trường cao thịt — peptone: nuôi cấy vi khuẩn
+ Môi trường Hansen: nuôi cấy nắm men
+ Môi trường Czapeck: nuôi cấy nắm mốc - Cồn 96°
3 Chủng giống vi sinh vật
~- Nắm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzea
- Nam men: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces vini
- Vikhuan: Escherichia coli, Bacillus subtilis
4 Nguyên liệu khác
- Giấy lọc
- Bông không thắm - Bông thấm nước
II TIEN HÀNH THÍ NGHIỆM
1, Cấy truyền vi sinh vật trên môi trường lỏng
Cấy truyền là phương pháp lấy vi sinh vật từ ống nghiệm này sang một ống nghiệm khác Trước khi cấy, tiến hành dán nhãn phi: tên loại vi sinh vật ngày cấy vào thành ống nghiệm bên dưới nút ống nghiệm
a) Céy truyén bang pipette Pasteur
- Khir tring pipette Pasteur qua ngọn lửa đèn cồn
ống giống gốc, dùng ngón tay út phải mở nút bông của dng gidng, ho
- Cho pipette Pasteur vào ống giống lỏng để lấy địch vi khuẩn (dịch dâng lên trong
pipette tir tir theo lye mao dẫn), nhanh chóng đặt ngón tay trỏ phải lên đầu pipette, rat
pipette ra khỏi ống, đặt ống giống vào giá
- Cầm ống môi trường mới bằng tay trái, mở nút bằng ngón tay út phải, khử khuẩn
miệng ống, cho pipette vào tới khi đầu pipette chạm vào môi trường và dé chảy ra vài giọt dịch chứa vi khuẩn Rút pipette ra, khử trùng miệng ống, đậy nút
~ Đặt pipette vào bình đựng thuốc sát khuẩn b) Cấy truyên bằng que cấy vòng
Trang 28
Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 27
- Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ
dây cấy
~ Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút Ống nghiệm vào lòng bản tay xoay nhẹ, kéo nút ống nghiệm ra
~ Hở nóng để khử trùng không khí ở miệng hai ông nghiệm
~ Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuân lạc trong ống giống
~ Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa vào ông, môi trường Khi đầu que cấy chạm vào môi trường thì lắc khẽ que cấy cho vi khuân tan trong môi trường ~ Khử trùng lại phần không khí nơi miệng hai ông nghiệm rồi đậy nút lại - Khử trùng lại que cá sau khi da sử dụng xong Chủ ý
~ Nếu ống giống là canh trường lỏng có vi sinh vật thi ding pipette hút canh trường, thay que cấy
~ Thao tác khử trùng ống hút bắt đầu thực hiện ở đầu nhỏ của ống hút sau khi đã
tháo giấy bao gói
Trang 2928 Thực tập Vi sinh vật học
2 Phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch a) Cấy truyền trên ống nghiệm thạch nghiêng
Phương pháp này dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí; gồm các thao tác như sau:
~ Dán nhãn ghi: tên loại vi sinh vật, ngày cấy vào thành ống nghiệm - Sử dụng que cấy đầu tròn thực hiện các thao tác cấy
- Tay trái cầm hai ống nghiệm: 1 ống giống; 1 ống môi trường
- Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây cấy
~ Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút đậy ống nghiệm vào lòng bản tay xoay nhẹ, kéo nút đậy ra
- Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng hai ống nghiệm
- Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống giống
- Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa vào ống môi trường đẻ thực hiện thao tác cấy:
- Hòa giống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm
~ Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu:
+ Hình chữ chỉ
+ Hình vòng xoắn
+ Hình vạch ngang song song
- Khử trùng lại phần không khí nơi miệng hai ống nghiệm rỉ
- Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong
* Đối với nắm mốc hoặc các vi sinh vật đa bào sinh bảo từ khác, khi cấy trên ống
nghiệm thạch nghiêng, dùng que cấy móc vô trùng lấy bào tử từ ống giống, Cầy truyền bảo
tử sang ống nghiệm môi trường mới theo hai cách:
- Cay điểm: cắm ngập đầu que cấy thành ba điểm cách đều nhau trên bề mặt thạch - Cấy gõ: đưa que cây có mang bào tử vào ống nghiệm môi trường, gõ nhẹ lưng que
Trang 30' Công nghệ sinh học & Thực phẩm 29
Hình 3.2 Cáp truyền trên ống nghiệm thạch nghiêng b) Cấy trên Ống nghiệm thạch đứng
~ Phương pháp này dùng để cấy các vi sinh vật ky khí - Sử dụng que cấy đầu nhọn
~ Sau khi lấy giống vỉ sinh vật, dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch hình trụ
= Dam sat day ống nghiệm và đâm thành ba đường: một đường chính giữa, hai ng sát thành Ông tùy yêu câu
~ Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường
Trang 3130 Thuc tap Vi sinh vat hoc c) Cay truyén trén thach dia
- Dung que cay đầu tròn hoặc que trải thủy tỉnh
- Dùng que cấy đầu tròn lấy vi sinh vật băng tay phải theo đúng quy cách đã hướng dẫn ở trên
- Tay trái cầm hộp petri khẽ hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn còn Sau đó đẻ cách đèn côn chừng 1-2 cm, khẽ mở nghiêng một bên hộp (phân hơ lửa) sao cho vừa đủ đề cho que cay vao
- Nhẹ nhàng nhanh chóng lướt que cấy trên mặt thạch theo một trong các kiêu sau:
+ Theo hình zích zắc trên toàn bộ mặt thạch
+ Theo những đường song song
+ Theo hình zích zắc 3 hoặc 4 góc
- Khi dùng que trải, hut sẵn một lượng khoảng 0,1 dịch vi sinh vật nhỏ lên trên bé
Trang 32Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 31
Hình 3.5 Cáp truyền bằng que trải trên thạch đĩa
3 Các điều kiện nuôi cấy của vi sinh vật
~ Nhiệt độ: phụ thuộc vào từng loại vi sinh vật Duy trì sự ồn định của nhiệt độ đó bang tu ui vi sinh vat
6 ẩm: để duy trì độ ẩm, trong quá trình nuôi cần đảm ảo đủ lượng nước khi làm ào phòng nuôi hoặc dé
môi trường Trong kiện cần thiết có thể phun nước vô khuải
nước bốc hơi trong tủ ấm
- Oxy: đối với vi sinh vật hiểu khí, cung cấp thường xuyên và đầy đủ oxy Lớp môi
trường nuôi cấy có độ dày vừa phải Các bình chứa môi trường được lắc thường xuyên
trong quá trình nuôi để cung cấp thêm oxy cho vỉ sinh vật Nếu nuôi cấy trong môi trường
có khối lượng lớn phải tiến hành sục khí thường xuyên hay định kỳ Đối với vi sinh vật ky khí: hạn chế sự tiếp xúc với oxy bằng cách đồ lên bÈ mặt môi trường parafin, dầu vaselin
hoặc trích sâu vào môi trường đặc, nuôi cấy trong bình hút chân không nuôi trong ống
nghiệm đặc biệt, sau khi rút hết không khí và hàn kín lại, đun sôi môi trường trong một thời gian đẻ loại hết oxy Để nguội 45°C Dùng pipette cấy vi sinh vật vào đáy ống nghiệm
Làm nguội nhanh rồi đổ vaselin lên bề mặt để hạn chế sự tiếp xúc với oxy
4, Quan sát vi sinh vật sau khi nuôi cay
Trang 3332 Thực tập Vĩ sinh vật học
- Trong môi trường đặc ở thạch nghiêng: nắm men, vi khuẩn phát triển sẽ tạo nên
vệt nỗi trên mặt thạch trong hay trắng đục Nắm mốc sẽ tạo nên những sợi mảnh từ vết cấy
- Trong môi trường thạch đứng: các vỉ khuẩn ky khí phát triển ở đáy của cột môi
trường
IV NHUNG DIEM CAN LƯU Ý
có bề mặt khô, phẳng Nếu ống môi trường còn đọng nước ng nghiệm, tránh nước làm hon vết cấy
~ Môi trường thạch ph: cần dựng ống mới cấy vào
- Khi tiến hành cấy truyền tránh chạm đầu que cấy dùng để lấy vi khuẩn vào bắt cứ vật gì ~ Nếu địch vi khuẩn cấy truyền rơi xuống mặt bàn cần lau ngay bằng panh kẹp bông thấm cồn hoặc nước sát trùng g có vi sinh vật ở - Khi cấy truyền vi khuẩn, dùng tay trái cầm hai ống nghiệm:
xa và Ống môi trường ở gần người thao tác Trước và sau khi cấy truyền xong phải hơ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn để vô trùng que cấy
V BÁO CÁO THỰC TẬP
- Trinh bay phương pháp cấy truyền vi khuẩn, nắm men, nắm mốc
- Nêu các điều kiện nuôi ủ nắm men và vi khuẩn sau khi gieo cấy
- Dia petri sau khi cấy vi sinh vật nên đặt úp hay ngửa mặt thạch? Giải thích?
- Khi cấy truyền vi sinh vật trên ống thạch nghiêng, giải thích tại sao phải ria que
Trang 34Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 33 Bị PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT VI SINH VẬT BẰNG KÍNH HIẾN VI QUANG HỌC 1.NGUYÊN TÁC 1 Giới thiệu về các loại kính hiễn vi a) Kính hiển vi nền đem
Ánh sáng thường chiếu từ đưới lên, qua rìa của tụ quang nền đen, chiếu hắt vào xung quanh tiêu bản, những tỉa sáng này bị tiêu bản làm khúc xạ rồi đưa vào vật kính Tiêu bản được soi sáng rực trên nền đen, giống như trong phòng tối có một tia sáng mạnh chiều vào, giúp thấy rõ từng hạt bụi trong không khí bị tỉa sáng, chiếu vào Chức năng: quan sát hình thái và đặc tính của một số vi khuẩn mà kính hiển vi thường khó quan sát
5) Kinh hién vi doi pha
Ánh sáng thường bị đổi pha và biên độ dao động bởi cấu trúc đặc biệt của tụ quang kính vật kính và thị kính Chức năng: dùng quan sát rõ nét các cấu trúc nhỏ như tiên mao, các lớp màng
©) Kính hiển vi huỳnh quang
Chùm tia tử ngoại chiếu vào tiêu bản đã nhuộm màu bằng các chất huỳnh quang Trong tế bào, các cấu trúc khác nhau sẽ phát quang với màu sắc khác nhau Chức năng:
quan sát và phân biệt được các cấu trúc khác nhau trong té bao vi sinh vật 4) Kính hiển vi điện tử
Chùm tia điện tử bước song rất ngắn, năng suất phân li rất lớn nên độ phân giải cao giúp phân biệt hai điểm rất gần nhau Chức năng: dùng quan sát virus, cấu trúc phân tử của tế
bao
e) Kính hiển vỉ quang học
Dùng ánh sáng có bước sóng từ 500 nm — 560 nm trong chùm ánh sáng thường đẻ tạo năng suất phân ly lớn giúp phân biệt hai điểm cách nhau khoảng 0,2 um trở lên Hệ thống phóng to của kính hiễn vi quang học gồm hai bộ phận:
Vật kính (quay về phía vật quan sát) và thị kính (quay về phía mắt nhìn) Mỗi bộ
phân này là một hệ thống thấu kính hội tụ phức tạp, mẫu vật cần quan sát AB được đặt trước
Trang 3534 Thực tập Vi sinh vật học
'Vật kính b Mat
Hình 4.1 Nguyên tắc quang học của kính hiển vi
Trang 36Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 35
~ Hệ thống cơ học: giá kính gồm chân kính, thân kính, trụ đỡ và xoay thị kính, 6
gắn và xoay vật kính, bản kính, thanh trượt đi chuyển tiêu bản, ốc đi chuyên thanh trượt, kẹp giữ tiêu bản, ốc di chuyển tụ quang kính, ốc điều chỉnh sơ thô cấp, ốc điều chỉnh thứ cấp (vi cắp)
- Hệ thống quang học gồm: thị kính, vật kính, tụ quang kính, màn chắn sáng, nguồn chiếu sáng (đèn điện chiếu sáng và/ hoặc kính chiếu sáng) Ngoài ra, ở kính dùng nguồn
chiếu sáng là đèn điện thì có thêm bộ phận cung cấp điện như phích cắm, dây điện, cầu chi, mạch điện (trong chân kính) và nút điều chỉnh cường độ chiếu sáng
b) Nguyên tắc hoạt động của kính hiễn vỉ quang học
- Vật kính là hệ thống quang học phức tạp gồm một số thấu kính, trực tiếp phóng
đại mẫu vật Các thấu kính sắp xếp theo thứ tự, thấu kính nhỏ ngoài cùng hướng vào tiêu bản có độ phóng đại lớn nhất Độ phóng đại của kính phụ thuộc tiêu cự, tức bán kính cong
của thấu kính Thấu kính càng cong, tiêu cự càng ngắn thì khả năng phóng đại càng lớn
Có hai loại vật kính:
+ Vật kính khô độ phóng đại nhỏ như x4, x10, x15, x40 + Vật kính dầu có độ phóng đại lớn như x90, x100
~ Thị kính cũng có cấu tạo phức tạp, gồm hai thấu kính, một hướng về mắt người
xem, một hướng về vật kính Thị kính phóng đại một lần nữa ảnh đo vật kính thu vào, làm ảnh to lên, xem rõ hơn
Độ phóng đại của kính = độ phóng đại của vật kính x độ phóng đại của thị kính Ví dụ: Độ phóng đại của vật kính: x 100, độ phóng đại của thị kính: x10 Như v: độ phóng đại của kính: 100 x 10 = 1000 lần
Năng suất phân ly của kính quan trọng hơn độ phóng đại, và là tiêu chuẩn chính đẻ
chọn kính hiển vi Năng suất phân ly (độ phân giải) của kính hiển vi là đại lượng cho biết khả năng phân biệt hai điểm của vật quan sát nằm sát nhau Nếu khoảng cách giữa hai
điểm nằm càng sát nhau mà vẫn có thể phân biệt được thì năng suất phân ly của kính càng cao
Khoảng cách này phụ thuộc chiều dài sóng ánh sáng sử dụng và số lượng tỉa sáng
đi vào vật kính, được biểu hiện bằng công thức:
%
2nsinơ
trong đó:
2: độ dài bước sóng phát ra từ mẫu vật;
Trang 3736 Thực tập Vĩ sinh vật học œ: nửa góc mở của vật kính;
2nsinơ: trị số mở của vật kính
- Qua đó, ta thay muốn có độ phân ly cao phải dùng ánh sáng có bước sóng thật ngắn, hoặc dùng vật kính có trị số mở lớn Nếu dùng vật kính có trị số mở 0,65 và soi với
ánh sáng trắng (có bước sóng trung bình a = 0,55 m) thì khoảng cách nhỏ nhất có thé nhìn thấy rõ được là: 0,55 d= —— =0,85 um 0,65 Bảng 4.1 Thông số của vật kính và thị kính
Ký hiệu ghi | Độ phóng đại ( Độ mở | Khoảng cách từ vật | Đường kính thị trường trên vật kính | của vật kính (A) kính đến tiêu bản khi quan sát bằng thị (mm) kính x10 (mm) Vật kính khô 8 x 0,20 8 0.20 8.9] 1,75 10 x 0,25 10 0,25 6,80 40 x 0,65 40 0,65 0,60 0,35 Vật kính dầu _ 90 x 1,25 90 1,25 0,15 0,15 100 x 1,25 100 1,25 0,12
Chiết suất ánh sáng của không khí nhỏ hơn thủy tỉnh, nên tia sáng khi đi qua tiêu bản thủy tỉnh sẽ bị khúc xạ một phần Phần phía ngoài của tia sáng do bị khúc xa nén
không đi vào được vật kính Vật kính có độ phóng đại lớn thì đường kính của thấu kính
càng nhỏ lượng tia sáng đi vào được vật kính rất ít, nên không thấy rõ ảnh Đẻ hạn chế
nhược điểm này ta dùng đầu soi có chiết suất ánh sáng gần bằng thủy tỉnh Thủy tỉnh và
đầu soi được xem như một môi trường đồng nhất Ánh sáng đi qua không bị khúc xạ nên tập trung đầy đủ vào vật kính, giúp xem rõ ảnh
Low High Oil
power power immersion 10 x 40 100 x Đô phóng đai 0.25 0.65 1.25 Đô mở 6.8 mm 5 ta 73mm 42 mm _ Khoang cach lam viéc
Hình 4.3 7ương quan giữa độ phóng đại của vật kính với khoảng cách làm việc từ vật
Trang 38Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 37 Ảnh sảng không bị khúc xã “Thầu kính của vật '
kinh đâu ~ Ảnh sáng bị khúc xạ nếu Không có dâu soi kính
Dầu soi kính Tiêu bản
c—— >
~~ én tw quang
Iris diaphragm "Nguồn sáng
Hình 4.4 Nguyên lý của vật kính dầu II DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHÁT 1 Dụng cụ
STT Ten dung ae Đơn vị tính | Số lượng
1 | Giá ống nghiệm Cái I 2 | Ông nghiệm 18 Cai 1 3 | Cốc 100 ml _— Cái 3 4 |Đèncôn Cái 1L | 5 | Quecấy Cái 1 6_|Binhtia Cái 1 7 | Lame (phiến kính) Tấm 5 8 |Lamelle (ákính) Tấm 3 9— | Phiển kính lõm Tắm I 10_| Kinh hign vi Cái 1
Dung cu ding chung
T1_[ Noi hip cao ap Cai 1
12 | Tủcấy vô trùng Cái 1 2 Hóa chất - Con 96° ~ Dịch xà phòng loãng ~ Dung dịch Xylen 3 Chủng giống vi sinh vật dùng quan sát - Nắm mối
: Aspergillus niger, Aspergillus oryzea
Trang 3938 Thực tập Vĩ sinh vật học - Vi khuan: Escherichia coli, Bacillus subtilis 4 Nguyên liệu khác - Giấy lọc - Bông không thâm - Bông thấm nước II TIEN HANH THi NGHIEM 1 Làm tiêu bản vi sinh vật sống a) Làm tiêu bản giọt ép hoặc ống hút chuyển giống vi sinh vật từ ống nghiệm nuôi cấy lên - Dùng que
tắm phiến kính \ nh vật được nuôi trên môi trường thạch khi làm tiêu bản, nhỏ sẵn
ọt nước muối sinh lý lên phiến kính, sau đó hòa sinh khối vi sinh vật vào giọt nước muối này ụ vỉ
- Đặt lá kính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không tạo thành bọt khí giữa hai
tắm kính, Muốn vậy để một mép lá kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lá kính xuống ~ Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi ở vật kính x10 rồi x40
Chủ ý
~ Nếu giọt địch nhiều quá, tràn ra phần ngoài tiếp xúc của phiến kính và lá kính ta
dùng giấy thấm bớt nước đi
- Nếu cần quan sát tiêu bản lâu thì dùng vazơlin bôi quanh mép lá kính để giọt dich khỏi bị khô
b) Làm tiêu bản giọt treo
Loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, kha nang di động và phản ứng của té bao vi sinh vật với các loại kích thích
có phần lõm hình tròn ở giữa
~ Dùng phiến kính đặc bi
- Bôi vazolin quanh phần lõm của phiền kính
~ Cho 1 giọt canh trường lên giữa lá kính
- Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh trường xuống phía dưới rồi đặt lên
phần lõm của phiến kính,
- Chú ý không để giọt canh trường lan rộng hay chạm vào phần đáy của phần lõm
trên phiến kính
- Đặt tiêu bản lên quan sát trên kính hiện vi ở vật kính x10 rồi x40
Trang 40Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 39 —_—
Hình 4.5 Tiêu bản giọ! ép và tiêu bản giọt treo 2 Sử dụng kính hiễn vi quan sát tiêu bản vi sinh vật sống,
Trước khi sử dụng phải kiểm tra tất cả các bộ phận của kính, dùng khăn mềm đẻ lau các bộ phận của kính (Cứ ý: chỉ lau bên ngồi, khơng tháo rời các bộ phận của kính), để kính ngay ngắn vừa với tấm ngồi, sau dó tiến hành tuân tự các bước tiếp theo để soi tiêu bản Bước 1: Chuân bị kính Cắm điện, bật công tắc kính, điều khiển núm chỉnh ánh sáng ở để kính để có được ánh sáng thích hợp Xoay vật kính nhỏ nhất (vật kính 10x) về trục kính
Bước 2: Đặt tiêu bản vào mâm kính
- Trước khi đặt tiêu bản vào mâm kính, phải chọn mặt phải, mặt trái của tiêu bản Mặt phải của tiêu bản thường có dán lamen, án nhãn (nếu có lamen và nhãn) hoặc làm giảm bớt độ lóa của gương khi dễ nghiêng soi ra ánh sáng (nếu không có lamen, không có nhân)
~ Để mặt phải của tiêu bản lên trên, tay phải mở kẹp tiêu bản, tay trái cằm phía đầu nhãn tiêu bản, đặt tiêu bản vào mâm kính và tay phải thả kẹp giữ tiêu bản ra Tiêu bản được giữ chặt vào xe đầy, trên mâm kính
- Dùng ốc xe đẩy để điều chỉnh sao cho mẫu vật nằm đúng vào trục kính (giữa lỗ mâm
kính)
Chú ý: Có thể dùng điểm sáng của hộp tụ quang để làm điểm chuẩn khi điều chinh
mẫu vật về điểm trục kính, nếu mẫu vật quá nhỏ
Bước 3: Quan sát
Nguyên tắc bất buộc khi quan sát là phải quan sát được ở vật kính có độ phóng đại
nhỏ, rồi mới chuyển sang quan sát ở vật kính có độ phóng đại lớn hơn kể nó
4) Xem tiêu bản ở vat kinh x10