Nghiên cứu khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter dưới tác dụng của tác nhân gây đột biến tia UV

Trang 1

Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 2

LOI CAM ON

Bang tất cả lòng kính trọng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc

đến PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung đã tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ

em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này

Em xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy Nguyễn Khắc Thanh, thầy Phương Phú Công đã truyền đạt những kiến thức quý báu cũng như tạo

mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài bộ môn

Em cảm ơn chân thành tới các bạn cùng nhóm dé tai bộ môn vi sinh,

trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình hoàn thành đề tài nghiên cứu

Cuối cùng em xin được cảm ơn gia đình, những người thân, bạn bè đã quan tâm, động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Em xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày tháng nam 2013

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Ngọc Mai

Trang 2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật Đây là kết quả nghiên cứu của riêng tôi Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả đã công bó Trong tài liệu này tôi có sử dụng một số tài liệu của một số tác giả, tôi xin phép tác giả để bố sung cho luận văn của mình

Nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm

Hà Nội, ngày tháng năm 2013

Sinh viên

Trang 4

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH

Trang 5

MO DAU 1 Ly do chon dé tai

Ngày nay công nghệ sinh học đang dần trở thành một ngành kĩ thuật chủ đạo của nhiều quốc gia trên thế giới Gắn liền với nó là công nghệ vi sinh

với những thành tựu lớn có ý nghĩa trong đời sống, trong các ngành công nghiệp, y học Vi khuẩn Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí bắt buộc, hoá dưỡng thuộc chi Acefobacter, họ Acetobacferacedae

Khi nuôi cấy vi khuẩn này trên môi trường dịch lỏng, chúng sẽ hình thành

trên bề mặt một lớp màng BC, đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với

phân tử cellulose Màng BC cấu tạo bởi những chuỗi polimer-B-1,4

glucopyranose không phân nhánh được tổng hợp từ một số lồi vi khuẩn khi

ni cấy chúng trên môi trường địch lỏng

Mang BC do Gluconacetobacter tao ra có cấu trúc hóa học và đặc tính cơ học giống với cellulose của thực vật nhưng có thêm một số tính chất hóa lý

đặc biệt như: độ bền học, đường kính sợi nhỏ, độ tỉnh khiết cao, tính đàn hồi lớn, khả năng thắm hút nước nhanh, khả năng polymer hóa rất lớn Vì vậy BC được ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong rất nhiều lĩnh vực công nghệ

Trên thế giới màng BC đã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho quá trình xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào,đùng làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong

sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm Đặc biệt trong lĩnh vực y học,

màng BC đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều

trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo diéu trị các bệnh tim mạch; làm mặt

nạ dưỡng da cho con người

Trang 6

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ

khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu

Các kết quả ứng dụng của màng BC hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí

nghiệm Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Vi sinh Trường Đại học

Sư phạm Hà Nội 2 phân lập tuyên chọn được chủng Gluconacetobacter c6é

khả năng tạo màng BC và những nghiên cứu bước đầu cho thấy màng BC từ chủng Giuconacetobacter có khả năng ứng dụng cho trị bỏng cho tho là cơ sở để tạo ra màng trị bỏng cho người Màng BC hoàn toàn có thể sản xuất

trong nước bằng phương pháp lên men tĩnh của vi khuân Gluconacetobacter

trong môi trường lỏng Tuy nhiên một vấn đề gặp phải là chủng

Gluconacetobacter đễ bị thoái hóa Vì vậy việc không ngừng nâng cao hoạt

tính sinh tổng hợp cellulose là rất cần thiết Chính vì lý do đó, với mong muốn tuyển chọn được chủng có khả năng tạo màng BC trong thời gian nhanh hơn, đai hơn chủng Giweonacetobacter tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu khả năng tạo màng BC từ chúng Gluconacetobacter dwoi tac dung cua tác nhân gây đột biến tia UV ”

2 Mục tiêu đề tài

Tuyển chọn được chủng đột biến từ chủng Gluconacetobacter co kha năng tạo màng BC trong thời gian ngắn

3 Nội dung đề tài

3.1 Xác định thời gian đột biến đưới tác nhân đột biến tia UV

3.2 Gây đột biến và tuyển chọn chủng đột biến

3.3 Xác định sự thay đối hình dạng tế bào, hình thái khuẩn lạc của

Trang 7

Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sự phạm Hà Nội 2

4 Ý nghĩa khoa học

Chọn chủng sau đột biến từ chủng Gluconacetobacter có khả năng tạo màng BC trong thời gian ngắn

5 Ý nghĩa thực tiễn

Tạo màng BC trong thời gian ngắn nhất và tốt nhất có triển vọng ứng

dụng vào một số lĩnh vực trong cuộc sống, đặc biệt là lĩnh vực y học

6 Điểm mới

Chọn được chủng sau đột biến từ chủng Giuconacetobacter cô khả

năng tạo màng BC trong thời gian ngắn, dai hơn chủng gốc

Trang 8

NỘI DUNG

CHUONG 1 TONG QUAN TAI LIEU

1.1 Vị trí và đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter trong sinh gidi

1.1.1 Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới

Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì

Gluconacetobacter thuộc giống Acetobacter, ho Pseudomonadaceae, bd

Pseudomonadales, lớp Schizommycetes Việc phân loại vi khuẩn này còn nhiều tranh cãi, có một số tác giá coi Glueonacetobacter như một loài phụ của

A aceti [17]

1.1.2 Đặc điểm phân loại

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái, tế bào học

Gluconacetobacter có đạng hình que, thắng hay hơi cong, kích thước khoảng 2um, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả

năng di động, không sinh bào tử Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo

váng nhăn và dày Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H;SOx và thuốc nhuộm iôt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng cua hemicellulose), chung co thé tích luỹ 4,5% acid acetic trong môi trường Khi nồng độ acid acetic quá cao vượt quá giới hạn cho phép, nó sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn [13]

Vi khuẩn Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt

Trang 9

Hình 1.1 Vi khuẩn Gluconacetobacter

1.2.2.2 Đặc điểm nuôi cấy

Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn Gluconacetobacter hình thành khuẩn lạc nhẫn hoặc xù xì, rìa mép khuân lạc bằng phẳng hay gon song, mau trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trường Vi khuẩn Gluconacetobacter khi nuôi cấy trong môi trường lỏng ở điều kiện tĩnh, chúng sẽ hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng BC

Ngược lại trong điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ với

kích thước không đều nhau và phân tán trong môi trường dinh dưỡng tạo ra những đặc tính hình thái khác hắn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh

1.1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá Đặc điểm sinh lý:

Vị khuẩn Giuconacetobacter phát triển ở nhiệt độ 25 - 35C, pH: 4 - 6 Nhiệt độ và pH tối ưu tuỳ thuộc vào giống Ở 37°C, té bao sé suy thối hồn tồn ngay cả trong môi trường tối ưu Tuy nhiên vẫn còn những ý kiến khác

Trang 10

nhau và nhiều tranh cãi về điều kiện nhiệt độ, pH tối thích cho chủng vi khuẩn

Gluconacetobacter sinh trưởng và tạo màng

Gluconacetobacter co kha năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ

Đặc điểm sinh hoá:

Năm 1950, Frateur [20] đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới can

cứ vào các tiêu chuẩn: Khả năng oxy hóa acid acetic thành CO; và H;O; hoạt

tính catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer [20] Theo quan

điểm này Gluconacetobacter là chủng thuộc chi Acetobacter, ho

Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes Đặc điểm phân

biệt với các chủng khác trong cùng một chi được trình bay ở bảng 1.1 dudi đây [20]: Bang 1.1 Dac diém sinh hod cia ching vi khuan Gluconacetobacter theo Frateur (1950)

STT Dac diém Hiện tượng Kết quả

1 Oxy hoá ethanol | Chun hố mơi trường chứa Bromphenol + thành acid acetic Blue 0,04% từ màu xanh sang màu vàng

2 Hoạt tính catalase Hiện tượng sủi bọt khí + Sinh trưởng trên

3 mơi trường Hoyer ¬ Sinh khối không phát triển _

Chuyên hoá Tạo kết tủa đỏ gạch trong rong dịch sau lê di n

4 glycerol thành #0 Ker tia GO Bae one dien sau le +

men

dihydroxyaceton

5 Chuyén hoa glucose | Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn + thành acid lạc trên môi trường chứa CaCO¿a

Kiểm tra khả năng ˆ ` ok

6 ek Khong hinh thanh sac to nau _

sinh sac to nau

Kiém tra kha nang , 2 Loan `

7 tổng hợp cellulose Vang vi khuan xuât hiện màu lam +

Trang 11

1.1.3 Như cầu dinh dưỡng cúa vì khuẩn Giuconacetobacter

1.1.3.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tốt hơn cần cung cấp nguồn cacbon phù hợp Tuỳ nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp là vô cơ hay hữu cơ Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào hai yếu tố: thành phần hoá học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn, đặc

điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật

Người ta sử dụng đường làm thức ăn nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật

dị dưỡng Đường đơn ở nhiệt độ cao có thể bị chuyên hoá thành loại hợp chất

có màu tối khó hấp thụ Trong môi trường kiềm sau khử trùng, đường còn dễ

bị chuyển hoá làm biến đổi pH môi trường Để tránh hiện tượng này khi khử

trùng môi trường có chứa đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5atm ở 1100 trong 30 phút Từ các loại đường đơn tốt nhất nên sử dụng phương pháp hấp gián đoạn (phương pháp Tyndal) Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác người ta sử dụng các nồng độ đường không giống nhau, với vi khuẩn thường

dùng 0,5-0,2% đường Hầu hết các vi sinh vật chỉ đồng hoá được các loại

đường ở dạng đồng phân D [1]

Các hợp chất hữu cơ chứa cả cacbon cả nitơ (pepton, nước thịt, nước

chiết ngô, nước chiết nắm men, nước chiết đại mach, ) cd thể vừa sử dụng làm nguồn cacbon, vừa sử dụng làm nguồn nitơ đối với vi sinh vật [1]

1.1.3.2 Nhu cau nito ctia vi sinh vật

Nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thu nhất đối voi vi sinh vat la NH3 va NH,* Tuy nhiên, khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường có sử dụng NH¿Ÿ thì sau

khi chúng đồng hóa NH¿Ÿ trong môi trường sẽ tích lũy anion vô cơ ( SO¿Ÿ,

CI .) lam ha thap rat nhiéu tri s6 pH của môi trường Muối anion của các

Trang 12

axit hữu cơ ít làm chua môi trường hơn đo đó có lúc được sử dụng nhiều hơn

(mặc dù đắt hơn)

Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp với nhiều loại tảo, nắm sợi, xạ khuẩn nhưng lại ít thích hợp với vi khuẩn, vì sau khi vi khuẩn sử dụng hết

NO; cac ion kim loại còn lại sẽ kiềm hóa môi trường [1]

Vi sinh vật có khả năng đồng hóa tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ Các thức ăn này vừa là nguồn cacbon vừa là nguồn cung cấp nitơ cho vi sinh vật Vi sinh vật không có khả năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân tử, chỉ có các polypeptid không chứa quá 5 gốc axit amin mới có thể di chuyến trực tiếp qua màng tế bào chất của vi sinh vật [1]

1.1.3.3 Ham luong ethanol trong dung dich lên men

Ethanol được sử dụng như một cơ chất Hàm lượng ethanol có thể thay

đổi từ 2-10% V Hàm lượng cao hơn sẽ làm giảm năng suất lên men Theo Hong Joo Son lại công bố hàm lượng ethanol có thể thay đổi từ 0,2-1% tốt nhat 6 0,6% Theo Nodes, lượng cthanol duy trì trong môi trường luôn giữ ở 3-3,5% Cac tac gia Ebner va Heirich, cho luong ethanol dung tt 7-10% V

Đề tránh hiện tượng oxy hố hồn tồn acid acetic cần có một lượng ethanol

sót trong sản phẩm từ 0,2-0,5% để ức chế tự tổng hợp enzyme oxy hoá acid acetic và muối acetate [I], [23]

Ngoai viéc oxy hoa ethanol, vi khudn acetic con có khả năng oxy hoá các rượu khác thành các acid tương ứng

1.2 Lược sử nghiên cứu về vi khuẩn A xylizwm trên thế giới và Việt Nam 1.2.1 Tình hình nghiên cứu A xylinum trên thế giới

Trang 13

%

* s

Hướng thứ nhất: Chủ yếu là phân lập tuyển chọn, nghiên cứu các đặc tính

sinh học của A xyửmum từ đó xác định vi trí phân loại của chúng trong sinh gidi

Tiêu biểu là các nghiên cứu của Beljerinck, Frateur [20] Trên cơ sở nghiên cứu các đặc tính hình thái, nuôi cấy, sinh lý — sinh hóa các tác giả xác định nguồn gốc, đặc điểm phân loại của A xyÏinmum Các nghiên cứu của một

số nhà khoa học Nhật Bản nhu Kumiko Nanda va cs, P M Kutima; T.T

Kadere va cs [25] Cac tac gia phan lap tuyén chon va nghién ctru dic tinh sinh học của A xylinum, và một số chủng vi khuẩn acetic khác phân lập từ các sản phẩm lên men truyền thống của Nhật như Mnazi, Komesu, Kurosu

Hướng thứ hai: Nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp, đặc điểm và ứng

dụng của BC vi khuẩn A xylinum

Đó là các nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulose của các chủng A.xylinum; anh hưởng của môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp cellulose Mở đầu là S Hestrin; M Scharmn và cs

[22], [27], [26], sau la mot loạt các nghiên cứu tương tự, [19], [21], [23] Tiếp đến là nghiên cứu cơ chế tổng hợp màng BC, con đường chuyển

hóa cacbon trong vi khuẩn A xylimưn Mở đầu là nghiên cứu của R.M Brown

và cs, K.Zaar [18] Gần đây cơ chế sinh tổng hợp cenllulose, các hệ enzyme tham gia và con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn A xylinum mới dần được sáng tỏ [27]

Từ nửa sau thé ky XIX đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về ứng dụng của màng BC trong các lĩnh vực khác nhau Đặc biệt là màng trị

bỏng, sử dụng màng BC đắp lên vết thương hở, vết bỏng và đã thu được kết quả tốt như Wan và Millon đã được đăng ký bản quyền về làm màng BC từ A xylinum dung tri bỏng [28] Về sau có nhiều tác giả khác cũng nghiên cứu về hướng này

Trang 14

1.2.2 Tình hình nghiên cứu A xylnum ở Việt Nam

Trong điều trị bỏng, để giảm đau cho bệnh nhân, hạn chế mắt dịch, máu

qua vết thương, hạn chế nhiễm khuẩn vết bỏng, kích thích biểu mô hố ở bỏng nơng hay kích thích tạo mô hạt ở bỏng sâu người ta thường sử dụng các

loại vật liệu che phủ tạm thời Việc sử dụng các vật liệu che phủ tạm thời có

nguồn gốc từ da dị loại để che phủ vết thương phần mềm, vết bỏng đã được sử dụng từ rất lâu Tuy nhiên, việc sử dụng những loại da này cũng mới chỉ

dừng lại ở cách sử dụng đơn giản, đó là da tươi Mặc dù da dị loại tươi có

những ưu điểm, đặc biệt là khả năng bám dính tốt, nhưng nó cũng có những

nhược điểm nhất định Hơn nữa, việc sử dụng lại ở thế bị động, bảo quản và xử lý phức tạp, khó có thể sử dụng rộng rãi trên lâm sàng Vật liệu từ đa đồng

loại là lý tưởng nhất cho việc che phủ vết thương, vết bóng nhưng trong nhiều trường hợp rất khan hiếm; không đủ đáp ứng được Chính vì vậy vật liệu che

phủ tạm thời từ các loại màng sinh học là lựa chọn số một, có vai trò rất quan

trọng trong điều trị bỏng Một trong các loại màng sinh học đã và đang được quan tam ngay nay 1a mang cellulose vi khuan

Tại Việt Nam việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ vi khuẩn A

xylinum ngày càng được quan tâm Có một số các nghiên cứu, công bồ liên quan dén A xylinum sự hình thành màng BC và ứng dụng màng BC Các công trình mới chỉ bước đầu nghiên cứu quá trình tạo màng, đặc tính cấu trúc màng làm cơ sở chế tạo màng trị bỏng [9]; sản xuất thạch dừa [7] Gần đây

nhất là nghiên cứu ứng dụng màng BC làm chất nền và giá đỡ để cố định tế bào vi khuẩn của Nguyễn Thúy Hương và Phạm Thành Hồ [29]

Trang 15

men Nó có khả năng thấm nước cao, kết dính chặt và trơ về mặt hóa học nên

nó có vai trò như màng sinh học có thể thay thế da tạm thời [30]

Nghiên cứu về màng trị bỏng của tác giả như Huỳnh Thị Ngọc Lan, nghién ctru ché tao mang tri bong ti Bacterial cellulose cia A xylinum và hoạt chất tái sinh mô của dầu mù u Ngoài ra, có nghiên cứu về hiệu ứng làm lành vết thương của hỗn hợp Chistosan tan trong nước, Bacterial cellulose , Nano bạc của nhóm tác giả Nguyễn Thị Mỹ Lan, Huỳnh Thị Phương Linh, Lê Thị Mỹ Phước và Nguyễn Quốc Hiển [10]

Và tại phòng Vi sinh vật, khoa Sinh —- KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cs đang tiến

hành nghiên cứu quy trình sản xuất màng BC với chất lượng tốt và ứng dụng

vào trị bỏng bước đầu đã đạt được thành công [14]

1.3 Đặc điểm và cơ chế hình thành màng BC

1.3.1 Đặc điểm cấu trúc của màng BC

Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme ÿ - 1,4 glucopyranose mạch thắng Nó có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu

trúc và đặc tính của nó lại khác xa nhau

Soi cellulose cua mang BC Soi cellulose của thực vật

Hình I.2 Cấu trúc cellulose

Trang 16

Chuỗi polyme ÿ - 1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau

tạo thành sợi nhỏ (subƒfibr¡!) có kích thước I,5nm Những sợi nhỏ kết tỉnh tạo sợi lớn hơn - sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối

cùng tạo dái lớn Những dải lớn từ tế bào này khi đây ra ngoài sẽ liên kết với

với những dải lớn của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc Vandesvan tạo thành dạng sệt (gel) hay một lớp màng mỏng Kích thước bên của màng tăng lên khi quần thể vi khuẩn sinh trưởng Những điểm tạo màng BC mới có thể

xuất hiện, chính vì thế mà màng BC được mở rộng

1.3.2 Cơ chế tổng hợp màng BC

Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được

điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều

loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà [16]

Theo tác giả Alina Krystynowics và cộng sự có 4 enzyme tham gia xúc tác tông hợp cellulose ở vi khuân Gluconacetobacter:

Glucokinase (GK): Phosphoryl hóa C6 của glucose

Phosphoglucomutase (PGM): Xúc tác quá trình chuyển hóa Glucose — 6 phosphat thanh glucose — 1 phosphat

Glucose - 1 - phosphate uridylyltransferase (UDPG pyrophosphorylase hay

UGP): Xtc tac tong hop UDP — Glucose

Trang 17

Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sự phạm Hà Nội 2 CELLULOSE | UDPGic Glucose ATP UGP GK ADP (ram | Glc-1-P4————— Gilc-6-P ————————*_ PGA (NAD, NADP) Pentose Fructose7= Fru-6-P | ATP ADP | | | PTS a Fru-1-P_ ———» Fru-bi P Gluconeo- genesis Hinh 1.3 Con dwong sinh tong hop cellulose & Gluconacetobacter 1.4 Đột biến ở vi sinh vật

Đột biến (Mutation) bắt nguồn từ chữ Hy Lạp có nghĩa là biến đổi,

được nhiều nhà nghiên cứu khai thác ở các khía cạnh khác nhau Theo quan điểm hiện đại, đột biến là những biến đổi trong vật chất di truyền xảy ra đột

ngột

Với vi sinh vật, các nhà nghiên cứu quan tâm phân loại đột biến theo

hai hướng: tác nhân gây đột biến, và tính trạng biến đối đo đột biến

Trang 18

Các phương pháp chính gây đột biến vi sinh vật:

Gây đội biến bằng tác nhân hóa học: Có rất nhiều hóa chất có thể gây

đột biến, trong đó các chất gây đột biến mạnh nhất gồm có:

metylmetansunfonat, etylmetansunfonat, dimetylsunfat, dietylsunfat, metylnitronitrozoguanidin,

Gây đột biến bằng tác nhân vật lý: Là sử dụng các tia phóng xạ như tia

ơ, j, y, và tia tử ngoại có tác dụng gây nhiều loại đột biến, thường dùng trong

phòng thí nghiệm Tia tử ngoại với bước sóng 260nm có hiệu quả cao trong việc gây đột biến cho vi sinh vật , tác dụng chủ yếu lên các bazơ pirimidin Tia tu ngoai (ultraviolet) (UV) la tác nhân được nhà nghiên cứu sử dụng gây đột biến từ những năm đầu của thế ki XIX, do đó có những ưu điểm vượt trội so với các phương pháp đương thời Tia UV tác động vào bộ máy đi truyền gây biến đổi mạnh có thể tạo ra các chủng có hoạt tính mạnh, ngoài ra tỉa UV còn khá an toàn đối với người sử dụng Nên trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi đi sâu phân tích ảnh hướng của tia UV đến đột biến của vi sinh vật

Tia UV nằm trong vùng quang phô không nhìn thấy của ánh sáng mặt

trời Là sóng điện từ có bước sóng từ: 150.10”'°m = 0,4.10° m (150A? +

4000A°) Theo các nghiên cứu đột biến tia UV thì bước sóng 2600A” đến

2800A° có tác dụng biến đổi mạnh nhất tới bộ máy di truyền VSV Đây cũng

bước sóng mà các nhà nghiên cứu hay dùng

Cơ chế gây đột biến của tia UV đối với VSV còn nhiều tranh cãi, tuy nhiên nhiều nghiên cứu đưa ra một giả thuyết chung như sau: Ở bước sóng

2600A° ADN của vi khuẩn hấp thụ mạnh nhất Dưới tác động của tia UV,

Trang 19

Từ nhu cầu sản xuất trên quy mô công nghiệp, các nhà nghiên cứu đã và đang tiến hành những phương pháp tác động đến bộ máy di truyền của các

chủng đại, nhằm chọn ra giống có khả năng “siêu tổng hợp” đáp ứng những

nhu cầu cấp thiết hiện nay Thành tựu nồi bật nhất nhờ sử dụng phương pháp đột biến này mang lại là việc tuyên chọn thành công “siêu chủng” Peniecillium chrysogenum Wis 49-133 dùng để sản xuất Pennicillin Nhờ phương pháp này từ chủng gốc ban đầu (1941) hoạt tính chỉ đạt 30 UI/ml đến năm 1967 đạt

5000 UW/mI Với công đoạn gây đột biến sau đó chọn lọc các chủng có hoạt

tính mạnh Các nhà nghiên cứu đã tạo ra được “siêu chủng” có năng suất gấp 700 lần so với chủng đại Thành công này đã góp phần không nho trong cong

nghiệp sản xuất kháng sinh phục vụ nhu cầu cấp thiết cho con người

Ngày nay, với những kỹ thuật hiện đại gây biến đôi bộ máy di truyền của VSV theo những hướng xác định như lai ghép tế bảo trần và chuyển gen Đã thu được những chủng có năng suất rất cao nhưng các nhà nghiên cứu vẫn thường xuyên dùng phương pháp tuyển chọn bằng tia UV Phương pháp này

đơn giản, dễ làm, an toàn đặc biệt chi phi thấp

Trang 20

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu và hóa chất

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chung vi khuẩn Giuconacetobacter BHN; được phân lập từ màng của các nguồn nguyên liệu khác nhau nhờ quá trình lên men giấm từ bia, giấm lên men theo phương pháp cô truyền, chủng giống nhận từ phòng Vi sinh vật,

khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

2.1.2 Hóa chất

- Nguồn đường: glucose (sản xuất tại cty Dược T.W MEDIPLANTEX

Hà Nội, Việt Nam)

- Nguồn nitơ:

+ Nguồn nitơ vô cơ: (NH¿)zSO¿ (sản xuất tại Trung Quốc) + Nguồn nitơ hữu cơ: pepton (sản xuất tại Trung Quốc)

- Một số hóa chất vô cơ: KH¿POa, MgSO¿.7HO, NaOH (sản xuất tại Trung Quốc)

- Một số loại thuốc nhuộm: tím gentian, dung dịch fushsin, dung dịch lugol

Trang 21

Cân điện tử (Precica XT 320 M, Thụy Sỹ)

Micropipep (Gilson, Pháp) Tủ lạnh (Tawasi, Nhật)

Kính hiển vi quang hoc (Olympus CX4, , Nhat)

Hộp lồng, ống nghiém, pipet, ban trang thuy tinh, binh tam giac, lam kinh, la men, dén cén, va nhiéu dụng cụ hóa sinh thông dụng khác (được cung cấp bởi phòng Vi sinh vật, khoa Sinh — KTNN, trường Đại học Sư phạm

Hà Nội 2)

2.1.4 Môi trường nghiên cứu

2.1.4.1 Môi trường giữ giống (môi trường cơ bản): Glucose: 20gø/1; MgSOa.7H;O: 2g/] Pepton: 5g/1 Nước máy: 1000 ml (NH¿);SƠ¿a: 3g/1 Agar: 20g/1 KH;PO¿: 2g/] 2.1.4.2 Môi trường nhân giống: Glucose: 20g/] MgSO¿.7H;O: 2g/1 Pepton: 5g/I Nước máy: 1000 ml KH;PO¿: 2g/1 (NH¿);SƠ¿a: 3g/1 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương phúp vì sinh 2.2.1.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc

Lấy 1ml dịch huyền phủ có chứa vi khuẩn 24 giờ ni cấy, pha lỗng theo phương pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha

Trang 22

loãng rồi trang đều trên môi trường thạch đĩa Nuôi ở 30°C trong 5 ngày đếm khuẩn lạc (CFU) trong môi trường đĩa Petri, từ đó xác định số lượng tế bao vi khuẩn trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức

1000 1

V, 10 n i

Trong do N : Téng sé CFU trong Iml mẫu ban đầu A¡: Số khuẩn lạc trung bình tạo vòng phân giải

CaCO; trén dia phan lap có độ pha loãng 10” V, : Thể tích dịch mẫu trên mỗi đĩa phân lập 10” : Là độ pha loãng của mẫu phân lập

2.2.1.2 Phương pháp phân biệt tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter bang phương pháp nhuộm Gram

Vị khuẩn Giuconacetobacter là các vi khuẩn Gram âm, do đó có thé

phân biệt với vi khuẩn Gram dương nhờ phương pháp nhuộm Gram (nhuộm

kép)

Tiến hành: Lấy chủng vi khuẩn Gluconacetobacter đem nhuộm tiêu bản theo phương pháp Gram Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu của kính

hiển vi quang học Olympus với độ phóng đại 1000 lần [2] [4] [5]

2.2.1.3 Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng

Các chủng giống sau khi phân lập, được sơ bộ xác định là Gluconacetobacter được cấy vào ông thạch nghiêng, nuôi 4-5 ngày trong tủ ấm ở 30C Sau đó giữ lạnh trong tủ lạnh ở 4° dùng cho các nghiên cứu tiếp theo Cấy truyền và giữ giống trên thạch nghiêng khoảng 1 tháng một lần [4], [5]

2.2.1.4 Phương pháp hoạt hoá giống

Trang 23

cho quá trình lên men Phương pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trường tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng Sau đó đem xử lý trong đèn

tím 15 phút, cấy chuyên giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ [4], [5]

2.2.1.5 Phương pháp lên men tạo màng

Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng Sau đó khử khuẩn ở đèn cực tím trong 15 phút Bồ sung vào mơi trường 5% giống

hoạt hố Nuôi cấy ở điều kiện tĩnh trong 3 - 4 ngày

2.2.2 Phương pháp đột biễn vi sinh vật

Nguyên tắc đột biến: lấy chủng có khả năng tạo màng chất lượng cao nhân thuần, ổn định hoạt tính [8]

Chúng tôi tiến hành đột biến vi sinh vật dưới tác dụng của đèn UV có

bước sóng 253,7 nm trong các thời gian khác nhau: 3, 5 ,7, 9 phút Với cách

đột biến như sau:

Đột biến trên môi trường thạch đĩa: nuôi vi khuẩn trên môi trường lỏng (môi trường lên men) ở 25-30°C trong 8-12h (khoảng thời gian quần thể vi sinh vật bắt đầu phân chia mạnh khi bước vào pha log) Pha loãng mẫu, trang đều trên môi trường thạch Để trong tủ ấm ở 25-30°C trong 2-3h dé cac té bào phân chia Sau đó tiến hành gây đột biến dưới đèn UV

2.2.3 Phương pháp tuyển chọn sơ bộ các chúng sau đột biễn

Chuẩn bị các đĩa petri chứa môi trường thạch, trang vi khuẩn Gluconacetobacter và đột biễn ở thời gian thích hợp Sau đó các đĩa này được nuôi ở tủ ấm 25-30°C Khi các khuẩn lạc mọc, dùng que cấy tách riêng các khuân lạc cấy sang môi trường thạch nghiêng, sau đó đem nuôi ở tủ ấm Khi vi khuẩn Giwceonacetobacter trong các ông thạch nghiêng này mọc, tiến hành hoạt hóa và lên men tạo màng

Trang 24

2.2.4 Phương pháp toán học

Xử lý thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số phương pháp trong cuốn “Ứng dụng tin học trong sinh học” [11], và “Thống kê và ứng dụng” [15] như: * Số trung bình cộng: Dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại n X= 1 X, thí nghiệm: mel * Trung bình bình phương các sai lệch: +m=—= * Sai số đại diện của trung bình cộng: vn Am * Hệ số biến thiên trung bình cộng: "Xx * Tính giá trị trung bình cộng tổng thé: Theo công thức: " Xi = il n

Trong đó: M:_ Giá trị trung bình tổng thể

X¡: Giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm

n: Số lần thí nghiệm

Trang 25

CHƯƠNG 3 KÉT QUÁ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Xác định thời gian gây đột biến phù hợp

Chúng tôi tiến hành đột biến bằng cách đặt mẫu cần đột biến cách đèn UV có bước sóng 253,7nm là 15cm ở các thời gian khác nhau Kết quá thể

hiện qua bảng 3.1

Bang 3.1 Ảnh hướng cúa thời gian tác động tia UV đến khả năng sinh trưởng của vỉ khuẩn Gluconacetobacter BHN; Thời gian đột biến (phút) Khá năng mọc của vi khuẩn 3 ++++ 5 ++ 7 + 9 - Chú thích: ++++: Mọc rất tốt (mật độ khuẩn lạc >30CFU/đfa)

++ : Moc kha (mat d6 khuẩn lạc từ 4 - 10 CFU/đĩa petri)

+; Mọc yếu (mật độ khuẩn từ 1-3 CFU/dia petri) - + Không mọc trên 50% số đĩa petri

Nhận xét 1: Tại thời điểm 3 phút số lượng khuẩn lạc mọc tốt, tại thời điểm 5 phút, khả năng sống sót của vi khuẩn khá, tại thời điểm 7 phút số lượng khuẩn lạc mọc yếu nhất Ở thời gian 9 phút, không một tế bảo nào của vi khuẩn sống sót, tuy nhiên tác động tia UV đưới 7 phút thì chúng vẫn mọc

Qua bảng số liệu ta thấy , thời gian tác động của tia UV càng dài thì càng ảnh hưởng càng mạnh tới khả năng sống sót của vi khuẩn.Vậy chứng tỏ tại

thời điểm 7 phút chính là ranh giới của sự đột biến và không đột biến nên tôi quyết định chọn chủng đột biến với thời gian đột biến là 7 phút với khoảng

Trang 26

cách đèn tử ngoại 15 em là thích hợp cho quá trình tác động tia UV đối với vi

khuẩn Giwconacetobacter BHN; nhằm thu được dòng đột biến

Có thể giải thích điều này do sức sống của các tế bào vi khuẩn là khác nhau nên chúng chống chịu khác nhau đối với tia tử ngoại

3.2 Tuyến chọn chúng sau đột biến từ chúng Giuconacetobacter BHN; có khả năng tạo màng BC Bang 3.2 Kha nang tao mang BC của các chúng sau đột biến bằng tỉa UV từ chúng Gluconacetobacter BHN; STT Kí hiệu chủng Thời gian tạo màng Khả năng tạo màng (giờ) 1 ĐBI 75 giờ + 2 DB2 - - 3 DB3 50 giờ + 4 DB4 - - 5 ĐBS - - 6 DB6 48 gid + 7 DB7 51 giờ + § DB8 - - 9 DBI 78 gid + 10 ĐBI0 - - Chú thích: + : Tạo màng - ¡ Không tạo màng

Nhận xét 1: Như vậy, qua đột biến chúng tôi thu được 10 chủng là: ĐBI, ĐB2, ĐB3, ĐB4, ĐB5, ĐBó, ĐB7, ĐB8, ĐB9, ĐB10 Kiểm tra khả năng

Trang 27

khả năng tạo màng còn các chủng còn lại mất hoạt tính không còn khả năng tạo mảng

Giải thích nguyên nhân các chủng sau đột biến mắt khả năng tạo màng: Tia UV đã tác động vào bộ máy di truyền của vi khuẩn Gluconacetobacter BHN; làm thay đôi đoạn gen mã hóa khả năng tạo màng các chủng BHN; Do vậy khi gen mã hóa tạo màng bị thay đổi sẽ dẫn tới mắt khả năng tạo màng ở các chủng đột biến

Tôi tiến hành thử khả năng tạo màng lần hai đồng thời kiểm tra sự én

định khá năng tạo màng và tính chất màng của các chủng đột biến này Kết

quả thu được được thể hiện ở bảng 3.3 và 3.4

Bảng 3.3 Khá năng tạo màng BC cúa các chúng được tuyển chọn lần thứ nhất sau đột biến từ chúng Giuconacetobacter BHN; STT Kí hiệu chủng Thời gian tạo màng Tính chất màng (giờ)

1 DBI 75 + + 1,5 gia Dai, nhan

2 DB3 50 + + 2 gis Mong, Dé rach

3 ĐB6 48 + + 1+1 giờ Dai, nhan 4 DB7 51+ + 2 gio Dai, nhẫn 5 ĐB9 78+ + 2,5 giờ | Mỏng, không đồng đều

Nhân xét 2: Qua tuyên chọn lần thứ nhất tôi chọn được 5 chủng đột

biến là DB1, DB3, DB6, DB7, DB9 co kha nang tao màng trong thời gian khác nhau và tính chất màng khác nhau trong đó có 2 chủng tạo màng có tính chất mỏng, dễ rách và không đồng đều nên tôi chọn 3 chủng đột biến còn lại

Trang 28

Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sự phạm Hà Nội 2

la DB1, DB6, DB7 tao mang co tinh chất dai và nhẫn để tuyên chọn và thử khả năng tạo màng lần thứ 2

Bảng 3.4 Khá năng tạo màng BC của các chúng được tuyển chọn lần thứ hai sau đột biến từ chúng Giuconacetobacter BHN;

STT Kí hiệu chủng Thời gian tạo màng Tính chất màng

1 ĐBI 74 +‡ 1,5Sgiờ Dai, nhan

2 ĐB6 48 + + 1 gid Dai, nhan

Trang 29

Nhận xét 3: Kiểm tra khả năng tạo màng của 10 chủng qua 2 lần tuyển chọn thì thu được 3 chủng ĐBI, ĐBó, ĐB7 trong đó chủng ĐBI, ĐB7 tạo màng có tính chất dai và nhẫn nhưng thời gian tạo màng dài và không ôn

định, còn chủng ĐB6 tạo màng trong thời gian ngắn hơn chủng gốc và ốn

định, màng tạo thành cũng có tính chất dai và nhẫn hơn nên tôi quyết định chọn chủng ĐB6 làm đối tượng nghiên cứu tiếp tục

Hình 3.2 Màng BC được tạo từ các chúng ĐB6

Trang 30

3.3 Xác định sự biến đối hình dạng tế bào, hình thái khuẩn lạc của chúng trước và sau đột biến

3.3.1 Hình thái khuẩn lạc

Khi sinh trưởng trên bề mặt môi trường đặc chủng vi khuẩn ĐB6 có các tính chất không khác nhiều so với khuẩn lạc ban đầu lúc chưa đột biến

Hình A Hình B

Trang 31

Khoa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 2

chủng vi khuẩn Giuconacetobacter sau đột biến chúng tôi tiến hành nhuộm tế bào và quan sát

Hình A Hình B

Trang 32

Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sự phạm Hà Nội 2 Điểm sai khác Trước đột biến Sau đột biễn (BHN;) (ĐB6)

Hình thái | Thời gian quan

khuẩn lạc sát rõ khuẩn 3- 4 ngày 2- 3 ngày lạc

Hình dạng Hình tròn, nhẫn hoặc Hình tròn, nhẫn hoặc

xù xì Mép bằng phẳng | xù xì Mép bằng phẳng hoặc gợn sóng hoặc gợn sóng

Màu sắc Trắng hoặc trắng sữa Trắng hoặc trắng sữa Hình thái Hình dạng Hình que riêng lẻ hoặc | Hình que riêng lẻ hoặc

tế bào xếp thành chuỗi xếp thành chuỗi

Kích thước 1,5 — 2um 1,5 - 2um

Nhuộm Gram Bắt màu Gˆ Bat màu Gˆ

Khả năng sinh Không Không

bào tử

Khả năng di Không Không

động

Nhận xét l: Từ kết quả trên ta thấy: Hình thái tế bào và khuẩn lạc của

chủng trước và sau đột biến có sự khác biệt không đáng kể Chứng tỏ rằng: đột biến bằng tia UV không làm thay đổi hình dạng tế bào và hình thái khuẩn lạc Quá trình đột biến không làm biến đôi chủng mà còn đưa lại kết qua:

Chủng đột biến khi kiểm tra khả năng tạo màng cho màng BC dai và độ đồng đều cao hơn chủng BHN; trước đột biến Tuy nhiên chỉ quan sát về hình đạng tế bào và hình thái khuẩn lạc chưa đủ dé khang định chủng

Trang 34

1 Kết luận

1.1 Đã xác định được thời gian đột biến thích hợp là 7 phút với khoảng cách là 15cm và cũng đã lựa chọn được phương pháp đột biến phù hợp là đột biến qua thạch đĩa petri với bước sóng 253,7nm

1.2 Qua đột biến đã tạo ra được 10 chủng trong đó có 5 chủng có khả năng tạo màng Trong 5 chủng đó, chủng ĐB6 có khả năng tạo màng ổn định và thời gian ngắn hơn chủng gốc BMN;

1.3 Hình dạng tế bào và hình thái khuẩn lạc của chủng BHN; và chủng

đột biến ĐBó có sự khác biệt không đáng kế

2 Kiến nghị

Do thời gian có hạn nên chúng tôi chỉ nghiên cứu được ảnh hưởng của tia UV tới khả năng sống sót của chủng Glwconacetobacter BHN; và chỉ gây

đột biến lần đầu Đề có kết quá chính xác hơn cần gây đột biến một số lần

nữa

-_ Nên nghiên cứu điều kiện ảnh hưởng của môi trường tới khả năng tạo màng của các chủng đột biến

- _ Nên xác định rõ về bản chất của việc đột biến bằng phương pháp phân tử

- Nên nghiên cứu và so sánh các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các

chủng đột biến và chủng gốc để có được chỉ tiêu cụ thể về sự biến

đồi này

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Trang 35

Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sự phạm Hà Nội 2 học Nxb Giáo dục, tr.149-150 2 Nguyễn Thanh Đạt (1999) Cơ sở vi sinh vật học Tập 1, Nxb Đại học Sư phạm Hà Nội, tr 52-55, 62-102, 185-309 3 Nguyễn Thành Đạt (2005) Cơ sở vi sinh vật học, tập 2, Nxb Đại học Sư phạm, tr 7-9, 37-61, 169-171 4 Nguyễn Thanh Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hao (1990) Thuc hành vi sinh vật Nxb Giáo dục, tr 17-34, 63-74, 89-92 5 Vũ Thị Minh Đức (2001) Thực tập vi sinh vật Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 1-50

6 Nguyễn Thúy Hương (2006) Chọn lọc dùng Acetobacter xylinum thích hợp

cho các loại môi trường dùng trong sản xuất cellulose vi khuẩn với quy mô lớn Luận án tiễn sỹ khoa học sinh học, trường Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh

7 Trương Thị Ngọc Hoa, Trương Nguyễn Quỳnh Hương (2005) Đa dạng hóa các môi trường sản xuất Natadecoco từ vi khuẩn Acetobacter xylinum Số 2,

Tạp chí khoa học kỹ thuật Nơng Lâm nghiệp

§ Phạm Thành Hồ (2006) Đi uyên học, Nxb Giáo dục, tr 238-258

9 Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh (2006) Nghiên cứu các đặc tính mang cellulose vi khuan từ Acetobacter xylinum su dung lam mang tri

bong, Tap chí được học, sô 361

10 Nguyễn Thị Mỹ Lan, Huỳnh Thị Phương Linh, Lê Thị Mỹ Phước, Nguyễn Quốc Hiển (2009) Bước đầu nghiên cứu hiệu ứng làm lành vết

thương của hỗn hợp Chitosan tan trong nước, Bacterial cellulose, Nano

bac Tap chi Phat trién KH & CN, tập 12, số 09

11 Chu Văn Mẫn (2003) Ứng dụng tin học trong sinh học Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội

12 Phan Cự Nhân, Nguyễn Minh Công, Đặng Hữu Lanh (2006) Di truyén

học, tập 1, Nhà xuất bản Đại học Sư phạm, tr 99-137

Trang 36

13 Dinh Thi Kim Nhung (1996) Nghiên cứu một số đặc điểm của vi khuẩn Acetobacter và ứng dụng lên men acetic theo phương pháp chìm Luận án

PTS khoa học Sinh học Đại học Sư phạm Hà Nội

14 Đinh Thị Kim Nhung, Trần Như Quỳnh, Nguyễn Thị Thuỳ Vân (2009) Nghiên cứu vi khuân Acetobacter xylinum tao mang bacterial celulose tng dụng trong điều trị bỏng Báo cáo khoa học

15 Đặng Hùng Thắng (1999) Thống kê và ứng dụng Nxb Giáo dục, tr 214- 267

16 Nguyễn Thị Thùy Vân (2009) Nghiên cứu đặc tính sinh học và khả năng tạo màng Bacterial cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum phân lập

từ một số nguồn nguyên liệu ở Việt Nam Luận văn Thạc sỹ khoa học

Sinh học, trường Đại học Sư phạm Hà Nội

B TAI LIEU TIENG ANH

17 Bergey H, John G Holt Bergey’s manual of dererminativa bacteriology

Wolters Kluwer health, 1992, p.71-84

18 Brown R.M., K.Zaar (1999) Cellulose structure and biosynthesis Pure

Appl Chem Vol, 71, pp 765-775

19 Canon, R.E., and Anderson, S.M (1991) Biogenesis of Bacterial

cellulose Critical Reviews in Microbiology Vol, 17, pp 435-447 20 Frateur J (1950) Essaisur la systesmatique des Acetobacter La cellule

Vol 53, pp 278-398

21 Forng E.r., Anderson S.M., Canon R.E (1989) Synthetic medium for

Acetobacter xylinum that can be used for isolation of auxotrophic mutants and study cellulose Biosynthesis Applied and Enviromene microbiology, pp 1317-1319

Trang 37

Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sự phạm Hà Nội 2 23 24 25 26 27 28 29 30

cellulose by a newly isolated Acetobacter sp A9 in shaking cultures Biotechnol Appl Bichem Vol 33, pp 1-5

Hong Joo Son, Hee Goo Kim, Keun Ki Kim, Han soo Kim, young Gyun Kim, Sang Joo Lee (2002) Inceased production of bacterial cellulose by Acetobacter sp V6 in synthetic media under shaking culture conditions Bioresorse technology Vol 86, pp 215-219

Jonas, R & Frarad, L.F (1998) Production and application of microbial cellulose Polymer Degradation and Stability Vol 59, pp 101 — 106

Kumiko Nanda, Kadere T.T, Kutima P.M, Njoroge M.S (2008)

“Tsolation and identification of the genera Acetobacter and gluconobacter

in coconut toddy (mnazi)” African Journal of biotechnology Vol 7, No

16, pp 2963-2971

Trygve Brautaset, Rune Sandal, Espen Fjarvik, Svein Valla (1994) Nucleotide sequence and epression analysis of Acetobacter xylinum

phosphoglucomutase gene Microbilogy Vol 140, pp 1183-1188

Tomonori N., Naoto I., Teruko K., Yukiko K., Takayasu T., Fumihiro Y.,

Fukumi S., Takahis H (1999) Enhancement of cellulose production by expression of sucrose synthase in Acetobacter xylinum Applied

Biological sciences Vol 96, pp 14-18

Wan, WK & Millon E (2005) Poly — bacterial cellulose nanocomposite

V S Pat Appl Publ US 2005037082 Al, 16

Định dạng
Số trang	37
Dung lượng	8,15 MB