BÀI tập tìm HIỂU về KHÁNG SINH RIFAMYCIN b

Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương BÀI TẬP TÌM HIỂU VỀ KHÁNG SINH RIFAMYCIN B Contents Giới thiệu Trong năm 1995, riêng thị trường tư bản tiêu thụ 20000 tấn kháng sinh, [9] với nhu cầu và xu thế phát triển thì con số này đang tiếp tục tăng trưởng, điều đó cho thấy vai trò quan trọng của sản xuất kháng sinh trong y tế, nông nghiệp và đời sống. Kể từ khi Penicillin được Alexander Fleming phát hiện (1929), và được chứng minh có tác dụng chữa bệnh (1941), đến ngày nay, kháng sinh trở thành một dược phẩm thần kỳ sớm chiếm vị trí hàng đầu trong lĩnh vực thuốc men thế giới. [4] Bên cạnh chất kháng sinh penicillin đầu đàn được sản xuất từ nấm, nhiều kháng sinh khác cũng được nghiên cứu và tổng hợp như: Cefaclor, Cephalexin (thuộc nhóm β lactam), Azithromycin, Roxrithromycin, rovamycin (thuộc nhóm macrolid), [1] Rifamycin… Trong bài này chúng ta sẽ tìm hiểu tổng quan về kháng sinh, và quan trọng hơn là khám phá những kiến thức để hiểu về Rifamycin (được biết đến với khả năng điều trị bệnh lao) như: cơ chế sinh tổng hợp, cơ chế tác động đến vi sinh vật gây hại, quy trình sản xuất trong công nghiệp và sử dụng gen hemoglobin từ vi khuẩn Vitreosicilla stercoraria để nâng cao quá trình sản xuất rifamycin B. Nhóm 9 Page 1 Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương Phần 1: VÀI NÉT VỀ KHÁNG SINH  Khái niệm kháng sinh: Kháng sinh hay còn gọi là trụ sinh là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu. Nó có tác dụng lên vi khuẩn cấp độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn. [7]  Cơ chế sinh tổng hợp chất kháng sinh ở vi sinh vật: Đây là một trong những vấn đề lý thú với nhiều giả thuyết khác nhau được đưa ra để lý giải vì sao vi sinh vật lại tổng hợp kháng sinh. Điều hiển nhiên là kháng sinh được chính vi sinh vật tổng hợp ra, song chúng không có vai trò rõ rệt nào đối với sự phát triển sinh lý bình thường của chủng sinh ra nó. [9] Bên cạnh đó, khả năng sinh tổng hợp các chất kháng sinh không phân bố đồng đều, mà tập trung chủ yếu vào nhóm hẹp các vi sinh vật. [9] Nhiều ly giải được đưa ra nào là: kháng sinh là một cách thức để dự trữ thức ăn, một thành phần của vỏ bào tử hay chỉ là một sản phẩm dư thừa… các cơ chế sinh tổng hợp này rất phức tạp và có nhiều điểm chưa được làm sáng tỏ. Trong số này có 2 lý giải được ủng hộ nhiều nhất: - Việc tổng hợp các chất kháng sinh nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh có lợi cho chủng kháng sinh. [9] Các minh chứng cho giả thuyết này là các vi sinh vật sinh kháng sinh thường gặp phổ biến ở trong đất và phần lớn là sinh vật hoại sinh sống quanh rễ thực vật – môi trường này có nhiều chất dinh dưỡng, nên để tạo ra tính cạnh tranh sinh tồn, buộc trong quá trình tiến hóa kháng sinh được chọn lọc. Nhưng có một điểm bất lợi, giả thuyết mâu thuẩn với quy luật chuỗi thức ăn, có một số trường hợp các vi sinh vật kháng sinh kiềm hãm hay tiêu diệt nhiều động vật nguyên sinh. - Chất kháng sinh kiềm hãm sự nảy mầm của bào tử cho đến khi gặp điều kiện môi trường thuật lợi. Vì hầu như các sinh vật sinh kháng sinh đều có bào tử và kháng sinh được tổng hợp ra ngay trong gia đoạn tạo bào tử của vi sinh vật. Bên cạnh đó cũng đã phát hiện một số kháng sinh ức chế nảy mầm bào tử của chính nó sinh ra. Hai quá trình tạo bào tử và sinh kháng sinh độc lập với nhau nhưng có thể được kiểm sát một cách chặt chẽ bởi sinh vật chủ. Tuy vậy, chưa logic ở chỗ một số vi sinh vật mất khả năng sinh kháng sinh mà vẫn tạo được kháng thể và ngược lại. Phần 2: TÌM HIỂU VỀ RIFAMYCIN  Lịch sử phát triển: Rifamycin là sản phẩm bật hai, ngày nay được biết đến với tính y dược chữa trị bệnh phong, lao và các bệnh nhiễm trùng do các vi khuẩn này gây ra. Và nó được tổng hợp đầu tiên năm 1957 từ quá trình lên men Streptomyces mediterranei trong Nhóm 9 Page 2 Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương phòng thí nghiệm Gruppo Lepetit SpA ở Milan bởi Piero Sensi, Maria Teresa Timbal và nhà khoa học người Israel Pinhas Margalith. [2] Sau đó , 7 refamycin đã được tìm ra và được đặt tên là B, C, D, E, S và SV. Vào năm 1969, nó đã được đổi tên thành Nocardia mediterranei khi Thiemann nhận thấy thành tế bào của nó điển hình cho loại vi khuẩn Nocardia. Sau đó, 1986, vi khuẩn lại được lấy tên Amycolapsis mediterranei do nhà khoa học Lechvalier nhận ra thành tế bào của chúng thiếu axit mycolic. Năm 2004, dựa trên rRNA 16S, Bala et al đổi tên lại thành Amycolatopsis rifamycinica. [2] Nhưng 1960 đã được nhiều người công nhận về khả năng chửa bệnh lao của chủng rifamycin.  Phân loại về Streptomyces mediterranei Lĩnh giới: Bacteria Giới: Eubacteria Ngành: Actinobacteria Bộ: Actinomycetales Họ: Streptomycetaceae Chi: streptomyces Loài: Streptomyces mediterranei S.mediterranei là vi khuẩn Gram dương, khuẩn lạc hình phóng xạ (actino-) nhưng khuẩn thể có dạng sợi, phân nhánh như nấm (myces). [3]  Cơ chế sinh tổng hợp rifamycin. Trong bài này chúng ta chỉ tìm hiểu về sản phẩm rifamycin B, nên cơ chế này sẽ giúp hiểu hơn cách thức một rifamycin được tổng hợp. Cụ thể được trình bày qua các sơ đồ Hình 1, 2, 3. Cơ chế tổng hợp này thông qua hai con đường tổng hợp khác nhau, rifamycin là một polyketide được lắp ráp từ một đơn vị vòng thơm, AHBA (3- amino-5-hydroxybenzoic acid), thông qua việc kéo dài chuỗi bằng 2 đơn vị acetate và 8 propionate. AHBA lại có nguồn gốc từ còn đường shikimate. [2, 5] Nhóm 9 Page 3 Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương Hình 1 : Con đường sinh tổng hợp đơn vị khỏi đầu Rifamycin Polyketide, 3- amino-5-hydroxybenzoic acid (AHBA). [5] Nhóm 9 Page 4 Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương Hình 2: Con đường sinh tổng hợp rifamycin và xây dựng hay đề xuất vai trò của đơn gen sinh tổng hợp rif [5] Cả hai quá trình được các cụm rif chịu trách nhiệm sinh tổng hợp rifamycin. Nó chứa các gen từ rifG qua đến rif, được biểu hiện để sinh tổng hợp AHBA. RifK, rifL, rifM và rifN được hoạt động như các transaminase để hình thành nên các tiền thân kanosamine AHBA. “RifH” mã hóa aminoDAHP sythase xúc tác sự ngưng tụ giữa 1- deoxy-1-imino-d-erythrose-4-phosphate và phosphoenolpyruvate. Từ rifA qua rife mã hóa cho một module I polyketide sythase, với các module tải là non-ribosomal peptide synthase. Trong đó, rifE lắp rắp một undecaketide thẳng, được theo sau bởi riff, mã hóa một synthase amide và làm cho undecaketide được phóng thích tạo thành cấu trúc macrolactam. Hơn nữa, cụm rif chứa nhiều protein điều hòa và các gen lặng glycosylating. Other types of genes seem to perform post-synthase modifications of the original polyketide. [2](dịch không hiểu) Nhóm 9 Page 5 Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương Hình 3: Cụm gen sinh tổng hợp rif và đoạn (sườn or chầu) gen mã hóa protein ribosome, tiểu đơn vị β, β’ của RNA polymerase phụ vào DNA.[5]  Cơ chế tác động của rifamycin đến vi sinh vật Hình 4: Cơ chế tác động của kháng sinh[3] Rifamycin B là chất kháng sinh nhẹ, tiền chất để tổng hợp các kháng sinh khác có tác dụng lâm sàng. Trong hình 4, trình bày tất cả các cơ chế tác dụng của các loại kháng sinh, nhưng chúng ta chỉ quan tâm tới cơ chế tác động đến quá trình phiên mã của rifamycin. Nhóm 9 Page 6 Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương Hoạt động kháng khuẩn của rifamycin là kết quả ức chế tổng hợp RNA từ DNA [5] thông qua việc nó có ái lực cao với RNA polymerase. Ái lực này khác nhau giữa prokaryotes và eukaryotic, sẽ tương tác mạnh hơn với RNA polymerase phiên mã DNA của prokaryotes. Đây cũng là cơ chế chung cho tất cả các hoạt động kháng khuẩn của rifamycin. Dựa trên dữ liệu cấu trúc tinh thể của kháng sinh liên kết với RNA polymerase chỉ ra rằng rifamycin chặn quá trình sinh tổng hợp bằng cách đụng độ không gian với sự phát triển các oligonucleotide. [2] Kháng sinh gây trở ngại trong giai đoạn đầu tổng hợp kháng sinh.[5] Nếu các chuỗi oligoribonucleotide được tổng hợp dài hơn, vượt giai đoạn đầu thì giảm tương tác của rifamycin. Phần 3: QUY TRÌNH SẢN XUẤT RIFAMYCIN TRONG CÔNG NGHIỆP  Sơ đồ công nghệ: Hình 5: Quy trình sản xuất rifamycin[8] Nhóm 9 Page 7 Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương Quá trình sản xuất rifamycin trong lên men được chia làm 2 giai đoạn chính: - Lên men. - Xử lý dịch lên men và tinh chế thu Rifamycin B.  Chọn giống. Đây là giai đoạn quyết định tới chất lượng của sản phẩm và năng suất sinh học trong quy trình sản xuất nên việc chọn chủng vi sinh vật đặc biệt quan trọng. Trong quy trình này, với yếu tố trên, người ta đã tiến hành gây đột biến Streptomyces mediterranei và phân lập ra S.mediterranei XC 9-25 dùng để sản xuất rifamycin B. Quá trình gây đột biến và phân lập như sau: 1 Sau 14 ngày, ở 28°C Hình 6: Sơ đồ gây đột biến và phân lập Streptomyces mediterranei Tiêu chí để chọn khuẩn lạc đạt yêu cầu sau khi nuôi cấy trên môi trường agar Bennett là dự trên hình thái của chúng vì có sự tương quan giữa hình thái khuẩn lạc và khả năng sinh rifamycin B, sẽ có 6 khuẩn lạc khác nhau, trong đó hiệu suất sản xuất rifamycin cao nhất đạt được khi sử dụng khuẩn lạc có màu đỏ cam, hình hoa hồng trống ở giữa và đường kính dài 2-3mm. Nhóm 9 Page 8 Bào tử Xử lý với N-methyl-N’-nitroso-N-introguanidine Cm 1mg/ml, pH 9.0, 28°C, 60ph Bào tử đột biến Rửa, nuôi trên mt agar Bennett Chọn khuẩn lạc sống, sx R B nuôi trên mt lỏng Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương Hình 7: Các dạng khuẩn lạc  Môi trường nuôi cấy: Sau khi người ta phân lập được giống mới thì phải tối ưu hóa môi trường sống của vi sinh vật để hiệu suất tạo ra rifamycin là cao nhất.  Hóa chất và nguyên liệu sử dụng: • Glucoso (ADWIC, gypt) • KNO3 (ADWIC, Egypt) • (E.Merck, Darmstadt, Germany) • (E.Merck, Darmstadt, Germany) • (E.Merck, Darmstadt, Germany) • Chất chiết nấm men • Cao thịt • Tinh chất malt • Agar • Tinh bột • Peptone • Bột đậu nành • Bột yến mạch • Bột cá • Nước cất  Môi trường lên men: 12% glucose, 2% bột đậu nành, 1% peptone, 0,5% bột cá, 0,8% , 0,05%, 0,0001% , 0,5% . [3]  Quá trình nhân giống:[3] Mục đích của giai đoạn này là tạo ra một số lượng đủ lớn vi khuẩn cung cấp cho quá tình lên men.  Cấy giống trên thạch nghiêng: - Tỉ lệ thành phần cho 11 môi trường: 4g chất chiết nấm men, 4g tinh chất mạch nha, 4g glucose, 20g bột yến mạch, 20g agar, nước cất cho đủ 1l. - Thời gian ủ: 7-8 ngày - Nhiệt độ: 28Š C - Độ ẩm tương đối: 40%-50% Nhóm 9 Page 9 Bài tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương Hình 8: Cấy giống trên thạch nghiên  Cấy khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch sang môi trường lỏng: - Cấy giống vào erlen dung tích 250ml chứa 25ml môi trường. - Thành phần môi trường: 2% tinh bột, 1,5% glucose, 1% peptone, 0,05% , 0,03% , 0,3% . - Các erlen được đặt trên Rotary Shaker với tốc độ quay 220 rpm. - Thời gian nuôi cấy: 48h - Nhiệt độ: 28 ŠC - Tỷ lệ giống cấy vào môi trường là 10% (v/v) Để lên men 30 môi trường cần có 120 erlen. Khi nhận giống cho các mẻ lên men tiếp theo ta có thể lấy 2ml canh trường của các erlen này cho vào erlen mới có thành phần giống như erlen đã lên men, bỏ qua giai đoạn cấy giống trên thạch nghiêng. Hình 9: Rotary Shaker  Thiết bị:  Thiết bị tiệt trùng: Nhóm 9 Page 10 [...]... b sung thêm glucose tối thiểu còn lại trong dịch lên men là 1- 1.5% Nhiệt độ lên men : 28°C Thời gian lên men : 9 ngày Tốc độ khuấy trộn: 130 rpm Thiết b lên men ở đây chúng ta chọn là thiết b lên men có b đảo trộn cơ học dạng sỏi b t: dạng thiết b lên men này được sử dụng rộng rãi cho các quá trình tiệt trùng để nuôi cấy vi sinh < /b> vật- sản sinh < /b> ra các chất hoạt hóa sinh < /b> học Page 11 B i < /b> tập < /b> vi sinh.< /b> .. này là nhân b n gen vhb từ V.stercoraria trong một vertor biểu hiện cho A.mediterranei và đánh giá ảnh hưởng khả năng hấp thụ oxy và sản xuất rifamycin < /b> B 2 Vật liệu và phương pháp: Vi sinh < /b> vật A.mediterranei Msb2 đã được sử dụng trong nghiên cứu này Msb2 là một dòng đột biến của M18, được cô lập có độ nhạy cao với barbital Khuynh hướng này tạo ra sản phẩm rifamycin < /b> B gấp 3 lần so với chủng b mẹ (M18)... Kết quả được so sánh với MSB dòng của cha mẹ ( Hình 2) Nhóm 9 Page 20 B i < /b> tập < /b> vi sinh < /b> 2 GVHD: Phạm Thị Hương Hình 4.2: Kết quả so sánh thời gian sản xuất rifamycin < /b> B ( đường thẳng xuyên suốt ) và tăng trưởng ( đường chấm chấm ) b ng dòng thay đổi ( Msb nhăn nheo ) Khung khuôn ( 250 ml ) chứa 70 ml của sản xuất với trung b nh 0.7 g ; có barbital (tam giác đóng) và không có barbital ( tam giác mở ) tại... kết tinh Rifamycin < /b> B dưới dạng tinh thể có thể được thực hiện rất đơn giản b ng cách b sung trực tiếp vào dung môi sau khi tẩy màu một lượng nhỏ kali acetat ( hay natri acetat) tiến hành cô chân không ở nhiệt độ thấp, sau đó b sung mầm để Rifamycin < /b> B tự kết tinh Có 2 phương pháp b sung mầm: • Mần them vào là b t sản phẩm- phương pháp b b t: dung dung môi là cồn để khuấy b t để chúng phân b đều và... cấy, sinh < /b> tổng hợp các sản phẩm lên men chính, rifamycin < /b> B, …Khi nuôi cấy đạt đến một giai đoạn của pha tĩnh, xạ Nhóm 9 Page 15 B i < /b> tập < /b> vi sinh < /b> 2 GVHD: Phạm Thị Hương khuẩn này sẽ tạo ra dung dịch có độ nhớt cao, khiến cho độ oxy hòa tan thấp Ở giai đoạn này, trao đổi chất thứ cấp b t đầu buộc quá trình nuôi cấy cần nhiều oxy hơn.Từ năm 1961, để chống lại hiện tượng này, axit 5,5-diethybarbituric (barbital)... vi sinh < /b> 2 GVHD: Phạm Thị Hương Hình 11: Thiết b lên men với b đảo trộn cơ học dạng sỏi b t khí[4] c) Thiết b trích ly:[8] Mục đích: Rifamycin < /b> B ra khỏi dịch lên men Phương pháp: Rifamycin < /b> B thường được trích ly ra khỏi dịch lên men b ng dung môi ethylacetate, dịch lên men được điều chỉnh đến pH 2.0 b ng HCL, nhiệt độ 10°C Nhằm hạn chế lượng Rifamycin < /b> B bị phân hủy, quá trình trích ly được thực hiện... dụng gen hemoglobin từ V stercor aria (hoặc từ một sinh < /b> vật khác nhau) trong A mediterranei Vì vậy, với mục tiêu này , các gen VHB được nhân b n vô tính , và pUAMSAG1 vector đã được xây dựng và vector biểu hiện hemoglobin (VHB) được phát triển một vector plasmid nhân b n với gen đánh dấu hiệu chính kịp thời Nhóm 9 Page 19 B i < /b> tập < /b> vi sinh < /b> 2 GVHD: Phạm Thị Hương Độ nhạy của A mediterranei MSB kanamycin... rifamycin < /b> B được đánh giá Tuy nhiên, do dòng của cha mẹ (như dòng công nghiệp nhất) yêu cầu barbital để sản xuất rifamycin < /b> B duy nhất, sản xuất của nó được đánh giá có và không có barbital Các biến nạp A mediterranei, MSB chứa pUAMSAG1 (MSB-sag), và dòng với pUAMAE3 (không có biểu hiện b ng VHB) đã được nuôi cấy tại b nh lắc dưới khí thấp (như được mô tả trong các tài liệu và phần phương pháp) Những điều... pháp trích ly 2 lần dung môi, với lần đầu trích ly Rifamycin < /b> B bằng ethyl acetate; tiếp theo Rifamycin < /b> B lại được trích ly ngược sang dung dịch đệm phosphate, pH 7.38 Sau đó Rifamycin < /b> B lại được trích ly sang dung môi lần thứ 2, với lượng dung môi ít hơn Nhóm 9 Page 12 B i < /b> tập < /b> vi sinh < /b> 2 GVHD: Phạm Thị Hương Hình 12: Sơ đồ trích ly rifamycin < /b> d) Thiết b chưng cất: - Mục đích: cô đặc dung dịch sau trích... rằng sự hấp thu oxy cao hơn b i dòng MSB - sag là do sự biểu hiện của gen VHB nhân b n vô tính , RT-PCR được sử dụng RNA được chiết xuất từ tế b o idiophase của giống b mẹ và chuyển đổi, và RT-PCR các thí nghiệm được thực hiện b ng cách sử dụng một lớp sơn lót cho một bp 503 Không có b ng trong dòng của cha mẹ (MSB) được phát hiện (Hình 4, hẻm 1), trong khi dòng biến đổi (MSB-nhóm SAG) sản xuất rõ ràng . B i tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương B I TẬP TÌM HIỂU VỀ KHÁNG SINH RIFAMYCIN B Contents Giới thiệu Trong năm 1995, riêng thị trường tư b n tiêu thụ 20000 tấn kháng sinh, [9]. nhóm macrolid), [1] Rifamycin Trong b i này chúng ta sẽ tìm hiểu tổng quan về kháng sinh, và quan trọng hơn là khám phá những kiến thức để hiểu về Rifamycin (được biết đến với khả năng điều trị b nh lao). trình sản xuất rifamycin B. Nhóm 9 Page 1 B i tập vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương Phần 1: VÀI NÉT VỀ KHÁNG SINH  Khái niệm kháng sinh: Kháng sinh hay còn gọi là trụ sinh là những chất có khả