isoymes protein_sinh học phân tử

Những kỹ thuật dựa trên cơ sở Những kỹ thuật dựa trên cơ sở protein protein ISOZYMES ISOZYMES Nội dung Nội dung Giới thiệu về isozymes Giới thiệu về isozymes Thăm dò isozymes Thăm dò isozymes Các thiết bị dùng cho nghiên cứu Các thiết bị dùng cho nghiên cứu Hình ảnh quá trình thực hiện Hình ảnh quá trình thực hiện Phân tích kết quả Phân tích kết quả Những thuận lợi và bất lợi của phương pháp Những thuận lợi và bất lợi của phương pháp Một số ví dụ áp dụng phương pháp này lên một Một số ví dụ áp dụng phương pháp này lên một số đối tượng cụ thể số đối tượng cụ thể Giới thiệu Giới thiệu Thuật ngữ ‘isozyme’ đầu tiên được định nghĩa Thuật ngữ ‘isozyme’ đầu tiên được định nghĩa bởi Markert và Moller năm 1959. bởi Markert và Moller năm 1959. Trong nghiên cứu di truyền quần thể, isozymes Trong nghiên cứu di truyền quần thể, isozymes đã được ứng dụng từ năm 1966 trong nghiên đã được ứng dụng từ năm 1966 trong nghiên cứu cứu Drosophilla Drosophilla và chỉ một vài năm sau cũng đã và chỉ một vài năm sau cũng đã ứng dụng đối với thực vật bậc cao. ứng dụng đối với thực vật bậc cao. Từ đó chúng đã trở thành những chỉ thị di truyền Từ đó chúng đã trở thành những chỉ thị di truyền được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở cả động vật và thực vật. dạng di truyền ở cả động vật và thực vật. Giới thiệu Giới thiệu Isozymes (isoenzymes) là những dạng phân tử Isozymes (isoenzymes) là những dạng phân tử khác nhau về mặt cấu trúc của một hệ enzyme khác nhau về mặt cấu trúc của một hệ enzyme với cùng một chức năng xúc tác. Chúng được với cùng một chức năng xúc tác. Chúng được xem như là những biến dạng xem như là những biến dạng đặc trưng loài đặc trưng loài của của một hệ thống enzyme theo sự phân loại của một hệ thống enzyme theo sự phân loại của ‘Enzyme Commision’. ‘Enzyme Commision’. Isozyme được tạo ra từ sự biến đổi các amino Isozyme được tạo ra từ sự biến đổi các amino acid để tạo ra những thay đổi bên trong cấu trúc acid để tạo ra những thay đổi bên trong cấu trúc không gian (conformation) của những phân tử không gian (conformation) của những phân tử enzyme và vì thế mà dẫn đến sự khác nhau enzyme và vì thế mà dẫn đến sự khác nhau trong chuyển động các phân tử. trong chuyển động các phân tử. Multiple forms of enzymes Multiple forms of enzymes Group Reason of multiplicity Example 1 Genetically independent proteins b Malate dehydrogenase in mitochondria and cytosol 2 Heteropolymers (hybrids) of two or more polypeptide drogenase chains, noncovalently bound b Hybrid forms of lactate dehydrogenases 3 Genetic variants (allelozymes) b Glucose-6-phosphate dehydrogenases in man 4 Conjugated or derived proteins a. Proteins conjugated with other groups Phosphorylase b, glycogen synthase a b. Proteins derived from single polypeptide chains The family of chymotrypsins arising from chymotrypsinogen 5 Polymers of a single subunit Glutamate dehydrogenase of molecular weight 1,000,000 and 250,000 6 Conformationally different forms All allosteric modifications of enzymes Giới thiệu Giới thiệu Việc kiểm định bằng phép điện di (electrophoresis) sự Việc kiểm định bằng phép điện di (electrophoresis) sự biển đổi các amino acid như thế cung cấp một phương biển đổi các amino acid như thế cung cấp một phương tiện để quản lý sự thay đổi bên trong trình tự nucleotide tiện để quản lý sự thay đổi bên trong trình tự nucleotide của gen liên quan. của gen liên quan. Vì thế isozymes có thể đánh dấu những biến động allele Vì thế isozymes có thể đánh dấu những biến động allele tại các vị trí cấu trúc gen đơn giản, như vậy các allele tại các vị trí cấu trúc gen đơn giản, như vậy các allele khác nhau được biểu hiện bằng những isozymes với khác nhau được biểu hiện bằng những isozymes với động thái điện di khác nhau. động thái điện di khác nhau. Những isozymes được quy định bởi những allele khác Những isozymes được quy định bởi những allele khác nhau của cùng một vị trí trên gen là được thiết kế như nhau của cùng một vị trí trên gen là được thiết kế như ‘allozymes’ hoặc ‘alloenzymes’. ‘allozymes’ hoặc ‘alloenzymes’. Isozyme có nhiều ưu điểm quan trọng như những Isozyme có nhiều ưu điểm quan trọng như những chỉ thị di truyền (allozymes) chỉ thị di truyền (allozymes) đặc trưng của chất nền của những hệ thống enzyme đặc trưng của chất nền của những hệ thống enzyme cung cấp cơ sở cho việc kiểm tra những biến động di cung cấp cơ sở cho việc kiểm tra những biến động di truyền ở những vị trí gen cấu trúc đặc biệt; truyền ở những vị trí gen cấu trúc đặc biệt; allozymes thường được biểu lộ cùng ưu thế allozymes thường được biểu lộ cùng ưu thế (codominantly) vì vậy mà những kiểu gen đồng hợp tử (codominantly) vì vậy mà những kiểu gen đồng hợp tử và dị hợp tử có thể phân biệt một cách chính xác; và dị hợp tử có thể phân biệt một cách chính xác; zymograms thường có thể được dịch mã bằng sự dịch zymograms thường có thể được dịch mã bằng sự dịch mã di truyền đơn giản; những hiệu quả lấn át gen là mã di truyền đơn giản; những hiệu quả lấn át gen là hiếm; hiếm; phân tích isozyme là dễ thực hiện và nhiều mô thực vật phân tích isozyme là dễ thực hiện và nhiều mô thực vật và động vật có thể ứng dụng được; và động vật có thể ứng dụng được; kỹ thuật cho phép kiểm tra quần thể nhanh và suy luận kỹ thuật cho phép kiểm tra quần thể nhanh và suy luận kết quả là dễ dàng do số liệu tham khảo nhiều. kết quả là dễ dàng do số liệu tham khảo nhiều. Giới thiệu Giới thiệu Allozymes có chức năng tốt như những chỉ thị di truyền Allozymes có chức năng tốt như những chỉ thị di truyền chuyên biệt cho loài trong xác định khả năng dị hợp, đa chuyên biệt cho loài trong xác định khả năng dị hợp, đa dạng di truyền, sự biệt hoá di truyền và nhưng phép đo dạng di truyền, sự biệt hoá di truyền và nhưng phép đo khác để định lượng những biến động di truyền bên trong khác để định lượng những biến động di truyền bên trong và giữa các quần thể. và giữa các quần thể. Thêm vào đó, allozymes có thể có ích trong việc xác Thêm vào đó, allozymes có thể có ích trong việc xác định các dòng, phân tích nguồn gốc bố, đặc trưng của định các dòng, phân tích nguồn gốc bố, đặc trưng của những nguyên liêu và quần thể đa dạng, những đặc những nguyên liêu và quần thể đa dạng, những đặc điểm nổi bật của sự sinh sản (ví dụ như giao phối giữa điểm nổi bật của sự sinh sản (ví dụ như giao phối giữa những cá thể có quan hệ gần gũi) và hệ quả di truyền những cá thể có quan hệ gần gũi) và hệ quả di truyền thuần hoá hoặc tác động môi trường lên quần thể. thuần hoá hoặc tác động môi trường lên quần thể. Một số hạn chế Một số hạn chế những gen mã hoá những enzymes biểu hiện một ví những gen mã hoá những enzymes biểu hiện một ví dụ không ngẫu nhiên (và nhỏ) của những vị trí cấu trúc dụ không ngẫu nhiên (và nhỏ) của những vị trí cấu trúc gen (có sự loại trừ những enzymes không hoà tan gen (có sự loại trừ những enzymes không hoà tan trong nước và giới hạn cấu trúc tế bào); trong nước và giới hạn cấu trúc tế bào); chỉ những sự thay thế nucleotide mà làm thay đổi chỉ những sự thay thế nucleotide mà làm thay đổi chuyển động electrophoretic của phân tử enzymes là chuyển động electrophoretic của phân tử enzymes là hiển nhiên hiển nhiên khả năng không thể được loại trừ đó là một hoặc cùng khả năng không thể được loại trừ đó là một hoặc cùng band isozyme biểu hiện trong 2 allele khác nhau với band isozyme biểu hiện trong 2 allele khác nhau với sự chuyển động y hệt nhau sự chuyển động y hệt nhau câu hỏi như có phải sự đồng dạng của allozyme là sự câu hỏi như có phải sự đồng dạng của allozyme là sự thích nghi hay trung tính vẫn còn chưa được giải thích. thích nghi hay trung tính vẫn còn chưa được giải thích. Phương pháp thăm dò isozymes Phương pháp thăm dò isozymes Nhiều phương pháp điện di có thể được áp dụng để Nhiều phương pháp điện di có thể được áp dụng để phân tích isozymes. phân tích isozymes. Điện di phương ngang là kỹ thuật này là thường được Điện di phương ngang là kỹ thuật này là thường được sử dụng trong khảo sát quần thể và dễ thực hiện. sử dụng trong khảo sát quần thể và dễ thực hiện. Hai môi trường gel được sử dụng là: polyacrylamide và Hai môi trường gel được sử dụng là: polyacrylamide và tinh bột thuỷ phân (hydrolysed starch). tinh bột thuỷ phân (hydrolysed starch). – Polyacrylamide có độ phân giải cao nhưng là độc tố thần kinh Polyacrylamide có độ phân giải cao nhưng là độc tố thần kinh – Tinh bột là một sản phẩm tự nhiên không độc. Nó kém trong Tinh bột là một sản phẩm tự nhiên không độc. Nó kém trong suốt hơn polyacrylamide, nhưng gel của nó có thể cắt lớp mỏng suốt hơn polyacrylamide, nhưng gel của nó có thể cắt lớp mỏng do vậy mà khuôn mẫu có thể nhuộm để kiểm tra một vài hệ do vậy mà khuôn mẫu có thể nhuộm để kiểm tra một vài hệ enzymes đồng thời. Chiết rút thô có thể trực tiếp đưa vào gel enzymes đồng thời. Chiết rút thô có thể trực tiếp đưa vào gel bằng cách dùng giấy lọc. Trong thực nghiệm, tinh bột chất bằng cách dùng giấy lọc. Trong thực nghiệm, tinh bột chất lượng cao (như loại Toronto starch) là đúng tiêu chuẩn đòi hỏi lượng cao (như loại Toronto starch) là đúng tiêu chuẩn đòi hỏi trong sự phân giải điện di trong hầu hết các trường hợp. trong sự phân giải điện di trong hầu hết các trường hợp. [...]... việc phân tách các phân tử theo trọng lượng và theo kích cỡ nhờ vào dòng điện Dòng điện làm cho các phân tử di chuyển qua các lỗ trong lớp gel Những chất để làm gel phải là những chất đặc biệt để có những lỗ có kích cỡ phù hợp cho phép tách thành những lớp riêng theo kích cỡ và hình dạng Phương pháp thăm dò isozymes Các bước tiến hành Xử lý nguyên liệu Điện di gel tinh bột hay acrylamide Nhuộm mô hoá học. .. thô Những nguyên liệu khác như mô ở tầng phát sinh gỗ, lá hay gai có thể đòi hỏi một qui trình dung giải đặc biệt Nhiều loại mô côn trùng và động vật rất thích hợp cho phân tích isozyme Xử lý nguyên liệu Làm nát mẫu vật một cách cơ học bằng chày nghiền để đạt đến một độ đồng nhất nhất định hay nghiền bằng tay Hút dịch chiết thô ra một cách đồng thời dùng một vài dải giấy lọc 3MM (rộng 2-4mm) Mỗi dải... có kích cỡ phù hợp cho phép tách thành những lớp riêng theo kích cỡ và hình dạng Phương pháp thăm dò isozymes Các bước tiến hành Xử lý nguyên liệu Điện di gel tinh bột hay acrylamide Nhuộm mô hoá học Phân tích kết quả điện di Xử lý nguyên liệu Nguyên liệu thực vật hay động vật: nhiều loại mô có thể được sử dụng để điện di gel Ở thực vật bậc cao, chồi, đầu rễ, hạt, hạt phấn và những nguyên liệu in vitro... và chuyển các lớp cắt đó một cách cẩn thận vào những khay nhuộm riêng Nhuộm gels bằng dung dịch nhuộm, đối với mỗi loại enzymes sẽ có một loại dịch nhuộm riêng, công việc này được tiến hành đồng thời Phân tích phổ enzyme Dung dịch nhuộm Dung dịch nhuộm cho các hệ enzyme chọn lọc: – Stock solutions: 10% MgCl2; 1mg PMS/1ml H2O; NAD,NADP: 2m/ml H2O – Đệm nhuộm: 0.08 M Tris-0.04 M HCl (pH 8.0) Các hình . giữa việc phân tách các phân tử theo trọng lượng và theo phân tách các phân tử theo trọng lượng và theo kích cỡ nhờ vào dòng điện kích cỡ nhờ vào dòng điện Dòng điện làm cho các phân tử di chuyển. vậy mà những kiểu gen đồng hợp tử (codominantly) vì vậy mà những kiểu gen đồng hợp tử và dị hợp tử có thể phân biệt một cách chính xác; và dị hợp tử có thể phân biệt một cách chính xác; zymograms. (conformation) của những phân tử không gian (conformation) của những phân tử enzyme và vì thế mà dẫn đến sự khác nhau enzyme và vì thế mà dẫn đến sự khác nhau trong chuyển động các phân tử. trong chuyển