Khảo sát các kiểu đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể rễ hành ta (allium ascalonicum l ) bằng phương pháp xử lí sốc nhiệt

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÀN THƠ KHOA SƯ PHẠM BỘ MÔN SƯ PHẠM SINH HỌC

KHẢO SÁT CÁC KIỂU ĐỘT BIẾN CẤU TRÚC NHIEM SAC THE RE HANH TA (Allium ascalonicum L.)

BANG PHUONG PHAP XU Li SOC NHIET

LUAN VAN TOT NGHIEP

Chuyên ngành SƯ PHẠM SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn Sinh viên thực hiện

ThS VÕ THỊ THANH PHƯƠNG TRAN TH] HUYNH NHƯ

Lớp: Sư phạm Sinh học K35

MSSV: 3092224

Trang 2

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ

CẢM TẠ

Đê hoàn thành luận văn này, em đã nhận được sự quan tâm và giúp đỡ của Thay C6, gia đình và bạn bè Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến:

- Tất ca các Thầy Cô trong Bộ môn Sư phạm Sinh học, Khoa Sư phạm, trường

Đại học Cần Thơ, những người đã giảng dạy, truyền đạt cho em kiến thức trong suốt 4 năm học

- Cô Võ Thị Thanh Phương người trực tiếp hướng dẫn em thực hiện đề tài, Cô đã tận tình chỉ bảo, cung cấp tài liệu cần thiết, thường xuyên đôn đốc và động viên em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này

- Chú Trương Văn Mục người đã tạo điều kiện để em có thể mượn dụng cụ và

hóa chất trong Phòng Thí nghiệm Sinh lý Động vật

- Tập thể lớp Sư phạm Sinh K35 đã động viên, khích lệ và tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

- Bạn Mai Hải Băng người đã đi cùng, san sẻ vui buồn với em trong suốt thời gian qua

Con xin gửi lời cám ơn đặc biệt cho gia đình, cám ơn Ba Mẹ, anh chị đã vất vả để con có điều kiện học tập tốt nhất

Xin chân thành cảm ơn! Trần Thị Huỳnh Như

Trang 3

TÓM LƯỢC

Đề tài “Kháo sát các kiểu đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể rễ hanh ta (Allium ascalonicum _L.) bang phương pháp xử lí sốc nhiệt” thực hiện tại Phòng Thí

nghiệm Sinh lý Động vật Bộ môn Sư phạm Sinh học, Khoa Sư phạm từ tháng 9 năm

2012 đến tháng 5 năm 2013 Mục tiêu của đề tài là: ¡) Khảo sát ảnh hưởng của sốc

nhiệt đến đột biến cầu trúc nhiễm sắc thể rễ hành ta (Allium ascalonicum L.), ii) Thuc hién 30 tiéu ban hién vi cô định có đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể rễ hành ta (Allium ascalonicum L.), iii) Khao sat các dạng đột biến câu trúc nhiễm sắc thể rễ hanh ta (Allium ascalonicum L.) bang xử lí sốc nhiệt

Thu mau hanh ta (Allium ascalonicum _L.) trong trong cat ẩm, sốc nhiệt theo

phương pháp sốc nhiệt khô hoặc sốc nhiệt ướt, có định trong dung dich Carnoy

biến đổi Rửa và trữ mẫu trong côn 70° Nhuộm mẫu với thuốc nhuộm aceto- carmine 1%, thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời quan sát, đếm số tế bào đột biến và nhận dạng các dạng đột biến cầu trúc nhiễm sắc thể

Kết quả nghiên cứu: Đã khảo sát được ảnh hưởng của sốc nhiệt khô và sốc

nhiệt ướt đến đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể rễ hành ta (Allium ascalonicum L.) Sốc nhiệt là tác nhân gây đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể ở rễ hành ta (Allium

ascalonicum L.) Ca hai phwong pháp sốc nhiệt ướt và sốc nhiệt khô đều có tác

động đến sự bên vững của NST Khi sốc nhiệt cùng một khoảng chênh lệnh nhiệt

độ và trong cùng thời gian như nhau (A, ~ 20°, Ts, = 30 phú), phương pháp sóc nhiệt ướt cho số lượng tế bào đột biến cao hơn phương pháp sốc nhiệt khô Hơn nữa, phương pháp sóc nhiệt ướt tiến hành dễ dàng hơn, rễ hành khi sốc nhiệt ướt

không bị héo, tế bào không bị biến dạng, quan sát rõ NST Các dạng đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể do sốc nhiệt được nhận diện ở rễ hành ta (Allium ascalonicum L.) la mat doan, dao doan, lap doan va chuyén đoạn nhiễm sắc Thực hiện được 30 tiêu bản có đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể rễ hành ta (Allium ascalonicum L.)

Trang 4

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC 0ð) ~ ÔỎ II TOM LUGQC ueccsessssssssssnccscsssssseessssnscsscsssccsscsuscsnscnscenscsscsuscenesscenscsnscsscesscensesees II 0 09/:£7 vo: c vn 0/0 /:87ve;6.ìn 0= VII b)0À45ả000707Ề 7 X (0:09) /90906/0)09.)0)0))0225757 1 1 Đặt vấn đề à- ác kg 1n 11 n1 1 11111 gu ng Hye 1 2 Muc tiGu 46 ti ee cecccccccsscscsessesssessecssessuecescssecsuesssesseessesseesvecssessessesssessesssesees 2

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TAI LIEU

1 Vị trí phân loại của hành ta (A/liưm ascalonicum L.) (Nguyễn Bá, 1978) 3 2 Mô tả chung về hành ta - 2252: 22EE2E271521521127132112111121E 2.1.1 e.eere 4 3 Sơ lược về nhiễm thể

3.1 Số lượng nhiễm sắc thể 22-552 25t222 2 2221221122111271112211 221 cre 5 3.2 Hình thái và kích thước nhiễm sắc thê 2 2+2+z+cs+2zzzxzrxrrxee 6

3.3 Phương pháp nghiên cứu nhiễm sắc thê

4 Đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể - ¿52-52 E3 SE EEE11111211112111111 11211 te 6

4.1 Khái niệm và phân loại . - 2: 52 22+++22++t22E+22EESEExtEExrerrerrkrrerkee 7

4.2 Tác nhân gây đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể - 2-2525: 7 4.3 Biến đổi cấu trúc trên một nhiễm sắc thể -2- 22 2+cxz+s+zzxzxeee 9

ABD MGt nh gai 9

"77 n ố.ẦốỐ 10 La ottda 11

4.4 Biến đổi cầu trúc giữa các nhiễm sắc thê -¿©cccscccccrxrcee 12 4.5 Hệ quả của đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể 2 2++se2cxecez 13 5 Phương pháp nghiên cứu đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể -: - 16

Trang 5

5.1 Xử lí đột biến trước khi cố định ¿©2¿2+:222x++cxxrerxrerrrrerrrree 16 5.2 Cố Gin MAU eceeccsccescecsessessessessssessessessussesssssesssesesssessessssesssesesssesessseeses 17

5.2.1 KAGi nh ne A H 17

“2` 14 n868< Ô.AÔÔÔÚÔồ 17

„NA 57a sẽ 17 5.3 Làm tiêu ban hién vi tam thot ceccccccecccssccsssesssseessecsseessssesssecsseessseeessees 18 5.3.1 Rửa mẫu VG eceececcesessescssescsssescsssssscsecscssssssssussesessusstsssetsassvesesssesseee 18 5.3.2 Bảo quản mẫu VẬP 5-5225 SESEEEEEEEE221122121122111211 211 xe 18 SN na 18

5.3.4 Thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời bằng phương pháp ép

5.4 Chuyển tiêu bản hiển vi tạm thời thành tiêu bản hiền vi cố định 19

SAD, LOGi NUOC nha ga 19

5.4.2 Lam trong mau

SAB DGM MAU coseescsseeecssssecsssesssssssssessssnssessseceenessesusesesscessnesessneeeanneesstees 20 CHUONG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

1 Phương tiện

2 Phương pháp nghiên Cứu .- - -¿- ¿5c 5S E2* BS S 2 E222 re, 21

2.1 Đối tượng thí nghiệm: Rễ hành ta (Alliumu ascalonnicum L ) .- 21

2.2 Bồ trí thí nghiệm -:-22- 2 222 1222112111221221127121111211 11c 21 2.2.1 Chuẩn bị mẫUM 5-5525 SE EEEEEEEE2211211211211211211211211 11 ty 21 2.2.2 TRU MAU ccccscesssecsssssssicssssessssssssessscssssessssssssesssscssusssiesssssssecsssessseeeese 21

2.2.3 Xue li SOC MICE ceeccseccssssssssesssesssssessecssssssiessssssssesssiecssessisesseesssessseeste 21

2.2.4 Có định mẫu và bảo quản mẫu VẬI 2c Set vESEvteEterrrrerxsee 23

2.3 Quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi tam thời và cố định - 24

2.4 Khảo sát các dạng đột biến à0 s22 HE HE 2211112111221Eerree 29

CHUONG IV KET QUA THAO LUẬN

Trang 6

ñ‹ 1 7 30 1.1 Số lượng tiêu bản ¿5:2 22x+2E22221221221221127112212122121 11tr 30 1.2 Chất lượng tiêu bản -2 225 2122215221221271127127111122101 211 xe 30

1.3 Nhận diện các dạng đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể .- +: 30

1N anh 30

IU? 1 8 ẲẲẲhaa ẢẢ.l ỒÔỒÔỒÔ 36

1.3.3 Chuyển OqH 5252 S5< SE 2E E1221121211211211221.212121.11.1 1 xe 37

“7T nne 38 1.4 Anh huong cua sốc nhiệt đến đột biến cấu trúc NST sce-s¿ 39

1.4.1 Phương pháp sốc nhiệt khô

1.4.2 Phương pháp sốc nhiệt HỚP -22+ 25s s2 St 2E EEEEEcEEErrrrrrey 43

VAN\.r:L0ir:):HdadaiidẢÉỀÉẢẼẢẼ 48

2.1 Giai đoạn chuẩn bị mẫu và thu mẫu

2.2 Thời điểm thu mẫu . ::©252522 2212222122312 22112221 221221121 cv 48

QB XU DL MAU nh 48

2.4 Cé dinh va bao quan mau vat

2.5 Thute hin ti8u DAN cccceeesssssesssssessssesssueessssssssseesssseesssieesssessaseesessees 51

Trang 7

DANH SÁCH BẢNG

Bang I1: Sơ đô xuât hiện các sai hình nhiễm sắc thê khác nhau (Pêtrôp, 1976) 15

Bảng 2: Các nghiệm thức theo phương pháp sốc nhiệt khô - s52 22 Bảng 3: Các nghiệm thức theo phương pháp sốc nhiệt ướt -:-:- 23

Bang 4: Nghiệm thức khử nước -¿- + ¿+ 2S 2* 2S 22 nhe 27 Bảng 5: Nghiệm thức xử lí sốc nhiệt theo phương pháp sốc nhiệt khô 39

Bảng 6: Các dạng đột biến cầu trúc NST theo phương pháp sốc nhiệt khô 40

Bang 7: Nghiệm thức xử lí sốc nhiệt theo phương pháp sốc nhiệt ướt 43

Bảng 8: Các dạng đột biến cấu trúc NST theo phương pháp sốc nhiệt ướt 45

Bảng 9: Nhiệt độ, thời gian sốc nhiệt và kết quả - 2 5¿+czccxzszxezzserxee 49 Bảng 10: Thời gian cố định và kết quả - 5-22 22z2£x2Ext2EEcExrrrerrxerkee 50 Bảng 11: Thời gian nhuộm và kết quả

Bảng 12: Thời gian và kết quá tách lammelle bằng đá CO; . - 52

Bảng 13: Thời gian khử nước và kết quả khử nước ở các nghiệm thức 53

Trang 8

DANH SÁCH HÌNH

Hình I: Hành ta (Alliwm ascalonicumt L.) s-c 5c S 5c Set sekkeeeseeseeee 3 Hình 2: Kiểu nhân hành ta (Allium ascalonicum L.)

(http://www.formasigenbiougm.wordpress.COM ) ccccccceeseeesseseseeesseeesseneeseseeeee 6 Hình 3: Sự phát sinh mắt đoạn và sự tiếp hợp giữa nhiễm sắc thé bình thường và

nhiễm sắc thể có sự mắt đoạn * - đoạn bị mắt đi (Muntxing, 197]) 10

Hình 4: Nguồn gốc sự lặp đoạn và sự tiếp hợp giữa nhiễm sắc thê bình thường và nhiễm sắc thể có sự lặp đoạn (Muntxing, 1971) ll

Hình 5: Sự phát sinh dao đoạn và sự tiếp hợp giữa nhiễm sắc thể thường và nhiễm

sắc thể bị đảo (Muntxing, 1971) ¿5222k 2x2221E222211221221 2111.221212 11 Hình 6: Nguồn gốc của sự chuyển đoạn (Muntxing, 1971) - .-: 5-¿ 13 Hình 7: Chu trình cấu - đứt - nối - cầu (http: www.atlasgeneticsoncology.org) 14

Hình 8: Cu hành được sốc nhiệt KhO ee eeeeccsssssseseeeeecessssseeeeeseesssssneeeteseeessaneeses 22

Hình 9: Củ hành được sốc MISE ƯỚIL - SG 22021112112 1 2 111 nh nh nh TH Hy 23

Hình 10: Tráng albumin lên laime 6 + t1 tk như 24

Hình 11: Nhuộm và làm mủn rễ hành - ¿+ 2 ++S++x+S£+E£+E+EE+xezxzzvzxerxcee 25

Hình 12: Thực hiện tiêu bản tạm thời ¿+ 6S 2S key 25

Hình 13: Tiêu bản trên băng đá CO; và thao tác tách lammelle khỏi lame 26

Hình 14: Dãy cồn khử nước - - 22-52222215 25122212712271211 2112112111112 26 Hình 15: Làm trong mẫu 2: 2S22S+2xEE£EE#EEtEEE2EE2EE2EE2E222E22122E22xcrxcrr 28 Hình 16: Dán Baume Canada - - c1 E121 E1 HH HH Hi, 28

Hình 17: Tiêu bản được dán nhãn - (E121 *S 112 12 115 11 111 11x cay 29

Hình 18: Đột biến mất đoạn NST ở kì giữa (X100) (TBTT) -¿- ¿+52 31 Hình 19: Đột biến mắt đoạn NST ở kì giữa (X100) (TBTT) . 5¿ 31

Trang 9

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hình 22: Đột biến mắt đoạn NST ở kì giữa (NST co lại thành vòng tròn) (X40)

Hình 23: Đột biến mất đoạn NST ở kì sau tạo 1 cau chromatid (X40) (TBTT) 35

Hình 24: Đột biến mất đoạn NST ở kì sau tạo 2 cau chromatid (X40) (TBTT) 35

Hình 25: Đột biến mắt đoạn NST ở kì sau tạo nhiềucầu chromatid (X40) (TBTT)36 Hình 26: NST thắt nút hình thành đảo đoạn (X40) (TBTT) . . - 36

Hình 27: NST bắt chéo hình thành chuyển đoạn (X40) (TBITT) -‹- - 37

Hình 28-a: Đoạn NST chữ m ở kì sau (X60) (TBTTT) .- - ¿5.5 Sex s++cx+exss+ 38 Hình 29: Biểu đồ số lượng tế bào đột biến theo phương pháp sốc nhiệt khô 4I Hình 30: NST được xử lí ở 70%C (A,= 40C), Tạy = 30 phút (X40) - 42 Hình 31: NST được xử lf 6 70°C (A, = 40°C), Tạ = 15 phút (X100) - 43 Hình 32: Biểu đồ số lượng tế bào đột biến theo phương pháp sốc nhiệt ướt 44 Hình 33: NST được xử lí ở 10°C (A,= 20°C), Tạ = 30 phút (X60) (TBTT) 47 Hình 34: NST được xử lí ở 0°C (A, = 30C), Tạy = 15 phút (X40) (TBTT) Hình 35: NST đứt đoạn ở kì giữa (X100) (TBTT) -2¿22+22+c2sxszzxez 61 Hình 36: Đột biến mất đoạn NST ở kì sau (X100) (TBTT) cccsscsseescesesseseeeeens 61 Hình 37: Đột biến mất đoạn NST ở kì sau (X100)

Hình 38: Đột biến mất đoạn NST ở kì giữa (đoạn đứt dạng vòng) (X40) 62

Hình 39: Đột biến mất đoạn NST ở kì sau tạo nhiều cầu chromatid (X40) (TBTT) Hình 40: Đột biến mất đoạn NST ở kì sau và kì giữa (X40)

Hình 41: NST thắt nút hình thành đảo đoạn (X40) - 2-22 22 +sc2xsczxczrxczes 64

Hình 42: Đứt đoạn NST ở kì sau (X40): tạo cầu chromatid, đoạn đứt ở giữa hai cực

tế bào (TB TT) ¿5+ 2s EEE12E2115E1211212711211212121110711111111111 1111011 tre 64

Trang 11

CHƯƠNG I

GIỚI THIỆU

1 Đặt vấn đề

Mỗi loài sinh vật có bộ nhiễm sắc thé đặc trưng về hình dạng, số lượng và kích thước Loài ruồi giấm (Drosophila melanogaster) cé 2n = 8, cà chua (Lycopersicum solanum) có 2n = 24 Nhiễm sắc thê có cấu trúc xoắn qua nhiều mức xoắn khác nhau giúp các nhiễm sắc thé có thê xếp gon trong nhân tế bào cũng như giúp điều hòa hoạt động các gen và nhiễm sắc thể có thể dễ dàng di chuyển trong quá trình phân bào (Phạm Thành Hồ, 2004)

Tuy nhiên, do các tác nhân mạnh trong ngoại cảnh (tia phóng xạ, hóa chất, sự

biến đổi đột ngột của nhiệt độ) hoặc những rối loan trong quá trình trao đổi chất

nội bào, dẫn đến sự phân li không bình thường của các cặp NST gọi là đột biến

nhiễm sắc thể Đột biến (mutation), bat nguồn từ chữ Hy Lạp Mutatio, là những

biến đổi trong vật chất đi truyền, nghĩa là biến đổi trong cấu trúc của gen hoặc các biến đổi trong cấu trúc và số lượng nhiễm sắc thể Đột biến tạo nên vô số các biến đị, làm tăng tính đa dạng trong sinh giới, là cơ sở của các quá trình chọn lọc Trong quá trình tiễn hóa lâu dài của sinh giới, thông qua chọn lọc nhân tạo con người giữ

lại những cá thể có nhiều đặc điểm quí, hoặc có lợi tạo nên vô số giống vật nuôi

cây trồng mới Đột biến này thực chất là sự sắp xếp lại những khối gen trên và giữa các NST, duoc phát hiện nhờ phương pháp nhuộm băng NST (Khuất Hữu Thanh,

2006)

Việc nghiên cứu đột biến nhiễm sắc thể sẽ giúp khảo sát được các kiểu thay đổi kiểu nhân của loài Mặt khác, nghiên cứu này còn giúp phát hiện loại đột biến cấu trúc nhiễm sắc thê nào làm hỏng các gen, làm mắt cân bằng gen và tái cấu trúc lại các gen trên nhiễm sắc thể và gây hại cho thể đột biến trên cây trồng Ngoài ra, khi

nghiên cứu đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể còn phục vụ cho nghiên cứu về tiễn hóa

vì các dạng đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể đều góp phần tạo nên nguồn nguyên liệu cho quá trình tiến hóa

Trang 12

Hiện nay đã có một số nghiên cứu về kiểu nhân như: lập kiểu nhan cia Allium fistulosum L trong nuôi cay mé, kiéu nhan cua Allium sativum L (Levan, 1935;

Mensinkai, 1939; Cortes et al, 1983; Wajahatullah va Vahidy, 1990), Allium cepa

L (Tran Thi Minh Hang, 2004), kiéu nhan cua mét sé loai lai gitta Allium wakegi

L va Allium ascalonicum L (Pham Thi Minh Phuong, 2009), Allium wakegi L va

Allium fistulosum L., nghiên cứu đột biến cấu trúc nhiễm sắc thế trên rễ hành hoa

(Allium fistulosum L.) (Nguyễn Ngọc Diệp, 2008) và một nghiên cứu gần đây có

nghiên cứu về kiêu nhân của hành ta (Allium ascalonicum L.) (Nguyén Dire Lap, 2012) Những nghiên cứu này là cơ sở cho nghiên cứu đột biến cấu trúc nhiễm sắc

thé hanh ta (Allium ascalonicum L.) Mặc dù vậy nhưng vấn đề nghiên cứu về đột

biến cấu trúc nhiễm sắc thế rễ hành ta (Allium ascalonicum L.) bang xử lí sốc nhiệt chưa phổ biến ở Việt Nam Bên cạnh hạn chế này, việc giảng dạy ở bậc Đại học,

Cao đẳng và ở các trường phổ thông hiện nay vẫn còn thiếu tiêu bản hiển vi cố định về đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể Mặt khác, hành ta là đối tượng được sử dụng nhiều trong các bài thực hành ở phố thông vì giá thành rẻ, dễ tìm, có số lượng nhiễm sắc thể không quá lớn nên dễ quan sát những biến đổi của nhiễm sắc thẻ

Chính vì những lí do trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Kháo sát các

kiểu đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể rễ hành ta (Allium ascalonicum L.) bang xu li sốc nhiệt” nhằm đưa ra những kết luận ban đầu về các kiểu đột biến cấu trúc nhiễm

sắc thé ré hanh ta (Allium ascalonicum L.), lam tài liệu phục vụ giảng dạy và học tập cho các trường phổ thông, Cao đẳng và Đại học

2 Mục tiêu đề tài

- Khảo sát ảnh hưởng của sốc nhiệt đến đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể rễ hành

ta (Allium ascalonicum L.)

- Thực hiện 30 tiêu bản hiển vi cố định có đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể rễ hanh ta (Allium ascalonicum L.)

- Khảo sát các dạng đột biến cấu trúc nhiễm sac thé ré hanh ta (Allium

ascalonicum L.) bang xử lí sốc nhiệt

Trang 13

CHUONG II

LUQC KHAO TAI LIEU

1 Vị trí phân loại của hành ta (Allium ascalonicum L.) (N guyen Ba, 1978) Gidi: Plantae Nganh: Magnoliophyta (Ngoc lan) Lớp: Liliopsida (Một lá mầm) Bộ: Liliales (Hành) Họ: Alliaceae (Hành)

Chi: Allium (Hanh)

Trang 14

2 Mô tả chung về hành ta

Ở nước ta trồng nhiều cây trong họ hành làm gia vi nhu: Hanh tay (Allium cepa L.), hanh ta (Allium ascalonicum L.), toi tay (Allium porrum L.), toi ta (Allium sativum L.), he (Allium tuberosum Rottll Et Spreng.)

Hanh ta 1a cay thao sống dai, cao 15 - 50 cm, hành to 2 - 3 cm, có cạnh, vây mỏng như giấy, thường có màu đỏ hay màu trắng Lá hình trụ nhọn, rỗng, tròn,

màu xanh mốc Cụm hoa dạng tán ở đầu một cán cao 20 - 50 cm, rộng; tán hoa

hình cầu Bao chung hình bẹ, trắng Hoa có 6 phiến hoa rời, màu trắng, hường hay

tim tím; cuống hoa 1 - 1,5 cm (Hoang Thị Sản, 2009)

Cây được trồng làm rau ăn từ lâu đời; thường trồng ở rẫy và ở vùng đồng bằng Cây chịu được lạnh về mùa đông Vào tháng 7 - 8, lúc lá khô, người ta đào lấy củ đem phơi khô, rồi để trong bóng mát

Củ hành cũng chứa axit malic, phytin, các chat sulfid va tinh dầu chứa allicin Thường dùng làm gia vị: Lá dùng ăn sống hoặc xào nấu với các loại rau, thịt, củ dùng xào nấu Nhân dân ta thường dùng củ hành muối làm dưa ăn, nhất là vào dịp Tết nguyên đán Trong dưa hành, có nhiều loại men và axit lactic có tác dụng ngăn cản quá trình lên men thối ở ruột giúp cho cơ thể tránh được đây hơi, nhiễm độc Trong y học dân gian, thường dùng hành chữa thương hàn trúng phong, ác khí, nhức đầu lạnh nóng; mắt mờ tai điếc, thé nuc huyết, đàn bà thai động vú sưng, trẻ em trúng ác và sưng thũng

Biên độ nhiệt sinh lý của cây trong khoảng 1 - 45C Thực vật nói chung và hành ta nói riêng có khả năng khác nhau về tính chịu nóng Nhiệt độ cao gây ảnh hưởng lớn đối với co thé vì nó gây ra sự kết tủa protêin Thực vật ưa nhiệt bị hư hại nghiêm trọng hoặc thậm chí chết ở nhiệt độ dương thấp Nhiệt độ thấp làm tăng

quá mức độ nhớt của tế bào chất (Trần Đăng Kế và Nguyễn Như Khanh, 2000)

3 Sơ lược về nhiễm thế

Theo Phan Cự Nhân (2004), sự sống của tế bào trong cơ thể có tính chất chu kì Các pha của tế bào được lặp lại trong mỗi chu kì, kế từ lần phân chia này đến lần phân chia khác của tế bào Nghiên cứu cấu tạo nhân của tế bào của các loài khác

Trang 15

nhau đã cho thấy là bộ nhiễm sắc thể trong nhân biểu hiện rõ nhất là ở kì giữa của quá trình phân bào nguyên nhiễm hay nguyên phân (mitosis), có độ dày lớn nhất, nhuộm màu nhanh nhất, dễ nhìn thấy dưới kính hiển vi quang học Ở trạng thái này người ta có thể dé dàng đếm và nghiên cứu hình dạng, kích thước và đặc điểm từng thể nhiễm sắc

3.1 Số lượng nhiễm sắc thế

Các phương pháp phân tích tế bào học đã cho phép qua khảo sát thực nghiệm, xác định rằng số lượng và cấu trúc nhiễm sắc thể là đặc trưng cho loài sinh vật, day

là kết quả quá trình tiến hóa lịch sử lâu đời của từng loài

Người ta thấy rõ nhiễm sắc thể là sản phẩm của sự tiến hóa có số lượng đặc trưng cho từng loài Ở người số nhiễm sắc thể ổn định là 46 Ở một loài giun tròn chỉ có 2 nhiễm sắc thể, nhưng ở một số giáp xác lại đến 200 Ở một loài Paramecium có 500 nhiễm sắc thể Một loài phóng xạ trùng vô cùng bé nhỏ, thì số nhiễm sắc thể lại đến 1600

Do đó, các loài sinh vật khác biệt nhau về mặt tiến hóa, không phải là về số

lượng bộ nhiễm sắc thể, mà chủ yếu là về ban chat các nhân tố, vật chất di truyền

chứa trong bộ nhiễm sắc thé

về mặt số lượng, đặc tính của nhiễm sắc thể trong tế bào soma của các loài sinh

vật nhất là sinh vật bậc cao thường là lưỡng bội và có tính chất cặp đôi (2n), số này được tạo thành do sự kết hợp hai tế bào sinh duc (giao tử) có số nhiễm sắc thé don bội (n) Ở người (Homo sapiens sapiens), 2n = 46 và n = 23; lúa mi (Triticum

aestivum), 2n = 42 van = 21,

Khái niệm bộ nhiễm sắc thể gắn liền với số lượng thực, ôn định, bình thường (không phải ở đạng đột biến) các nhiễm sắc thể của từng loài, có trong tế bao soma (lưỡng bội), trong tế bào sinh dục (đơn bội) (Phan Cự Nhân, 1981)

Trang 16

line 4 5 6 7 8

Hình 2: Kiểu nhân hành ta (Allium ascalonicum L.) (http://www.formasigenbiougm.wordpress.com )

3.2 Hình thái và kích thước nhiễm sắc thể

Theo Phan Cự Nhân (2004), hình thái nhiễm sắc thể cũng đặc trưng cho từng loài, được xác định rõ nhất ở kì giữa và các giai đoạn đầu của kì sau trong phân bào nguyên nhiễm, khi mà các nhiễm sắc thể ở vào giai đoạn kết xoắn, co ngắn, mập lên và phân bố trên mặt phẳng xích đạo Thê nhiễm sắc có hình dạng khác nhau và

kích thước khác nhau giữa các loài, hình que, hình sợi, hình hạt, thang, uốn cong, Trên cơ sở các sai khác về hình dạng, kích thước, số lượng bộ nhiễm sắc thể mà

người ta xây dựng tiêu chuẩn phân loại mới các loài

Mỗi loài được đặc trưng bởi một kiểu nhân (Karyotype) riêng

Khái niệm kiểu nhân nói lên số lượng của bộ nhiễm sắc thế, đồng thời cả hình

dạng, kích thước các nhiễm sắc thé,

3.3 Phương pháp nghiên cứu nhiễm sắc thế

Theo Trần Công Khánh (1980), chỉ có thể quan sát nhiễm sắc thể ở những tế bào non đang phân chia của mô phân sinh Ở đó quá trình phân chia tế bào diễn ra phức tạp, mà chủ yếu là sự phân chia nhân tế bào

Theo Trần Tú Ngà (1892), nhiễm sắc thể mỗi loài sinh vật đều có đặc điểm hình thái và kích thước xác định Để nghiên cứu hình thái nhiễm sắc thể, người ta chọn những tế bào đang phân chia ở giai đoạn trung kì (kì giữa) Đây là lúc nhiễm sắc thể ngắn nhát, lớn nhất và tập trung nhất trên mặt phẳng xích đạo của tế bào

4 Đột biến cấu trúc nhiễm sắc thé

Theo Phan Cự Nhân (1978), nhiễm sắc thé là cơ quan đi truyền có tính chất ổn định đặc trưng cho từng loài, nhưng vẫn bị biến đổi dưới các yếu tố tác động của

Trang 17

môi trường ngồi cũng như mơi trường trong Đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể có thể phát sinh trong tự nhiên hoặc được gây nhân tạo bằng các tác nhân ảnh hưởng vật lí, hóa học và sinh học, dẫn đến những biến đổi hoặc sai hình, biến loạn của nhiễm sắc thể, gây nên các hậu quả di truyền kiểu hình

4.1 Khái niệm và phân loại

Đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể là những biến đổi trong cấu trúc của từng

nhiễm sắc thế hoặc của toàn bộ nhiễm sắc thể có thể quan sát, phát hiện được dưới

kính hiển vi Đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể đã được nghiên cứu nhiều trên động vật, thực vật, vi sinh vật Sự kiện khám phá ra hiện tượng đột biến nhiễm sắc thê đã cho phép con người đi sâu nghiên cứu một số mặt trong biến dị di truyền và trong tiến hóa của sinh vật Đột biến cấu trúc nhiễm sắc thê có thể xảy ra trong từng nhiễm sắc thể hoặc giữa các nhiễm sắc thế cùng nguồn với nhau (Phan Cự Nhân,

1978)

Đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể có nhiều tên gọi khác nhau: biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể (changes in chromosomal structure), sai hinh nhiém sắc thể (chromosomal aberation), cấu trúc lại nhiễm sắc thé (chromosomal recontruction)

Theo Guliaev (1975), đột biến cấu trúc nhiễm sắc thế chỉ xảy ra trong giới hạn

một nhiễm sắc thể gồm có các dạng: mat hay thiéu đoạn (tận cùng của một cánh —

terminal delection, hoặc ở cánh giữa — deficiencies hay intercalary or intertitral delection), lặp đoạn (duplication), đảo đoạn (invertions) và chuyên vị trí một đoạn (insertions hoac transposition)

Đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể ngoài giới hạn một nhiễm sắc thế gồm: chuyên đoạn (translocations), lặp đoạn do trao đổi chéo không cân xảy ra giữa hai nhiễm sắc thê tương đồng (khác với lặp đoạn do trao đổi chéo không cân giữa hai nhiễm

sắc tử chị em của một nhiễm sắc thể kép)

4.2 Tác nhân gây đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể

Theo Khuất Hữu Thanh (2006), nhân tố gây đột biến (mutagen) gồm các nhân tố vật lí (tia phóng xạ, tia gamma, tia X, nhiệt độ, ), nhân tố hóa học (các hợp

chất hóa học như axit nitơ, các chất akyl hóa, các chất acridin, ) và nhân tố sinh

Trang 18

học Các nhân tố gây đột biến có thể làm tăng tần số đột biến của sinh vật lên 10

đến 100.000 lần

Nhiệt độ tăng hoặc giảm dần trong giới hạn ít ảnh hưởng đến tần số đột biến Sốc nhiệt hoặc làm thay đổi nhiệt độ một cách đột ngột, nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn mức trung bình đột ngột có hiệu quá gây đột biến Nguyên nhân do mỗi cơ thể sinh vật có cơ chế nội cân bằng, giữ cho hoạt động sinh lí của tế bào không bị thay đổi khi nhiệt độ thay đổi Khi bị sốc nhiệt cơ chế tự bảo vệ của tế bào không khởi động kịp, gây các chấn thương trong bộ máy di truyền của tế bào, gây biến tính không thuận nghịch của các phân tử DNA, xuất hiện các biến đổi trong cấu trúc di

truyền của tế bào tạo nên các đột biến (Khuất Hữu Thanh, 2006)

Khi nhiệt độ môi trường thay đổi, thực vật sẽ phản ứng lại một cách đặc thù Thực vật là sinh vật biến nhiệt nên nhiệt độ môi trường ảnh hưởng đến hoạt động sống của cây Biên độ nhiệt sinh lí của thực vật là 1C — 45C (cây chịu nóng hay

chịu lạnh có biên độ nhiệt khác) Theo Nguyễn Đình Sâm (1995), các hoạt động

sinh học chỉ giới hạn trong khoảng 50°C (0°C - 50°C) Phía trên khoảng giới hạn này là nhiệt độ làm protêin biến tính, còn phía dưới là nhiệt độ làm nước đóng

băng Quá trình đóng băng do các tỉnh thể phá vỡ vách tế bào rồi giết chết tế bào

Khi gặp điều kiện bất lợi về nhiệt độ tế bào sẽ hình thành cơ chế tự bảo vệ Nhưng khi quá ngưỡng chịu đựng dẫn đến môi trường nội bào sẽ xảy ra một số biến đối nhất định Khi gặp nhiệt độ cao dẫn đến kết đông protein sẽ làm thay đổi

môi trường nguyên sinh chất Đa số cây không chịu được nhiệt độ 50°C kéo dai

Nhiệt độ cao làm phá hủy cấu trúc các bào quan dẫn đến chấn thương bộ máy di

truyền

Nhiệt độ cao ảnh hưởng đến tế bao:

- Giảm tính bền vững của màng và protein - Tính lỏng cao làm thay đổi cầu trúc màng

- Tăng nhiệt độ nội bào từ đó làm tế bào tổn thương

- Mang sinh chất bị tổn thương, tăng tính ngoại thấm từ đó làm thất thoát dinh dưỡng của tế bào

Trang 19

- Ảnh hưởng đến màng sinh chất, các bào quan, các quá trình sinh lí trong tế bào, tính lỏng kém làm protein hoạt động không bình thường và hàng loạt các biến đổi kéo theo Cuối cùng làm cho môi trường nội bào bắt ôn định (http://elearning

heuuni.edu.vn)

Tóm lại nhiệt độ thấp cũng như nhiệt độ cao gây hại cho cây do chúng tạo ra sức ép vào tế bào chất Nhiệt độ cao làm biến tính protêin và từ sự biến tính này gây ra chất độc Cả hai cực nhiệt thấp và nhiệt cao đều chủ yếu làm hại đến cấu trúc tế bào (Nguyễn Đình Sâm, 1995)

4.3 Biến đối cấu trúc trên một nhiễm sắc thé

Sai hình nhiễm sắc thể liên quan đến sự đứt đoạn của nhiễm sắc thể Có khi một nhiễm sắc thể bị đứt ra quá hai đoạn và sau đó được nói lại nhưng không giữ cấu trúc cũ dẫn đến nhiều kiểu đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể khác nhau

Các đoạn hoặc vòng tròn đứt rời không tâm động thường bị mắt đi trong phân bào Có thể xảy ra trường hợp nhiễm sắc thể có hai tâm động, khi phân bào sẽ bị

kéo căng ra hai đầu thành cầu chromatid và sau đó bị đứt ra không đều tạo ra một

cái mắt đoạn, cái kia tăng đoạn (Phạm Thành Hồ, 2004)

4.3.1 Mất đoạn

Sự thiếu một đoạn nhiễm sắc thể gồm hai loại: mất đoạn (delection) ở giữa nhiễm sắc thể và mắt đỉnh (defiency) (Phạm Thành Hồ, 2004)

Theo nghiên cứu của Xoanson và et al (1977), có thể xác định vị trí của các thiếu đoạn một cách khá chính xác bằng cách so sánh cấu trúc đĩa của nhiễm sắc

thé bình thường và chiếc tương đồng của nó có mắt một đoạn nào đó

Trang 20

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ a a a a alfa b bg b gq b € b\\b S jQ sa id le 6c e ° e e le A B Cc D E F

Hình 3: Sự phát sinh mat đoạn và sự tiếp hợp giữa nhiễm sắc thể bình thường và nhiễm sắc thể có sự mất đoạn * - đoạn bi mat đi (Muntxing, 1971)

Trong nhiễm sắc thể ban đầu abcde (hình 3A) hình thành một cái nút (hình 3B) Ở điểm mà các sợi của nhiễm sắc thế tiếp xúc với nhau, xảy ra sự đứt và sự kết hợp theo một trật tự mới do đó hình thành hai nhiễm sắc thể mới: một nhiễm sắc thê

hình que do sự mat doan (thiéu doan cd) va mét nhiém sắc thé hình vòng (cd) (hình

3C) nhiễm sắc thể này mất đi bởi vì nó thiếu tâm động Tuy nhiên, trong những trường hợp khác có thê xuất hiện những nhiễm sắc thể vòng có các tâm động và có khả năng phân li về hai cực khi các tế bào phan chia

Trong một nhiễm sắc thể mới khác, tâm động được biểu diễn dưới dạng một

vòng nhỏ (hình 3E) Ở bên phải ta thấy sự tiếp hợp giữa nhiễm sắc thế bình thường và nhiễm sắc thể mới phát sinh mắt đoạn (hình 3F) Những phần tương đồng của hai nhiễm sắc thể tiếp hợp với nhau nhưng ở chỗ mất đoạn nhiễm sắc thể bình

thường bắt buộc phải hình thành cái nút (Muntxing, 1971)

4.3.2 Lặp đoạn

Các đoạn của nhiễm sắc thể có thé tăng lên bằng nhiều cách khác nhau Đoạn lặp có thể ở cạnh nhau, xa nhau trên cùng một nhiễm sắc thể hay ở vào các nhiễm sắc thể khác (Phạm Thành Hỏ, 2004)

Hai nhiễm sắc thể tương đồng (abcde) cắt chéo nhau (hình 4B), sau đó điểm tiếp xúc của chúng bị đứt (hình 4C) và bốn đầu cùng phát sinh do đứt lại tố hợp với nhau Kết quả là xuất hiện hai nhiễm sắc thể mới: một trong số chúng (abe) là một sự mất đoạn còn nhiễm sắc thé kia (abcdcde) là một sự lặp đoạn trong đó đoạn cd lặp hai lần (hình 4D)

Trang 21

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ a a b b b c c a b AI > _ e e e Hình 4: Nguồn gốc sự lặp đoạn và sự tiếp hợp giữa nhiễm sắc thé bình thường và nhiễm sắc thể có sự lặp đoạn (Muntxing, 1971)

Trang 22

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường Đại học Can Thơ

Đảo đoạn xảy ra lúc đoạn trong đứt đi quay 180” rồi được nối lại

Sự hình thành cái nút giống với cái nút đã trình bày trong phần mất đoạn cũng có thể dẫn tới sự phát sinh đảo đoạn Điều đó được biếu diễn như sau:

Sơ đồ tận cùng bên phải chỉ rõ sự tiếp hợp giữa nhiễm sắc thể thường và nhiễm sắc thể bị đảo (hình 5F) Để cho các đoạn tương đồng của nhiễm sắc thể khi tiếp hợp trùng lên nhau hoàn toàn, nhiễm sắc thể bị đảo phải hình thành cái nút, còn nhiễm sắc thể kia tạo thành chỗ lỗi ra bao quanh cái nút đó

Một nhiễm sắc thể sau khi hình thành một nút chéo (hình 5B) thì bị đứt tại 2

điểm tận cùng của nút (hình 5C) va sau đó được nối lại (hình 5D), nhưng không theo các vết đứt ban đầu Có hai dạng đảo đoạn: Đảo đoạn mang tâm động là dạng

đảo đoạn mà tâm động nằm bên trong đoạn bị đảo, đảo đoạn không mang tâm động

là dạng đảo đoạn mà tâm động nằm ngoài đoạn bị đảo (hình 5) Đảo đoạn không

mang tâm không làm thay đối vị trí của tâm động, còn đảo đoạn mang tâm thì làm

chuyển địch vị trí của tâm động trên nhiễm sắc thể

Nhận biết những sự đảo đoạn hơi khó khăn hơn là những sự chuyển đoạn Tuy nhiên ở những cá thể có một nhiễm sắc thể bình thường và một nhiễm sắc thể bị đảo cũng xuất hiện những sự rối loạn tế bào đặc trưng (Muntxing, 1971)

Xoanson (1977) cũng cho rằng khó mà phát hiện được các đảo đoạn nhỏ, bằng

phép tế bào học cũng như phép di truyền học 4.4 Biến đối cấu trúc giữa các nhiễm sắc thế * Chuyển đoạn

Chuyên đoạn là sự trao đổi các đoạn giữa các nhiễm sắc thể không tương đồng Chuyển đoạn liên quan đến nhiều nhiễm sắc thể khác nhau cùng đứt đoạn rồi sau đó trao đổi đoạn đứt với nhau Trao đổi đoạn có thể xảy ra trong đôi nhiễm sắc thé tương ứng (thường khác chức năng) ví dụ giữa các nhiễm sắc thê khác đôi

Sự chuyên đoạn thuận nghịch (reciprocal) xảy ra do sự trao đổi các đoạn giữa hai nhiễm sắc thê không tương đồng (Phạm Thành Hồ, 2004)

Trong trường hợp này, các đoạn thuộc vào những nhiễm sắc thể khác nhau thì đổi chỗ với nhau Điều này có thể xảy ra do sự tiếp xúc giữa hai nhiễm sắc thể

Trang 23

không tương đồng; khi đó ở một điểm bất kì đã phát sinh những chỗ đứt; sau đó, những đầu cùng đã đứt đi của các nhiễm sắc thể được nói lại với nhau theo kiểu mới a f b ơ h c d i e i

Hình 6: Nguồn gốc của sự chuyén doan (Muntxing, 1971)

Theo thường lệ, những dị hợp tử tương tự về sự chuyển đoạn đều có tính sinh

san thấp đi (Muntxing, 1971)

Hình 6 trên cho thấy rằng sự trao đối chéo như thế dẫn tới sự hình thành những nhiễm sắc tử gọi là nhiễm sắc tử hai tâm và những đoạn không tâm Các đoạn không tâm thì thiếu tâm động còn các nhiễm sắc tử hai tâm thì có hai tâm động nằm ở những đầu cùng đối lập của nhiễm sắc tử

Trong quá trình phân bào, sớm hơn hoặc muộn hơn thì nhiễm sắc tử hai tâm cũng sẽ bị đứt và đoạn không tâm bị mắt đi (Muntxing, 1971)

4.5 Hệ quá của đột biến cấu trúc nhiễm sắc thế - Thay đổi hình thái nhiễm sắc thể

Theo Phạm Thành Hồ (2004), các đột biến cấu trúc đều có thể làm thay đổi hình thái nhiễm sắc thể Các mất đoạn hay lặp đoạn, nếu giao tử sống trong một số trường hợp có thê phát hiện bằng tế bào học các thay đôi kích thước của nhiễm sắc thể (hoặc thay đôi đặc tính các vệt đối với nhiễm sắc thể khổng lồ ở ruồi giấm) Đảo đoạn thường không làm thay đổi chiều dài của nhiễm sắc thể, nhưng đảo đoạn có tâm động (pericentric) thì vị trí tâm động có thể thay đổi đáng kẻ

Trang 24

Chuyên đoạn có thể làm thay đổi cấu trúc của nhiễm sắc thể cả về mặt di truyền và hình thái Ngoài ra, theo Phạm Thành Hồ (2004), nhiễm sắc thể có thể có một số dạng thay đổi hình thái khác

- Chu trình cầu - đứt - nối - cầu

Kích thước của nhiễm sắc thể có thể thay đối trong mỗi lần phân bào nếu bị gãy Sự sao chép tiếp theo của nhiễm sắc thê gãy, các đầu gãy của các chromatid di

chuyển vào các cực đối nhau, cầu được tạo ra Cầu sẽ bị gãy ở một điểm nào đó

dọc theo chiều dài và chu trình được lặp lại Trình tự của các sự kiện nối tiếp đó được gọi là chu trình cầu - đứt - nối - cầu (bridge - breakage - fusion - bridge cycle) Một số mô khảm (mosaic tissue) có thể liên quan đến chu trình này (Phạm Thành Hỏ, 2004)

Hình 7: Chu trình cấu - đứt— nối — cầu (http: www.atlasgeneticsoncology.org)

- Các nhiễm sắc thể vòng tròn

Theo Phạm Thành Hỗ (2004), các nhiễm sắc thể không phái lúc nào cũng hình que Các nhiễm sắc thể vòng tròn có thể ngẫu nhiên phát hiện ở động vật và thực vật Nếu chỗ đứt xây ra ở mỗi đầu của nhiễm sắc thể, các đầu gãy có thể nối lại thành vòng tròn Nếu các đoạn ngắn không tâm động nối lại nhau, chúng sẽ nhanh chóng bị mắt trong phân bào

Nếu có một trao đổi chéo xảy ra giữa các vòng tròn tương đồng thì ở kì sau sẽ tạo ra câu đôi

Trang 25

* SO DO XUAT HIEN CAC SAI HINH NHIEM SAC THE

Trang 26

Tóm lại, đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể gây nên nhiều loại biến đổi như thay đổi kiểu hình, thay đối nhóm liên kết, hay hiệu quả vị trí; có thể ảnh hưởng đến tiếp hợp trong giảm phân I và thường đưa đến bắt dục với một tỉ lệ nhất định Các đột biến câu trúc nhiễm sắc thể có ý nghĩa tiến hóa nhất định, chúng tham gia vào các cơ chế cách ly giữa các loài (Phạm Thành Hỏ, 2004)

Theo Đỗ Lê Thăng (2007), các sai hình lớn có thể phát hiện được bằng cách kiểm tra tiêu bản nguyên phân của nhiễm sắc thé, còn các sai hình nhỏ rất khó phát hiện phải nhờ vào các kĩ thuật khác như phân tích nhiễm sắc thể khổng lồ hoặc kĩ thuật phân tử

5 Phương pháp nghiên cứu đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể 5.1 Xứ lí đột biến trước khi cố định

Nguyên tắc cơ bản để gây tạo đột biến thành công là dựa vào đặc điểm sinh trưởng, phát triển của cây trồng để chọn phương pháp và tác nhân gây đột biến thích hợp Tác nhân gây đột biến thường là tia X, tia (y), nhiệt độ hoặc các hóa chất gây đột biến

- Cây trồng sinh sản bằng hạt thường chọn hạt khô là bộ phận xử lí với tác nhân gây đột biến là tia phóng xạ (Khuất Hữu Khanh, 2006)

- Thực vật là sinh vật biến nhiệt vì thế nhiệt độ là nhân tố ảnh hưởng đến đột biến của cây trồng Đưa cơ thể thực vật vào môi trường có nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn mức trung bình sẽ làm cho protêin bị biến tính từ đó dẫn đến sai lệch trong cấu trúc của nhiễm sắc thé

- Các hóa chất gây đột biến có khả năng thâm thấu cao qua màng tế bào, màng nhân gây thay đối trạng thai cia DNA và nhiễm sắc thể Ví dụ hạt ngô ngâm trong dung dịch ethylenimin 0.05% trong 24 giờ

- Phương pháp tạo đa bội thé (đột biến số lượng nhiễm sắc thể) bằng colchicine ở dưa hấu, khoai tây,

Trang 27

5.2 Có định mẫu

5.2.1 Khai niém

Cố định là làm chết tế bào thật nhanh trong dung dịch cố định - một loại dung dịch hóa chất độc đối với tế bào Chất có định khi ngắm vào tế bào sẽ đình chỉ mọi quá trình sống xảy ra trong tế bào và không gây quá trình thuận nghịch (Trần Tú

Ngà, 1892)

5.2.2 Mục đích

Có nhiều loại chất cố định, mỗi loại được sử dụng với một ý nghĩa riêng Điều

quan trọng nhất ở đây là có định phải làm chết tế bào nhưng không làm thay đổi đáng kế cấu trúc của tế bào và đáp ứng được nhu cầu nghiên cứu Theo Trần Công Khánh (1980) thì cố định còn nhằm mục đích ngăn chặn quá trình tự hủy do men, thối rữa trong các mô, xác định những thành phần nhỏ trong tế bào, các mô cứng

rắn hơn để dễ cắt và dễ nhuộm hơn

Trừ một số trường hợp phải quan sát sống, các nguyên liệu dé nghiên cứu về tế bào và giải phẫu cần phải có định ngay sau khi lấy mẫu

5.2.3 Nguyên tắc

Tính chính xác của kết quả nghiên cứu trên tiêu bản tế bào phụ thuộc rất nhiều vào quá trình cố định mẫu Muốn cố định tốt mẫu phải thực hiện đúng những nguyên tắc sau đây (Trần Tú Ngà, 1892):

- Chất cố định phải lựa chọn sao cho phù hợp với mục đích nghiên cứu, lượng

chất có định phải lớn hơn han luong mau vat can cé dinh

- Vật được cố định phải còn tươi nguyên Những mẫu vật lớn trước khi cố định nên cắt thành những mẫu nhỏ

- Thời điểm cô định tùy theo từng trường hợp cụ thể: Rễ cố định để xem phân chia nguyên nhiễm thường cô định vào lúc 8 — 9 giờ sáng

- Chuẩn bị cố định rễ non trước khi cố định một ngày cần tưới đầy đủ và giữ ở

20 - 25°C

- Chuẩn bi lọ con có nút và đán nhãn để cố định Nội dung nhãn ghi số thứ tự mẫu có định, ngày giờ cố định, tên vật cố định, tên chất cố định

Trang 28

5.3 Làm tiêu bản hiến vi tạm thời 5.3.1 Rứa mẫu vật

Sau khi cố định mẫu vật cần được rửa sạch thuốc cố định Đối với thuốc cố định pha cồn thì mẫu vật được rửa sạch trong cồn 80% cho đến khi hết mùi axit acetic (Nguyễn Nghĩa Thìn, 2008)

5.3.2 Báo quán mẫu vật

Mẫu vật được rửa sạch có thể giữ lâu dài trong cồn 80% (Nguyễn Nghĩa Thìn,

2008)

Theo Trần Công Khánh (1980), đối với những mẫu vật dùng để nghiên cứu nhiễm sắc thế thì nên giữ ở nhiệt độ 4°C (dé trong tủ lạnh)

5.3.3 Nhuộm mẫu vật

Thành phần cấu tạo của tế bào thực vật thường không màu, rất nhỏ bé và thường trong suốt khó quan sát đưới kính hiển vi Để nhận biết được, tùy theo từng đối tượng và mục đích nghiên cứu muốn quan sát thành phần nào của tế bào mà có

phương pháp nhuộm thích hợp (Trần Công Khánh, 1980)

- Nhuộm nhân tế bào và nhiễm sắc thể dùng aceto-carmine hoặc hematoxylin - Nhuộm vách tế bào không hóa gỗ dùng carmine - phèn chua hoặc hematoxylin

- Nhuộm lạp không màu dùng tim getian

- Nhuộm tinh bột dùng cloran - iod, iod - iodua

Theo Trần Công Khánh (1980), nếu nhuộm nhiễm sắc thê thì cần ngâm mẫu

trong thuốc nhuộm lâu hơn

5.3.4 Thực hiện tiêu bản hiến vi tạm thời bằng phương pháp ép

Lam min và nhuộm mẫu:

- Làm mủn mẫu vật bằng nhiệt: Cho mẫu vào ống nghiệm có sẵn aceto-carmine 1% và ngâm trong thời gian từ 30 phút đến 45 phút, sau đó đun nhẹ từ 5 phút đến 7 phút

Trang 29

- Làm mủn mẫu vật bằng thủy giải: Cho mẫu vào dung dịch HCI 1N : Methanol với tỉ lệ 1 : 1 trong thoi gian 15 phút - 30 phút cho đến khi rễ mềm Rửa mẫu bằng nước cất khoảng 15 phút để loại bỏ hết HCI

Thực hiện tiêu bản tạm thời bằng phương pháp ép: Cho mẫu (chóp rễ hoặc lá non) lên lame đã nhỏ một giọt aceto-carmine 1% va đậy lammelle Ép nhẹ tiêu bản

cho các tế bào được dàn đều ra

5.4 Chuyển tiêu bán hiến vi tạm thời thành tiêu bản hiến vi cố định

Những tiêu bản tạm thời làm đẹp hoặc cần thiết phải giữ lại để nghiên cứu, có thể chuyển sang tiêu bản hiển vi cố định

Theo Trần Công Khánh (1980), tiêu bản hiển vi muốn giữ lâu thì phải cần cố định trong những môi trường đặc biệt Ví dụ trong glyxerin — gelatin, euparan hoặc Baume Canada, Thông thường thì những tiêu bản giải phẫu thực vật được cố định trong Baume Canada

Chọn những tiêu bản tốt, đặt vào băng đá CO; cho đến khi chất lỏng dưới phiến kính đóng băng lại

5.4.1 Loại nưóc

Mau vat can phai loai hết nước trước khi đưa vào môi trườn 8 cố định Cách làm như sau:

- Ngâm tiêu bản trong cồn 50” ít nhất trong 30 phút (co thé lâu hơn tùy theo độ dày của mẫu vật)

- Chuyển vào cồn 70” rồi cồn 96° thoi gian cũng như trên

- Chuyên vào côn tuyệt đối trong 30 phút (làm 2 lần)

Trang 30

5.4.3 Dán mẫu

- Đặt lame đã được lau sạch xylene trên mặt phẳng nằm ngang (mặt bàn)

- Nhỏ một giọt Baume Canada được pha loãng trong xylen với tỉ lệ 2 : I hoặc I : | pha lên vùng mẫu

- Đậy mẫu lại bằng lammelle

- Sau đó ấn nhẹ lên lame dé Baume Canada dàn đều khắp các cạnh của lame và

tràn ra ngoài khung khoảng | mm

- Dán nhãn: Nhãn được dán ở góc trái của lame với nội dung:

+ Tên tiêu bản

+ Ngày, tháng, năm thực hiện tiêu bản

Trang 31

CHUONG III

PHUONG TIEN VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU

1 Phuong tién

- Dụng cụ - thiét bi: Kinh hién vi, can kĩ thuật, phéu thủy tinh, pincer, kéo mé, bếp đun, đèn cồn, đĩa petri, đĩa đồng hồ, beaker, lọ yaourt, kim mũi giáo, cốc đong,

tửu kế, lame, lammelle, lưỡi lam, giấy thấm, băng keo, thau trồng hành, khay nhôm, đũa thủy tinh, kẹp ống nghiệm, nhiệt kế, tủ lạnh, tủ ủ (Lncucell)

- Hóa chất: Cồn tuyệt đối, axit acetic, nước cất, carmin alum laque, xylene, n -

butanol, Baume Canada

2 Phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng thí nghiệm: Rễ hành ta (Allium ascalonnicum L.) 2.2 Bồ trí thí nghiệm

2.2.1 Chuẩn bị mẫu

Chọn những củ hành to, còn mục rễ, tươi, không bị nam mốc Bóc bỏ vỏ khơ bên ngồi để lộ phần màu tím hồng bên trong, cắt bỏ những phần rễ khô nhưng không quá sâu, cắt bỏ một ít phía trên chóp hành để kích thích ra rễ Sau đó giâm hành vào thau nhựa chứa cát 4m (chu ý cát không quá khô và cũng không quá ướt), để 2/3 củ hành ngập trong cát Tưới nước hàng ngày tránh để cát khô Hành được trồng khoảng 2 - 3 ngày thì có thể thu rễ (tùy theo khí hậu lúc trồng hành) Mẫu đối chứng (mẫu không xử lí sốc nhiệt) và mẫu sốc nhiệt trồng trong cùng điều kiện

2.2.2 Thu mẫu

Thời điểm thu mẫu sốc nhiệt tốt nhất là khoảng 8h45 đến 9h sáng Thời điểm thu mẫu đối chứng là khoảng 9h25 Đêm trước khi thu mẫu cần tưới nước cho hành để kích thích ra rễ Thu mẫu rễ hành ta ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (khoảng 29 - 30°C) Rửa nhanh qua nước để loại bớt cát dính vào rễ Không cắt rễ ra khỏi củ hành nhằm đảm bảo sự phân chia tế bào bình thường

2.2.3 Xứ lí sốc nhiệt

- Mục đích: Giai đoạn này nhằm tạo ra sự chênh lệch nhiệt độ (nhiệt độ sốc nhiệt thâp hơn hoặc cao hơn nhiệt độ phòng) Mặt khác sôc nhiệt là tình trạng làm

Trang 32

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ thay đổi một cách đột ngột về nhiệt độ tức là từ nhiệt độ bình thường sang nhiệt độ

rất lạnh hoặc rất nóng Khi thay đổi nhiệt độ một cách đột ngột thì cơ chế nội cân bằng của cơ thế sẽ phản ứng không kịp dẫn đến sự biến đổi cầu trac NST

- Tiến hành:

Mẫu đối chứng không xử lí sốc nhiệt

Phương pháp sốc nhiệt khô: Sau khi thu hành ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (NĐPTN) (t¡) cho củ hành vào tủ ủ với nhiệt độ (t›) cao hơn nhiệt độ phòng 10C, 20°C, 30°C, 40°C cho mỗi nghiệm thức và trong thời gian sốc nhiệt (Tạ) là 15

Trang 33

Phương pháp sốc nhiệt ướt: Sau khi thu hành ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (NĐÐPTN) (t¡) cho củ hành vào tủ lạnh với nhiệt độ (t;) thấp hơn nhiệt độ phòng từ 10C, 20°C, 30°C, 40°C cho mỗi nghiệm thức và trong thời gian sốc nhiét (Ty) là

15 phút, 30 phút và 45 phút A; là sự chênh lệch nhiệt độ giữa nhiệt độ phòng và nhiệt độ xử lí Bảng 3: Các nghiệm thức theo phương pháp sốc nhiệt ướt tị t At= ti- tr T„ (phút) NDPTN = 20°C = 10°C 15 30 45 NDPTN = 10°C = 20°C 15 30 45 NDPTN =0°C = 30°C 15 30 45 NDPTN =-10°C = 40°C 15 30 45

Hình 9: Củ hành được sốc nhiệt ướt

2.2.4 Cỗ định mẫu và bảo quản mẫu vật

- Rễ hành sau khi xử lí sốc nhiệt thì được có định Mẫu đối chứng và mẫu xử lí

sốc nhiệt đều được có định trong dung dịch Carnoy biến đổi vào 9h30 sáng trong khoảng thời gian 4 giờ

Trang 34

- Rễ hành sau khi cố định được rửa với cồn 70” từ 3 - 5 lần hoặc cho đến khi

hết mùi axit acetic Trữ mẫu trong cồn 70” và có thể sử dụng trong vài tháng (một

hoặc hai tuần thay cồn một lần)

2.3 Quy trình thực hiện tiêu bán hiễn vi tạm thời và cố định % Thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời

- Tráng albumin lên lame

Hình 10: Tráng albumin lên lame

+ Dùng ống nhỏ giọt nhỏ một giọt albumin lên lame, cho lammelle tiép xúc với lame ở một cạnh tại vị trí giọt albumin, kéo lammelle đi một đoạn khoảng 4 em để dàn đều albumin lên lame

+ Để khô tự nhiên hay đặt vào tủ sấy ở nhiệt độ 40 — 45°

- Nhuộm và làm mủn mẫu vật

+ Cho vào ống nghiệm khoảng 6 — 10 rễ hành đã xử lí sốc nhiệt và trữ trong cồn 70°,

+ Nhỏ aceto-carmine 1% vào ống nghiệm sao cho các rễ hành đều ngập trong thuốc nhuộm và nhuộm trong khoảng 30 phút, 45 phút và 60 phút

+ Cho rễ hành đã được làm mủn vào đĩa petri nhuộm tiếp khoảng 10 phút

Trang 35

Hình 11: Nhuộm và làm mủn rễ hành

- Dàn mẫu

+ Dùng kim mũi giáo cắt lấy phần chóp rễ

+ Đặt chóp rễ lên lame tại vị trí có nhỏ sẵn một giọt thuốc nhuộm

+ Day lammelle lại, phủ giấy thấm lên lame, giữ chặt giấy thấm tránh để

lammelle trượt khỏi vị trí ban đầu

+ Dùng đầu bằng của kim mũi giáo đầm nhẹ tại vị trí có mẫu đề dàn đều các tế

bào

+ Lấy giấy thấm ra khỏi tiêu bản, vệ sinh tiêu bản và đặt lên kính quan sát

Hình 12: Thực hiện tiêu bản tạm thời

% Thực hiện tiêu bản hiển vi có định - Tách lammelle ra khỏi lame

+ Trước khi tách lammelle khỏi lame, tiêu bản phải được đặt trên băng đá CO>

+ Thời gian đặt tiêu bản lên băng đá CO;: trước 20 giờ, 2l giờ, 22 giờ, 23 giờ và 24 giờ

Trang 36

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường Đại học Cân Thơ

Hình 13: Tiêu bản trên băng da CO) va thao tac tach lammelle khoi lame

+ Tách lammelle ra khỏi lame: đặt lưỡi lam tại một góc cua lammelle sau đó nhẹ nhàng tách lammelle ra khỏi lame

Trang 38

- Làm trong mẫu: tiêu bản sau khi khử nước được cho vào lọ chứa n — butanol trong thời gian 10 giây, sau đó cho tiêu bản qua xylen trong thời gian 5 giây Mục đích của giai đoạn này là làm cho tiêu bản sạch và có sự tương phản giữa nhân và tế bào chất

Hình 15: Làm trong mẫu

- Dán Baume Canada: nhỏ một giọt Baume Canada lên vị trí có mẫu Sau đó

đậy lammelle lại Cách đậy lammelle giống với cách đậy lammelle khi thực hiện

tiêu bản tạm thời

Hình 16: Dán Baume Canada

- Dán nhãn lên tiêu bản: Nhãn được dán ở bên trái của tiêu bản với nội dung + Tên tiêu bản

+ Tháng, năm thực hiện tiêu bản

Trang 39

Hình 17: Tiêu bản được dán nhấn

2.4 Kháo sát các dạng đột biến

- Nhận diện các dạng đột biến cấu trúc nhiễm sắc thê dựa trên sơ đồ xuất hiện

các sai hình nhiễm sắc thể khác nhau và cơ sở phân loại các dạng đột biến cầu trúc NST của Muntxing (1971) và Phạm Thành Hồ (2004)

- Đếm số lượng tế bào có đột biến trên 3 tiêu bản hiển vi tạm thời của cùng một

nghiệm thức, lấy giá trị trung bình

- Chụp hình các dạng đột biến nhận dạng được

Trang 40

CHƯƠNG IV

KÉT QUÁ THẢO LUẬN

1 Kết quá

1.1 Số lượng tiêu bản

Qua quá trình thực hiện đề tài chúng tôi đã thực hiện tiêu bản tạm thời (TBTT) va chon lại 30 tiêu bản hiển vi cố định có đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể

1.2 Chất lượng tiêu bán

Ưu điểm:

- Tiêu bán có sự tương phản giữa nhân và tế bào chất - Có các dạng đột biến cấu trúc nhiễm sắc thẻ

- Tế bào trải đều trên tiêu bản, đa số tế bào không bị co Nhược điểm:

- Ở một số vùng tế bào còn chồng lên nhau, tế bào bị teo - Một số tiêu ban còn dơ

- Số lượng tế bào đột biến trên tiêu bản hiển vi cố định ít, dạng đột biến chủ yếu là đột biến mất đoạn

1.3 Nhận diện các dạng đột biến cấu trúc nhiễm sắc thế

Quan sát bằng kính hiển vi quang học, chúng tôi nhận diện các dạng đột biến cấu trúc nhiễm sắc thé dựa trên bảng sơ đồ xuất hiện các đạng sai hình nhiễm sắc

thể và cơ sở phân loại các dạng đột biến cấu trúc NST của Muntxing (1971) và

Phạm Thành Hồ (2004)

Mất đoạn là hiện tượng nhiễm sắc thể bị đứt ra một hay nhiều đoạn Đứt đoạn

có thể xảy ra ở nhiều kì trong quá trình nguyên phân

*% Theo Pêtrôp (1976), nếu trên mot NST có I chỗ đứt và từ chỗ đứt tách ra I

đoạn thì đoạn đó có thể là đoạn NST mang tâm động hoặc đoạn NST không mang tâm động (Hình 18)

Định dạng
Số trang	73
Dung lượng	34,32 MB