Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 27 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Thông tin cơ bản
Định dạng
Số trang
27
Dung lượng
920,72 KB
Nội dung
1 M U t v Nghiên cu bn cht tính chng chu ca cây trng cho thy t tính tr th ca tng gen riêng r liên n tính chng chu thc vt (ví d c nhiu nghiên cu tìm hiu và phân tích. Dng ca các yu t bt li t ngoi cnh, không ch các gen riêng r c biu hin mà là mt h thc kích hot biu hin nh ng vi tình trng bt li mà thc vt gp phi. Mt trong s nhng yu t kích hot hong ca các gen liên n kh ng chu là các nhân t phiên mã (transcription factor TF). NAC TF . NAC TF có ng . khác nhau Nhiu tác gi nghiên cu chuyn gen mã hóa NAC TF thành công vào mt s loài cây tr, thuc lá cây lc, các gen AhNAC1, AhNAC2, AhNAC3 thành công, AhNAC2 Arabidopsis. Lc là cây nông nghip ngc trng ph bin trên th gii. c ta, cây lc trng trên khp các min và phù hp vi nhiu vùng sinh thái khác nhau. Cây lc là cây h u, thuc nhóm chu hn kém. Vì vy, nu ci thic kh ng chu s m rc dit cây 2 trng. Mt s k thut chn to ging có kh u h ging hoc ng dng công ngh t bào thc vc áp dng. Tuy nhiên, vic s dng k thut chuyn gen nhm to ra nhng ging lc có kh u khô hc nghiên cu nhiu. T nh tài: Nghiên cứu phân lập và chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc (Arachis hypogaea nhm th nghim kh n gen ch th và tin ti chuyn gen chu hn to ra dòng cây chuyn gen phc v chn ging chu hn cây lc. ng dng thc tin ca nghiên cu nhm ci to cây lc và phá v hn ch v kh chng chu ng cây trng này. 2. Mc tiêu nghiên cu (1) Phân lp c gen mã hóa nhân t phiên mã NAC2 t ging lc chu hn tt. (2) Thit k c vector cha cu trúc mang gen mã hóa nhân t phiên mã NAC2. To cây chuyn gen và biu hic protein NAC2 cây thuc lá. (3) Tc dòng cây lc chuyn gen. Phân tích các dòng cây lc chuyn gen. 3. Ni dung nghiên cu (1) Phân nhóm các ging lc nghiên cu theo m chu hn u hn mô so và cây non. (2) Phân lp, tách dòng và gii trình t gen mã hóa nhân t phiên mã NAC2 n tính chu hn ca cây lc. (3) Thit k vector cha cu trúc mang gen mã hóa nhân t phiên mã NAC2, to vi khun A.tumefaciens mang vector tái t hp và chuyn vào cây thuc lá mô hình. 3 (4) nh s có mt ca gen chuyn NAC2 trên cây thuc lá, u hn ca các dòng thuc lá chuyn gen thông qua s ng proline. Phân tích biu hin protein tái t hp NAC2 cây thuc lá chuyn gen. (5) Phát trin h thng tái sinh cây cây lc và chuyn gen ch th (GUS) qua mô so và phôi soma. (6) Chuyn cu trúc gen NAC2 vào cây lc, phân tích các dòng lc chuyn gen. 4. Nhi ca lun án i) Tách dòng thành công gen mã hóa nhân t phiên mã NAC2 t ging lc chu hn tt L12. ii) Thit k thành công vector cha cu trúc mang gen mã hóa nhân t phiên mã NAC2 và chuyn vào cây thuc lá, kt qu biu hin protein cây chuyn gen chng minh ct k hot ng tt thuc lá. iii) Thông qua h thng, ging lc LVT c th nghim chuyn gen GUS và chuyn cu trúc mang gen mã hóa nhân t phiên mã NAC2. Biu hin GUS c trên phôi soma và cây lc hoàn chc 4 dòng lc th h T0 mang gen mã hóa nhân t phiên mã NAC2 qua kiu vi phn ng PCR. iv) Lun án tc quy trình chuyn gen hoàn chnh thông qua mô so và phôi soma cây lc nhm phc v to cây lc chuyn gen theo mi thin kh ng chu vi tình trng thic t ng. c và thc tin 5.1. Ý nghĩa khoa học 4 i) Kt qu nghiên cu ca lun án cung cp dn liu khoa hc v ng dng k thut chuyn gen nhm phc v vic ci thin tính chu hn ca cây lc. ii) Cung cp thông tin v nhân t phiên mã NAC và gen NAC2 cây lc. Kh u hn các ging lc nghiên cu và vai trò ca gen NAC2 ng vi s thic t ng. 5.2. Ý nghĩa thực tiễn Kt qu u hn ca cây lc m mô sc s d ng dng bin pháp ci thin kh u hn ca cây lc. Kt qu c ban u v cây lc chuyn gen s các m tip theo nhm phc v các nghiên cu v ci thin tính chu hn ca cây lc. 6. Cu trúc ca lun án Lun án gm 103 trang (k c tài liu tham khc chia thành các phn: M u gm 2 ng quan tài liu, 40 t li5 Kt qu và tho lun, 47 trang; Kt lu ngh: 1 trang; Các n lun án: 1 trang; Tài liu tham kho: 14 trang vi 134 tài liu tham kho bng ting Vit và ting Anh. Lun án có 25 bng s liu, 36 hình. TNG QUAN TÀI LIU Lu kho và tng kt 17 tài lic, 117 tài lic ngoài vi các ni dung liên quan, bao gm: (1) Hn và ng ca hn thc vt; (2) Các nhân t phiên mã liên quan n tính chu hn thc vt; (3) Nâng cao kh chu hn ca cây 5 trng bng k thut chuyn gen. Vi các dn liu thu thc, kt qu ng nh, lc là cây nông nghip ngc trng ph bin trên th gii. Xu th bi i chung ca khí hu làm cho hn hán bt ng xy ra nhi sut cây trc. Nhng hiu bit v chu hn giúp hiu rõ v c tính chng chu ca thc vt và cây l trong nhng nghiên cu v kh ng vi tình trng thic t ng. chu hn ca thc vt rt phc tp, không ch m hình thái gii phu mà n nhi thành phn hoá sinh trong t bào, s u chnh hong cn tính chu hn ca thc vt. Thành công ca k thut chuyc công b trên nhiu loài cây trng và nhin kh u hn ca thc vc ci thin. Hing tìm kin tính chng chu ca cây trni vu kin sinh thái phi sinh hc bt l ng th nht là tìm nhng gen liên quan trc ti n kh u hn, chu lnh, ngp úng hay phèn mng th hai nghiên cu v gen chng chng các yu t u khin ví d iption factor (TF) nhm tip cu hòa tng th a thc vt khi gu kin bt li. NAC TF . mã NAC có liên quan v chvi nhiu quá trình khác nhau trong thc vt, phát trin, quá trình lão hóa, ng các stress sinh hc và phi sinh hc. Nhiu nghiên cu ch yu tp trung vào to dòng và phân ln hn hán 6 trong h ANAC019, ANAC055, và ANAC072 Arabidopsis, BnNAC , AhNAC1, AhNAC2, AhNAC3, AhWSI 153, AhWSI 308 cây GmNAC2, GmNAC3 và GmNAC4 tr , ONAC045, SNAC1 lúa, TaNAC2, TaNAC4, TaNAC8 lúa mì Sau khi phân lp, nh c thit k vi các promoter mc hi và chuyn thành công vào mt s loài thc vt nh k thut chuyn gen. Mt s nghiên cu công b c cây trng chuyn gen thành công có kh ng chng chu kin thiu c cA.thaliana, thuCác kt qu thu u chng minh vi ng chu ti các u kin bt li t mui cao, nhi thp, nhi cao, khô hn, t i thic s ng và phát trin. NAC2 VT LI 2.1. Vc vt Lun án s dng ht ca 10 ging lc có kh u hn khác nhau do Trung tâm Nghiên cu và Phát tri - Vin Cây c và Cây thc phm cung cp. 2.2. Hóa cht và thit b Các loi hoá cht tinh khit và thông dng có ngun gc t các hãng Taq- c hiu c gel và tách plasmid, enzyme . Các 7 chng c pháp nghiên cu 2.3 giá nhanh tính chu hn bi khô mô so theo Lê Tr. u hn n cây non theo Lê Tr. ng proline ba 2.3 dng trong nuôi cy in vitro To các dòng thuc lá và lc bng k thut nuôi cy in vitro. Ging thuc cung cp t phòng Công ngh t bào thc vt vic 3-4 lá thc s d tin hành các thí nghim phc v cho chuyi và chuyn gen, to cây hoàn chnh. lc qua mô so hóa và phôi soma c tin hành da mt s tác gi . To mô so trong ti 10 ngày, to phôi soma trong 7 tun, tái sinh cây và to cây hoàn chnh. n gen thông qua mô sc tin hành da trên nghiên cu ca mt s tác gi. 2.3c phân t Nghiên cu thông tin v gen và thit k cp mi nhân gen: Các c thao tác: i) thu thp trình t nucleotit t ngân hàng gen NCBI; ii) thit k cp mi; iii) Kim tra chng cp mi bng PCR. Tách chit DNA tng s . Tách chit RNA tng s bng Trizon. c tng hp theo quy trình RevertAid TM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit. 8 Phân lp gen bng k thut PCR, RT-PCR. Tách dòng gen pháp c nh trình t gen trên máy phân tích trình t t ng theo a Sanger. Thit k cu trúc chuyn gen: các phn ng ct, ghép ni to vector, to vector tái t hp và bin np vào t bào A.tumefacien bn. Phân tích biu hin gen GUS bng nhum hóa mô t bào theo (1987). có mt ca protein do gen chuyn to ra bng k thua (2001). lý s liu Các s lic x ng kê sinh hc trên máy vi tính bng phn mm Excel. Phân tích gen bng phn mm BioEdit và DNAstar. 2.4m nghiên cu Phòng Công ngh T bào thc vt, Phòng thí nghim trng m Công ngh gen Vin Công ngh Sinh hc. KT QU VÀ THO LUN 3.1. ánh giá kh u hn ca các ging nghiên cu u thi khô n mô so Thi khô mô sc s dt bi ng ca s mn kh u khô hn, chu nóng ca t bào thc vt. Bi khô mô so ca các ging lúa, ging lc, nhiu công trình nghiên cu ca các tác gi chn lc nhng dòng mô có kh c nhi cao, 9 chc hing khô khi mc sau khi b x u kin nuôi cy. 3.1.1.1. Khả năng tạo mô sẹo của các giống nghiên cứu Kh o mô so là thông s u tiên phn ánh kh thích ng ca mô vi môi trng nghiên cu nhm s dng cho các thí nghim sau này trong vi u hn ca các ging lc. Chúng tôi s dng ngun mu t phôi trc ht lc ng có b sung chng 2,4D. Kt qu nghiên cu cho thy, tt c các ging lc nghiên cu u có kh o mô so. Kh o mô so cao nht quan sát thy ging L12 và L16 (100%), thp nht là ging LVT (69,56 %). Ngun mô so thu nhn s c s dng trong các thí nghim u hn ca các ging lc n này. 3.1.1.2. Khả năng giữ nước của mô sẹo các giống nghiên cứu mc ca mô so chúng tôi tin hành x lí thi khô c khi mô so và chia tách mô so vi các t l khác nhau (1/2, 1/4, 1/8) bng lung khí vô trùng ca box cy. Tin hành thi khô 3h, 6h, 9 h liên t mc ca mô so. Kt qu thí nghim cho th m c ca mô so các ging lc sau x lý bi th i khác nhau tùy vào mi ging. T mc nhanh nht quan sát thy sau 3h thi khô c ca mô so gi tt c các ging. T mc sau 3h th nguyên c khi mô so là ít i mô so thng mc cao nht và gi mc thp nht là L12 sau 3h thc tip tc gim sau 6h thi khô tip theo so vi trng mô su. 10 3.1.1.3. Tỷ lệ sống sót của mô sẹo các giống nghiên cứu Kh c ca mô so các ging nghiên cu sau x lý bi thi khô n t l sng sót ca mô so. T kt qu x lý mc mô so cho thy, t l sng sót ca mô so t l nghch vi thi gian x lý th ging có t l sng sót ca mô so là ln nht hu ht các ng x ng vi thi gian thi khô là 3, 6, 9h). TB25 là ging có t l sng sót thp nht, ng 9h ch còn 40,63%. T l sng sót cao quan sát thy khi mô so chia tách 1/2. Kh c hi thp quan sát thy khi mô so chia tách 1/4 và 1/8. T l sng sót thp nht 12,50% ging TB25 sau 9h thi khô (chia tách 1/4) và 12,00% ging LVT sau 9h thi khô (chia tách 1/8). u hn n cây non Tỷ lệ cây héo, tỷ lệ cây phục hồi sau hạn nhân tạo Kt qu c sau khi x lý hn nhân to n cây non bng cách ngc các thm khác nhau trong quá trình thí nghim cho thy, t l cây không héo gim dn theo các thi m gây hn. T l cây phc hi gim dn theo các thm gây hn. thm h các ging phc hi toàn b, ch có 4 ging L08, L15, LVT, TB25 t l c hi thp nht quan sát thy ging TB25 (55,24%). Sau 7 ngày gây hn ging có kh c hi cao nht là L12 (73,34%) và thp nht là LVT (18,18%). T l phc hi rt thp sau 9 ngày gây hn, phn héo ca cây phc hi chi, lá xanh tr li rt ít. T l phc hi thp nht quan sát thy ging TB25 (2,94%) . Ging L12 có kh c h (30,38%). [...]... truyền học Mã số: 62 42 01 21 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – 2013 26 Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Lê Trần Bình Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Họp tại Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên Vào hồi giờ ngày tháng năm 20 : 27 CÁC CÔNG... thủ này với các trình tự amino acid trong họ trên ngân hàng gen quốc tế (Hình 3.9) Khi nghiên cứu về trình tự amino acid của gen NAC2 thu được, chúng tôi nhận thấy v ng bảo thủ NAC, có khoảng 160 amino acid từ đầu N tương tự như các gen trong họ So sánh vùng bảo thủ NAC giữa gen NAC2 và một vài gen trong họ NAC thu được các phân vùng bảo thủ từ A đến E được chỉ ra trong các khung đen của vùng NAC (hình... các gen trong họ NAC bằng phần mềm Clustal W (A – E: các phân vùng bảo thủ thuộc vùng NAC) 15 3.2.4 Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa vào v ng ảo hủ Dựa vào sự phân nhóm các protein thuộc họ NAC được đề cập trong các nghiên cứu đã công bố Chúng tôi tiến hành phân tích và so sánh v ng NAC của gen NAC2 thu được với các v ng NAC của các gen thuộc họ NAC Kết quả phân tích trình tự tương đồng trong v... nước Hàm lượng amino acid 19 proline là một chỉ tiêu được phân tích trong đánh giá cây thuốc lá chuyển gen Khi gặp điều kiện khô hạn, proline sẽ được tổng hợp tăng trong tế bào Quan sát về mặt hình thái trong quá trình xử lý hạn cho thấy, sau 9 ngày ở điều kiện thiếu nước, các dòng cây thuốc lá chuyển gen vẫn sinh trưởng bình thường trong khi cây thuốc lá không chuyển gen bắt đầu có hiện tượng h o lá... cho vi c tạo rễ cây lạc Giá thể (1 đất:1 trấu hun:1 cát vàng) làm nguyên liệu đưa cây lạc in vitro ra tự nhiên Sau hai tuần chúng tôi chuyển cây ra đất 3.4.2 Chuyển gen chỉ thị GUS thông qua vi khuẩn A.tumefaciens Hiệu suất của quá trình chuyển gen không chỉ phụ thuộc vào hệ thống tái sinh mà còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, trong đó có đặc điểm di truyền của giống Một số nghiên cứu chuyển gen thành... cấu trúc gen chịu hạn mang nhân tố phiên mã NAC2 vào mô sẹo giống lạc LVT thông qua vi khuẩn A tumefaciens theo quy trình đã được tối ưu Quá trình chuyển gen được tiến hành trên 4 lô thí nghiệm với tổng số 935 mẫu được sử dụng cho chuyển gen, có 595 mẫu tạo phôi 23 soma, 1416 chồi hình thành, trong quá trình chọn lọc kháng sinh có 189 cây sống sót trên giá thể và trồng ở nhà lưới Hình 3.26 Hình ảnh chuyển... tôi tiến hành so sánh trình tự amino acid của gen NAC2 với các nhân tố phiên mã NAC khác, nhận thấy vị trí amino acid thay đổi 115 của gen NAC2 so với gen AhNAC2 lại tương đồng hoàn toàn với các trình tự amino acid còn lại trong họ gen NAC ở các đối tượng thực vật này Do đó chúng tôi kết luận trình tự gen NAC2 thu được từ giống lạc L12 chỉ có một vị trí amino acid thứ 78 thay đổi sau khi so sánh vùng... và tăng so với đối chứng Đánh giá sự có mặt của protein do gen chuyển tạo ra Nhằm đánh giá cây trồng sau chuyển gen, chúng tôi tiến hành kỹ thuật lai Western với mong muốn kiểm tra sự có mặt của protein do gen chuyển tạo ra Trước hết protein toàn phần được tách chiết từ mẫu thuốc lá chuyển gen, điện di trên gel polyacrylamid, thấm truyền lên màng nitrocellulose rồi lai với kháng thể Quá trình hiển thị... chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu NAC2XbaI/NAC2SacI Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy đã thu được 4 cây dương tính với phản ứng PCR chiếm tỷ lệ 0,43 % số mẫu biến nạp (dòng 24, 49, 52, 89 – hình 3.25) Các dòng cây được tiếp tục trồng để thu hạt và đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển ở các thế hệ sau 24 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kế ận 1 Các giống lạc nghiên cứu được xếp thành 3 nhóm... lượng proline được xem như chỉ tiêu quan trọng trong đánh giá khả năng chịu hạn Chúng tôi đã tiến hành phân tích hàm lượng proline ở giai đoạn cây non ở thời điểm: trước hạn và sau hạn Proline như tín hiệu phản ứng của cây trồng đối với các yếu tố cực đoan của môi trường Kết quả thí nghiệm cho thấy, hàm lượng proline sau hạn tăng nhiều so với trước khi gây hạn Trong đó, giống L12 có tỷ lệ tăng cao nhất . cứu Kh o mô so là thông s u tiên phn ánh kh thích ng ca mô vi môi trng nghiên cu nhm s dng cho các thí nghim sau này trong vi u hn ca các. v ci thin tính chu hn ca cây lc. 6. Cu trúc ca lun án Lun án gm 103 trang (k c tài liu tham khc chia thành các phn: M u gm 2 ng quan tài liu,. n lun án: 1 trang; Tài liu tham kho: 14 trang vi 134 tài liu tham kho bng ting Vi t và ting Anh. Lun án có 25 bng s liu, 36 hình. TNG