BÀI tập tìm HIỂU về KHÁNG SINH RIFAMYCIN b

Cơ chế sinh tổng hợp chất kháng sinh ở vi sinh vật: 2 Phần 3: QUY TRÌNH SẢN XUẤT RIFAMYCIN TRONG CÔNG NGHIỆP 7... Giới thiệu Trong năm 1995, riêng thị trường tư bản tiêu thụ 20000 tấn kh

BÀI TẬP TÌM HIỂU VỀ KHÁNG SINH RIFAMYCIN B

Contents

2 Cơ chế sinh tổng hợp chất kháng sinh ở vi sinh vật: 2

Phần 3: QUY TRÌNH SẢN XUẤT RIFAMYCIN TRONG CÔNG NGHIỆP 7

Giới thiệu

Trong năm 1995, riêng thị trường tư bản tiêu thụ 20000 tấn kháng sinh, [9] vớinhu cầu và xu thế phát triển thì con số này đang tiếp tục tăng trưởng, điều đó chothấy vai trò quan trọng của sản xuất kháng sinh trong y tế, nông nghiệp và đờisống

Kể từ khi Penicillin được Alexander Fleming phát hiện (1929), và được chứng

minh có tác dụng chữa bệnh (1941), đến ngày nay, kháng sinh trở thành một dượcphẩm thần kỳ sớm chiếm vị trí hàng đầu trong lĩnh vực thuốc men thế giới [4]

Bên cạnh chất kháng sinh penicillin đầu đàn được sản xuất từ nấm, nhiều kháng sinh khác cũng được nghiên cứu và tổng hợp như: Cefaclor, Cephalexin (thuộc nhóm β lactam), Azithromycin, Roxrithromycin, rovamycin (thuộc nhóm macrolid), [1] Rifamycin…

Trong bài này chúng ta sẽ tìm hiểu tổng quan về kháng sinh, và quan trọng hơn

là khám phá những kiến thức để hiểu về Rifamycin (được biết đến với khả năng

điều trị bệnh lao) như: cơ chế sinh tổng hợp, cơ chế tác động đến vi sinh vật gâyhại, quy trình sản xuất trong công nghiệp và sử dụng gen hemoglobin từ vi khuẩn

Vitreosicilla stercoraria để nâng cao quá trình sản xuất rifamycin B.

Phần 1: VÀI NÉT VỀ KHÁNG SINH

1 Khái niệm kháng sinh:

Kháng sinh hay còn gọi là trụ sinh là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩnhay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu Nó có tác dụng lên vikhuẩn cấp độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phảnứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn [7]

2 Cơ chế sinh tổng hợp chất kháng sinh ở vi sinh vật:

Đây là một trong những vấn đề lý thú với nhiều giả thuyết khác nhau được đưa

ra để lý giải vì sao vi sinh vật lại tổng hợp kháng sinh Điều hiển nhiên là khángsinh được chính vi sinh vật tổng hợp ra, song chúng không có vai trò rõ rệt nào đốivới sự phát triển sinh lý bình thường của chủng sinh ra nó [9] Bên cạnh đó, khảnăng sinh tổng hợp các chất kháng sinh không phân bố đồng đều, mà tập trungchủ yếu vào nhóm hẹp các vi sinh vật [9]

Nhiều ly giải được đưa ra nào là: kháng sinh là một cách thức để dự trữ thức ăn,một thành phần của vỏ bào tử hay chỉ là một sản phẩm dư thừa… các cơ chế sinh

tổng hợp này rất phức tạp và có nhiều điểm chưa được làm sáng tỏ Trong số này

có 2 lý giải được ủng hộ nhiều nhất:

- Việc tổng hợp các chất kháng sinh nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh

có lợi cho chủng kháng sinh [9] Các minh chứng cho giả thuyết này là các

vi sinh vật sinh kháng sinh thường gặp phổ biến ở trong đất và phần lớn làsinh vật hoại sinh sống quanh rễ thực vật – môi trường này có nhiều chấtdinh dưỡng, nên để tạo ra tính cạnh tranh sinh tồn, buộc trong quá trình tiếnhóa kháng sinh được chọn lọc Nhưng có một điểm bất lợi, giả thuyết mâuthuẩn với quy luật chuỗi thức ăn, có một số trường hợp các vi sinh vậtkháng sinh kiềm hãm hay tiêu diệt nhiều động vật nguyên sinh

- Chất kháng sinh kiềm hãm sự nảy mầm của bào tử cho đến khi gặp điều

kiện môi trường thuật lợi Vì hầu như các sinh vật sinh kháng sinh đều cóbào tử và kháng sinh được tổng hợp ra ngay trong gia đoạn tạo bào tử của visinh vật Bên cạnh đó cũng đã phát hiện một số kháng sinh ức chế nảy mầmbào tử của chính nó sinh ra Hai quá trình tạo bào tử và sinh kháng sinh độclập với nhau nhưng có thể được kiểm sát một cách chặt chẽ bởi sinh vật chủ.Tuy vậy, chưa logic ở chỗ một số vi sinh vật mất khả năng sinh kháng sinh

mà vẫn tạo được kháng thể và ngược lại

Phần 2: TÌM HIỂU VỀ RIFAMYCIN

1 Lịch sử phát triển:

Rifamycin là sản phẩm bật hai, ngày nay được biết đến với tính y dược chữa trị

bệnh phong, lao và các bệnh nhiễm trùng do các vi khuẩn này gây ra Và nó được

tổng hợp đầu tiên năm 1957 từ quá trình lên men Streptomyces mediterranei trong

phòng thí nghiệm Gruppo Lepetit SpA ở Milan bởi Piero Sensi, Maria Teresa Timbal

và nhà khoa học người Israel Pinhas Margalith [2] Sau đó , 7 refamycin đã được tìm

ra và được đặt tên là B, C, D, E, S và SV

Vào năm 1969, nó đã được đổi tên thành Nocardia mediterranei khi Thiemann

nhận thấy thành tế bào của nó điển hình cho loại vi khuẩn Nocardia Sau đó, 1986, vi

khuẩn lại được lấy tên Amycolapsis mediterranei do nhà khoa học Lechvalier nhận ra

thành tế bào của chúng thiếu axit mycolic Năm 2004, dựa trên rRNA 16S, Bala et al

đổi tên lại thành Amycolatopsis rifamycinica [2] Nhưng 1960 đã được nhiều người

công nhận về khả năng chửa bệnh lao của chủng rifamycin

2 Phân loại về Streptomyces mediterranei

Lĩnh giới: Bacteria

Giới: Eubacteria

Ngành: Actinobacteria

Bộ: Actinomycetales

Họ: Streptomycetaceae

Chi: streptomyces

Loài: Streptomyces mediterranei

S.mediterranei là vi khuẩn Gram dương, khuẩn lạc hình phóng xạ (actino-) nhưngkhuẩn thể có dạng sợi, phân nhánh như nấm (myces) [3]

3 Cơ chế sinh tổng hợp rifamycin

Trong bài này chúng ta chỉ tìm hiểu về sản phẩm rifamycin B, nên cơ chế này sẽgiúp hiểu hơn cách thức một rifamycin được tổng hợp Cụ thể được trình bày qua các

sơ đồ Hình 1, 2, 3 Cơ chế tổng hợp này thông qua hai con đường tổng hợp khácnhau, rifamycin là một polyketide được lắp ráp từ một đơn vị vòng thơm, AHBA (3-amino-5-hydroxybenzoic acid), thông qua việc kéo dài chuỗi bằng 2 đơn vị acetate

và 8 propionate AHBA lại có nguồn gốc từ còn đường shikimate [2, 5]

Hình 1 : Con đường sinh tổng hợp đơn vị khỏi đầu Rifamycin Polyketide,

3-amino-5-hydroxybenzoic acid (AHBA) [5]

Hình 2: Con đường sinh tổng hợp rifamycin và xây dựng hay đề xuất vai trò của đơn gen

sinh tổng hợp rif [5]

Cả hai quá trình được các cụm rif chịu trách nhiệm sinh tổng hợp rifamycin Nó

chứa các gen từ rifG qua đến rif, được biểu hiện để sinh tổng hợp AHBA RifK, rifL, rifM và rifN được hoạt động như các transaminase để hình thành nên các tiền thân

kanosamine AHBA “RifH” mã hóa aminoDAHP sythase xúc tác sự ngưng tụ giữa deoxy-1-imino-d-erythrose-4-phosphate và phosphoenolpyruvate Từ rifA qua rife

1-mã hóa cho một module I polyketide sythase, với các module tải là non-ribosomal

peptide synthase Trong đó, rifE lắp rắp một undecaketide thẳng, được theo sau bởi

riff, mã hóa một synthase amide và làm cho undecaketide được phóng thích tạo thành

cấu trúc macrolactam Hơn nữa, cụm rif chứa nhiều protein điều hòa và các gen lặng

glycosylating Other types of genes seem to perform post-synthase modifications ofthe original polyketide [2](dịch không hiểu)

Hình 3: Cụm gen sinh tổng hợp rif và đoạn (sườn or chầu) gen mã hóa protein ribosome,

tiểu đơn vị β, β’ của RNA polymerase phụ vào DNA.[5]

4 Cơ chế tác động của rifamycin đến vi sinh vật

Hình 4: Cơ chế tác động của kháng sinh[3]

Rifamycin B là chất kháng sinh nhẹ, tiền chất để tổng hợp các kháng sinh khác cótác dụng lâm sàng Trong hình 4, trình bày tất cả các cơ chế tác dụng của các loại

kháng sinh, nhưng chúng ta chỉ quan tâm tới cơ chế tác động đến quá trình phiên mãcủa rifamycin

Hoạt động kháng khuẩn của rifamycin là kết quả ức chế tổng hợp RNA từ DNA[5] thông qua việc nó có ái lực cao với RNA polymerase Ái lực này khác nhau giữaprokaryotes và eukaryotic, sẽ tương tác mạnh hơn với RNA polymerase phiên mãDNA của prokaryotes Đây cũng là cơ chế chung cho tất cả các hoạt động khángkhuẩn của rifamycin Dựa trên dữ liệu cấu trúc tinh thể của kháng sinh liên kết vớiRNA polymerase chỉ ra rằng rifamycin chặn quá trình sinh tổng hợp bằng cách đụng

độ không gian với sự phát triển các oligonucleotide [2] Kháng sinh gây trở ngạitrong giai đoạn đầu tổng hợp kháng sinh.[5] Nếu các chuỗi oligoribonucleotide đượctổng hợp dài hơn, vượt giai đoạn đầu thì giảm tương tác của rifamycin

Phần 3: QUY TRÌNH SẢN XUẤT RIFAMYCIN TRONG CÔNG NGHIỆP

1 Sơ đồ công nghệ:

Hình 5: Quy trình sản xuất rifamycin[8]

Quá trình sản xuất rifamycin trong lên men được chia làm 2 giai đoạn chính:

quy trình này, với yếu tố trên, người ta đã tiến hành gây đột biến Streptomyces

mediterranei và phân lập ra S.mediterranei XC 9-25 dùng để sản xuất rifamycin B.

Quá trình gây đột biến và phân lập như sau:

Nhóm 9 N-methyl-N’-nitroso-N-introguanidineXử lý vớiPage 8

Cm 1mg/ml, pH 9.0, 28°C, 60ph

Bào tử

1 Sau 14 ngày, ở 28°C

Hình 6: Sơ đồ gây đột biến và phân lập Streptomyces mediterranei

Tiêu chí để chọn khuẩn lạc đạt yêu cầu sau khi nuôi cấy trên môi trường agarBennett là dự trên hình thái của chúng vì có sự tương quan giữa hình thái khuẩn lạc

và khả năng sinh rifamycin B, sẽ có 6 khuẩn lạc khác nhau, trong đó hiệu suất sản

xuất rifamycin cao nhất đạt được khi sử dụng khuẩn lạc có màu đỏ cam, hình hoahồng trống ở giữa và đường kính dài 2-3mm

Hình 7: Các dạng khuẩn lạc

3 Môi trường nuôi cấy:

Sau khi người ta phân lập được giống mới thì phải tối ưu hóa môi trường sống của

vi sinh vật để hiệu suất tạo ra rifamycin là cao nhất

a) Hóa chất và nguyên liệu sử dụng:

 Glucoso (ADWIC, gypt)

 KNO3 (ADWIC, Egypt)

 KH2PO4 (E.Merck, Darmstadt, Germany)

 CoCl2 (E.Merck, Darmstadt, Germany)

4 Quá trình nhân giống:[3]

Mục đích của giai đoạn này là tạo ra một số lượng đủ lớn vi khuẩn cung cấp cho quá tình lên men

a) Cấy giống trên thạch nghiêng:

- Tỉ lệ thành phần cho 11 môi trường: 4g chất chiết nấm men, 4g tinh chấtmạch nha, 4g glucose, 20g bột yến mạch, 20g agar, nước cất cho đủ 1l

- Thời gian ủ: 7-8 ngày

- Nhiệt độ: 28ͦ C

- Độ ẩm tương đối: 40%-50%

Hình 8: Cấy giống trên thạch nghiênb) Cấy khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch sang môi trường lỏng:

- Cấy giống vào erlen dung tích 250ml chứa 25ml môi trường

- Thành phần môi trường: 2% tinh bột, 1,5% glucose, 1% peptone, 0,05%

KNO3, 0,03% KH2PO4, 0,3% CaCO3

- Các erlen được đặt trên Rotary Shaker với tốc độ quay 220 rpm

- Thời gian nuôi cấy: 48h

- Nhiệt độ: 28 ͦC

- Tỷ lệ giống cấy vào môi trường là 10% (v/v)

Để lên men 30m3 môi trường cần có 120 erlen Khi nhận giống cho các mẻlên men tiếp theo ta có thể lấy 2ml canh trường của các erlen này cho vàoerlen mới có thành phần giống như erlen đã lên men, bỏ qua giai đoạn cấygiống trên thạch nghiêng

Hình 9: Rotary Shaker

5 Thiết bị:

a) Thiết bị tiệt trùng:

Mục đích để chuẩn bị môi trường vô khuẩn cho quá trình lên men

Thiết bị tiệt trùng liên tục YHC-20 được chọn trong quy trình công nghệ, thiết

bị này có khả năng thu hồi nhiệt đến 77%, thiết bị trao đổi nhiệt ở dạng tấm và bộgiữ nhiệt có kết cấu đặt biệt nên kéo dài quảng đường của dòng môi trường và tăngcường khả năng khuấy trộn [6]

Hình 10: Thiết bị tiệt trùng liên tục YHC-20b) Thiết bị lên men:

 Mục đích: cung cấp môi trường và điều kiện cho Streptomyces mediterraneitổng hợp rifamycin B

 Điều kiện lên men:[8]

- Lên men hiếu khí Lượng oxy cung cấp chiếm 25% thể tích môi trường lênmen

- pH môi trường trước khi lên men 6.4 – 6.6 pH được ổn định nhờ bổ sungamino nitrogen( NH2-N) liên tục trong suốt quá trình lên men với hàmlượng 8.96 mg/l => oxy và ammonia phait tuyệt đối vô trùng

- Trong quá trình lên men phải bổ sung thêm glucose tối thiểu còn lại trongdịch lên men là 1- 1.5%

- Nhiệt độ lên men : 28°C

- Thời gian lên men : 9 ngày

- Tốc độ khuấy trộn: 130 rpmThiết bị lên men ở đây chúng ta chọn là thiết bị lên men có bộ đảo trộn cơ họcdạng sỏi bọt: dạng thiết bị lên men này được sử dụng rộng rãi cho các quá trình tiệttrùng để nuôi cấy vi sinh vật- sản sinh ra các chất hoạt hóa sinh học

Hình 11: Thiết bị lên men với bộ đảo trộn cơ học dạng sỏi bọt khí[4]

Tỉ lệ dịch lọc: dung môi thường chọn trong khoảng 4- 10V dịch lọc/1V dungmôi

Trong một sso công nghệ, nhằm cải thiện chất lượng sản phẩm, người ta có thể

áp dụng phương pháp trích ly 2 lần dung môi, với lần đầu trích ly Rifamycin Bbằng ethyl acetate; tiếp theo Rifamycin B lại được trích ly ngược sang dung dịchđệm phosphate, pH 7.38 Sau đó Rifamycin B lại được trích ly sang dung môi lầnthứ 2, với lượng dung môi ít hơn

Hình 12: Sơ đồ trích ly rifamycind) Thiết bị chưng cất:

- Mục đích: cô đặc dung dịch sau trích ly, thu hồi dung môi

- Nguyên tắc: dung môi ethyl acetate bay hơi ở nhiệt độ 77,2ºC, còn Rifamycin Bkhông bay hơi

- Phương pháp:

 Chưng cất có hồi lưu sản phẩm đỉnh, cấp nhiệt gián tiếp bằng hơi nước

 Sử dụng tháp chưng cất nhiều mân

 Nhập liệu ở giữa tháp

 Thu sản phẩm đáy có nồng độ Rifamycin B ≥70%

 Nhiệt độ chưng cất 78°C

Hình 13: Sơ đồ chưng cấtc) Tẩy màu:

Mục đích: để tẩy màu và loại bỏ một số tạp chất khác

Phương pháp: Người ta thường bổ sung trực tiếp chất hấp phụ vào dung môichứa Rifamycin B sau trích ly, sử dụng phổ biến nhất là than hoạt tính Sau đóthan hoạt tính được tách và rửa lại bằng sử dụng thiệt bị lọc hút băng tải hoặcthiết bị lọc hút kiểu thùng quay Phần than sau lọc được đưa đi chưng thu hồidung môi và xử lý hoàn nguyên, phục vụ cho các mẻ sau

bỏ sung mầm để Rifamycin B tự kết tinh Có 2 phương pháp bổ sung mầm:

 Mần them vào là bột sản phẩm- phương pháp bỏ bột: dung dung môi là cồn để khuấy bột để chúng phân bố đều và nhanh trong dung dịch với hàm lượng: 100-150g cho 1 tấn sản phẩm

 Mầm được chuẩn bị từ trước- phương pháp giống: thực hiện quá trình kếttinh tạo 1 sản phẩm rồi dung nó làm nhân cho mẻ sau, phương pháp này tương đối dể thao tác Lượng giống cần phải them vào là 2% so với khối lượng dung dịch

Hình 14: Thiết bị kết tinhe) Lọc, sấy thu Rifamycin B tự nhiên

Mục đích: đuổi hết dung môi trích ly, giảm hàm lượng, hoàn thiện sảnphẩm.

Phương pháp: Khi sản phẩm đã đạt độ tinh sạch theo yêu cầu, thường độtinh khiết không dưới 99,5%, chúng được lọc tách tinh thể, tiếp theo rửa vàlàm khô sơ bộ bằng dung môi kỵ nước như izopropanol hay butylalcohl; hútchân không tách dung môi rồi sấy bằng không khí nóng dạng sản phẩm tinhthể Rifamycin B

Thiết bị dấy chân không kiểu thùng quay (thích hợp cho dược phẩm)

- Thùng sấy hình trụ ngang có hai vỏ, vỏ ngoài được gia nhiệt bằng hơi quá nhiệt thùng sấy được quấy đảo liên tục, nguyên liệu sấy bên trong luôn được tiếp xúc với bề mặt gia nhiệt

- Gia nhiệt kiểu gián tiếp nên tránh được ô nhiễm

- Thiết bị sấy chân không kiểu này hiệu suất tăng nhiều lân so với loại thông thường

- Nhiệt độ sấy: 80 ͦ C

- Độ ẩm sau khi sấy: 3-5%

Hình 12: Máy sấy chân không đảo trộn SZG-0.1

Phần 4: BIỂU HIỆN CỦA GEN HEMOGLO VI KHUẨN TỪ Vitreoscilla strcoraria

ĐỂ LÀM TĂNG SẢN XUẤT Rifamycin B TRONG Amycolatopsis mediterranei [10]

1 Đặt vấn đề:

Amycolatopsos meditarranei là một loại vi khuẩn đất sản xuất các chất chuyển

hóa trung gian, bào gồm cả rifamycins_thuốc kháng sinh chủ yếu dùng trong điềutrị bệnh lao, phong và nhiễm trùng mycobacteria khác

Nhu cầu về thuốc kháng sinh này đang tăng lên hàng năm vì các dẫn xuấtrifamycin cho thấy khả năng tuyệt vời trong việc chống lại các vi sinh vật cơ hội

trong các bệnh liên quan tới AIDS Tuy nhiên, trong công nghiệp, theo quan sátthì thấy có một số vấn đề liên quan tới việc gia tăng sản xuất để đáp ứng đủ nhucầu Ví dụ: nhu cầu oxy rất cao trong nuôi cấy, sinh tổng hợp các sản phẩm lênmen chính, rifamycin B,…Khi nuôi cấy đạt đến một giai đoạn của pha tĩnh, xạkhuẩn này sẽ tạo ra dung dịch có độ nhớt cao, khiến cho độ oxy hòa tan thấp Ởgiai đoạn này, trao đổi chất thứ cấp bắt đầu buộc quá trình nuôi cấy cần nhiều oxyhơn.Từ năm 1961, để chống lại hiện tượng này, axit 5,5-diethybarbituric(barbital) được thêm vào quá trình lên men công nghiệp để tổng hợp ưu tiên đốivới rifamycin B Năm 2003, phát hiện ra rằng hợp chất này cũng ức chế chuỗi hô

hấp, để lại nhiều oxy trong sinh tổng hợp Mặt khác, được biết Vitreoscilla

stercoraria có thể phát triển trong môi trường nghèo oxy do thuộc loại vi khuẩn

Hemoglobin Gen mã hóa cho protein này, (vhb), được nêu rõ trong các vi sinh

vật dạng sợi công nghiệp quan trọng khác Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng biểu

hiện gen hvb có thể cải thiện đáng kể năng suất cephalosporin và erythromycin.

Mục đích trong nghiên cứu này là nhân bản gen vhb từ V.stercoraria trong mộtvertor biểu hiện cho A.mediterranei và đánh giá ảnh hưởng khả năng hấp thụ oxy

và sản xuất rifamycin B

2 Vật liệu và phương pháp:

Vi sinh vật A.mediterranei Msb2 đã được sử dụng trong nghiên cứu này.Msb2 là một dòng đột biến của M18, được cô lập có độ nhạy cao với barbital.Khuynh hướng này tạo ra sản phẩm rifamycin B gấp 3 lần so với chủng bố mẹ(M18) Tuy vậy, khi nuôi trong thiết bị lên men hoặc lượng không khí thấp, dòng

này cần barbital để sản xuất chỉ rifamycin B V.stercoraria (ATCC 15.218) đã được sử dụng để lấy gen vhb và Saccharopolyspora erythraea (ATCC 11635) để thu ermP promoter Escherichia Coli DH5α được sử dụng như một chủng cho

plasmid

Các chủng A.mediterranei được đông khô và lưu trữ, đông ở nhiệt độ -20 ͦChoặc bảo quản trên môi trường agar Bennet E.coli được bảo quản ở -80 ͦC

Phương pháp và điều kiện nuôi cấy

Chủng E.coli và thể biến nạp chưa plasmid được phát triển ở 37 ͦC trong môi

trường Luria-Bertani

A.mediterranei được nuôi trong một hạt bao dinh dưỡng hợp thành từ (g/l):

glucose, 20; bột đậu nành, 20; CaCO3, 2,5; MgSO4.7H2O, 0,4; FeSO4.7H2O, 0,01;ZnSO4.7H2O, 0,05; CoCl2.6H2O, 0.003 Dịch nuôi cấy để phát triển trong máy lắclồng ấp (150rpm) ở 28 ͦC, 48h Môi trường sản xuất nơi kín gió gồm (g/l):glucose, 120; bacto-peptone, 10; cao nấm men, 5; sodium 5,5-diethylbarbiturate,0,7 PH là 7,2 và Erythromycin (10µg/ml) có mặt trong quá trình biến nạp

………

Môi trường Bennet agar bao gồm các chất sau (g/l): glucose, 10; cao thịt, 1;NZ-amine A, 2; cao nấm men, 1; và agar, 20