Nghiên cứu hóa học về cây dừa cạn

Nghiên cứu hóa học về cây dừa cạn

3 NGHIÊN CỨU

3.1 Giới thiệu chung

Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học của phần trên mặt đất của cây giảo cổ lam, được thu hái ở vùng núi Phanxipang (thuộc dãy núi Hoàng Liên Sơn) vào tháng 9 năm 2006 do công ty TNHH Tuệ Linh (Cầu Giấy, Hà Nội) cung cấp, đã được nhận danh bởi GS.NGND Vũ Văn Chuyên Mẫu cây được phơi khô, xay nhỏ rồi trích kiệt với metanol theo phương pháp đun hoàn lưu, lọc, thu hồi dung môi thu được cao metanol thô Cao metanol đem hòa tan vào

nước rồi trích lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi eter dầu hỏa, cloroform,

n-butanol thu được các cao tương ứng

Trên cao butanol, thực hiện sắc ký cột hấp phụ trên silica gel pha thường với nhiều hệ dung ly có độ phân cực khác nhau chúng tôi đã cô lập được sáu hợp chất,

ký hiệu BM1, BM2, BM3, BM4, BM5, BM6

3.2 Biện luận và kết quả

Bằng các phương pháp phổ nghiệm như 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT-NMR, COSY, NOESY, HSQC, HMBC, và khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS, cấu trúc các hợp chất đã được xác định là 7,4′-dimetylquercetin-3-O-[ α-L-

rhamnopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranosid (ombuosid, BM1), 7,4′

-dimetylkaempferol-3-O-[ α-L-rhamnopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranosid (BM2),

7,4′-dimetylquercetin-3-O-[ α-L-rhamnopyranosyl(1→2)][

α-L-rhamnopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranosid (BM3),

(20S)-3β,20,21-trihydroxy-3-O-[ α-L-rhamnopyranosyl(1→2)][β-D-glucopyranosyl(1→3)]-

(BM6) Trong đó, BM4 là chất lần đầu tiên cô lập được từ cây giảo cổ lam Riêng BM2, BM3, BM5 và BM6 là bốn chất mới lần đầu tiên được công bố trên thế giới Các hợp chất BM1-3 đã được thử nghiệm độc tính tế bào đối với một số tế bào ung

thư như ung thư cổ tử cung HeLa và ung thư phổi NCI-H460

3.2.1 Hợp chất BM1

Hợp chất BM1 được cô lập dưới dạng bột màu vàng, tan trong dung

môi metanol, sắc ký lớp mỏng giải ly bằng hệ dung ly cloroform:metanol:nước (8:2:0.2) cho vết tròn có Rf 0.3, hấp thu UV, hiện hình bằng acid sulfuric đặc nóng xuất hiện vết tròn màu vàng cam

Phổ 1H-NMR cho các mũi cộng hưởng của proton hương phương ở δH7.73 (1H, dd, J 1.5; 8.5, H-6′) lần lượt ghép cặp ortho và meta với δH 7.05 (1H, d, J

8.5, H-5′) và δH 7.53 (1H , d, J 1.5, H-2′); và hai proton ghép cặp meta với các proton ở δH 6.37 (1H, d, J 1.5, H-6) và δH 6.68 (1H, d, J 1.5, H-8), cho thấy BM1 có

hai vòng thơm, một vòng mang ba nhóm thế và một vòng mang bốn nhóm thế Ngoài ra còn có sự hiện diện của hai nhóm -OCH3 ở δH 3.86 (6H, s) và một nhóm -

OH kiềm nối ở δH 12.54 (1H, s), các mũi cộng hưởng của hai proton anomer ở δH

4.39 (1H, br.s, H-1′″), δH 5.40 (1H, d, J 7, H-1″) và sự hiện diện nhóm metyl của một đơn vị đường deoxymannose ở δH 0.98 (3H, d, J 6, H3-6′″)

Phổ 13C-NMR, DEPT-90 và DEPT-135 cho các mũi cộng hưởng của

29 carbon, trong đó có mười carbon tứ cấp, 15 carbon metin, một carbon metylen và

ba carbon metyl Dựa vào độ dịch chuyển hóa học xác định được có một carbon

carbonyl ở δC 177.5 (C-4), 14 carbon vòng thơm và 14 carbon sp3 Vậy BM1 là một

flavonoid glycosid có hai đơn vị đường và hai nhóm thế -OCH3

Trên phổ HMBC, proton ở δH 6.37 (H-6) và δH 6.68 (H-8) ghép cặp

meta với nhau và đều cho tương quan với carbon vòng thơm tứ cấp gắn oxygen ở δC

165.1 và tương quan với carbon tứ cấp vòng thơm không gắn oxygen ở δC 105.0 nên hai carbon này lần lượt là C-7 và C-10 Hai proton này cũng lần lượt cho tương quan với hai carbon vòng thơm oxygen hóa ở δC 156.4 và 160.9 nên hai carbon này lần lượt là C-9 và C-5

Proton ở δH 7.54 (H-2′) và δH 7.73 (H-6′) đều cho tương quan với

carbon tứ cấp vòng thơm không gắn oxygen ở δC 122.4 và hai carbon vòng thơm

gắn oxygen ở δC 156.7 và δC 150.1; đồng thời proton ở δH 7.04 (H-5′) cho tương

quan với carbon ở δC 150.1 mà không cho tương quan với carbon ở δC 156.7 nên ba carbon này lần lượt phải là C-1′ (122.4), C-2 (156.7) và C-4′ (150.1) Bên cạnh đó,

tương quan HMBC giữa H-2′ và H-5′ với carbon tứ cấp vòng thơm gắn oxygen ở δC 145.9 khẳng định đây chính là C-3′

Đặc biệt, tín hiệu proton của hai nhóm metyl ở δH 3.86 (6H, s) cho

tương quan HMBC lần lượt với C-7 và C-4′ cho thấy hai nhóm -OCH3 lần lượt gắn trên các vị trí này

Sử dụng phổ COSY, HSQC cho phép xác định hai đơn vị đường

chính là β-D-glucose và α-L-rhamnose Ngoài ra, phổ HMBC có các tín hiệu cộng

hưởng cho thấy có sự tương quan của H-1″ ở δH 5.4 (d, J 7.0) với C-3 (δC 133.8),

H-1′″ ở δH 4.39 (s) tương quan với C-6″ (δC 66.9) Như vậy đường D-glucose sẽ gắn trên khung flavonol tại vị trí C-3 và đường L-rhamnose sẽ gắn trên đường glucose tại vị trí C-6″

OCH3

O OH

H3CO

O

OH HO O

O

O

HO HO

1'' 3

H

H H

H

H

2 1'2' 3'4'

5' 6'

9

10 5 6 7 8

Töông quan HMBC

Từ những dữ liệu trên kết luận BM1 là 7,4′-dimetylquercetin-3-O-[

α-L-rhamnopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranosid, còn có tên gọi khác là ombuosid,

một dẫn xuất dimetylrutin của rutin Hợp chất này đã được công bố trước đây từ cây giảo cổ lam [6], [25]

Bảng 1: Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR và HMBC của hợp chất BM1

Tương quan HMBC ( 1 H → 13

3.2.2 Hợp chất BM2

Hợp chất BM2 được cô lập dưới dạng bột màu vàng, tan trong dung

môi metanol, sắc ký lớp mỏng giải ly bằng hệ dung ly cloroform:metanol:nước (8:2:0.2) cho vết tròn có Rf 0.4, hấp thu UV, hiện hình bằng acid sulfuric đặc nóng xuất hiện vết tròn màu vàng cam

Khối phổ phân giải cao (+)-HR-ESI-MS của BM3 cho mũi ion giả

phân tử [M+H]+ ở m/z 623.1970 (lý thuyết 623.1976) cho thấy BM3 có CTPT

với oxygen ở δC 55.1 và δC 55.4, hai tín hiệu carbon metin gắn với oxygen vùng

trường thấp ở δC 100.8 và δC 101.3, chín tín hiệu carbon metin của các đơn vị đường

và với sự hiện diện nhóm metyl của đường α-L-rhamnose ở δC 17.7 chứng tỏ BM2

là một flavonol glycosid có hai đơn vị đường L-rhamnose và D-glucose với hai nhóm thế -OCH3 tương tự như BM1

Phổ 1H-NMR cho các mũi cộng hưởng của hai proton hương phương

ở δH 8.12 (2H, d, J 8.5, H-2′ và H-6′) ghép cặp ortho với hai proton ở δH 7.07 (2H,

d, J 9.0, H-3′ và H-5′); và proton ở δH 6.39 (1H, d, J 2.0, H-6) ghép cặp meta với proton ở δH 6.72 (1H, d, J 2.0, H-8) cho thấy BM2 có vòng thơm A mang bốn nhóm

thế và vòng thơm B mang hai nhóm thế Phổ proton xác nhận sự hiện diện của hai nhóm -OCH3 ở δH 3.86 (6H, s), một nhóm -OH kiềm nối ở δH 12.50 (1H, s), hai proton anomer ở δH 4.39 (1H, br.s, H-1′″), δH 5.37 (1H, d, J 7.5, H-1″) và sự hiện diện nhóm metyl của đường α-L-rhamnose ở δH 0.97 (3H, d, J 6, H3-6′″) Những dữ

liệu này cho thấy aglycon của BM2 có cấu trúc kaempferol

Phổ HMBC cho thấy có sự tương quan của H-1″ ở δH 5.37 (d, J 7.5) với C-3 (δC 133.8), H-1′″ ở δH 4.39 (s) tương quan với C-6″ (δC 66.8) xác nhận đơn

vị đường D-glucose gắn với C-3 của aglycon và đơn vị đường L-rhamnose gắn với

đường D-glucose ở vị trí C-6″ Tương quan HMBC giữa proton của -OH kiềm nối

với δC 160.9 khẳng định đây là C-5 Đồng thời, proton ở δH 6.39 cho tương quan với C-5 nên đây chính là H-6 Ngoài ra, proton của hai nhóm -OCH3 cho tương quan

HMBC với C-4′ (δC 161.3), C-7 (δC 165.2) xác định vị trí của hai nhóm thế này

Từ những dữ liệu trên chứng tỏ BM2 là 7,4′

-dimetylkaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranosid Theo tra cứu trên SciFinder

vào tháng 01 năm 2010, BM2 là một cấu trúc chưa từng được công bố trên thế giới

Bảng 2: Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR và HMBC của hợp chất BM2

Tương quan HMBC ( 1 H → 13

3.2.3 Hợp chất BM3

Hợp chất BM3 được cô lập dưới dạng bột màu vàng, tan tốt trong

dung môi metanol, sắc ký lớp mỏng giải ly bằng hệ dung ly cloroform:metanol:nước (10:4:1) cho vết tròn có Rf 0.4, hấp thu UV, hiện hình bằng acid sulfuric đặc nóng xuất hiện vết tròn màu vàng cam

Khối phổ phân giải cao (–)-HR-ESI-MS của BM3 cho mũi ion giả

phân tử [M–H]– ở m/z 783.2353 (lý thuyết 783.2348) cho thấy BM3 có CTPT

C35H44O20

Phổ 13C-NMR, DEPT-90 và DEPT-135 cho các mũi cộng hưởng với

sự hiện diện của 35 carbon, trong đó 15 tín hiệu carbon khung flavonol tương tự

như BM1 và BM2, ba tín hiệu carbon metin gắn oxygen vùng trường thấp ở δC

100.6, δC 102.3, δC 102.4, một tín hiệu carbon metylen và 12 tín hiệu carbon metin vùng đường với hai nhóm metyl của đường α-L-rhamnose cùng ở δC 18.3 chứng tỏ

BM3 có ba đơn vị đường là D-glucose và hai đường L-rhamnose Ngoài ra, BM3

cũng có hai nhóm thế -OCH3 ở δC 55.7 và δC 55.8

Phổ 1H-NMR của BM3 xác nhận các mũi cộng hưởng của proton

hương phương ở δH 8.35 (1H, dd, J 8.5; 2.5, H-6′) lần lượt ghép cặp ortho và meta với proton ở δH 7.19 (1H, d, J 8.5, H-5′) và δH 8.20 (1H, d, J 2.5, H-2′); proton ở δH

6.48 (1H, d, J 2.5, H-8) ghép cặp meta với proton ở δH 6.44 (1H, d, J 2.5, H-6) Phổ

1

H-NMR của BM3 còn xác nhận sự hiện diện của hai nhóm -OCH3 ở δH 3.68 (3H,

s, 7-OCH3) và 3.77 (3H, s, 4′-OCH3) Những dữ kiện này cho thấy algycon của

BM3 có cấu trúc của dimetylquercetin tương tự như BM1 Ngoài ra, phổ 1H-NMR

của BM3 còn cho các mũi cộng hưởng của ba proton anomer ở δH 6.38 (1H, d, J

8.0, H-1″), δH 6.40 (1H, br.s, H-1″′), δH 5.19 (1H, br.s, H-1″″) và hai mũi metyl của

đường α-L-rhamnose ở δH 1.62 (3H, d, J 6.5, H3-6″′) và δH 1.39 (3H, d, J 5.5, H3

-6″″)

Phổ COSY và HSQC xác nhận ba đơn vị đường tương ứng là

D-glucose và hai đường L-rhamnose Phổ HMBC của BM3 còn cho thấy ba proton

anomer của các đơn vị đường ở δH 6.38 (H-1″), δH 6.40 (H-1″′), δH 5.19 (H-1″″) lần

lượt cho tương quan với δC 134.8 (C-3), δC 78.5 (C-2″) và δC 68.0 (C-6″) Như vậy, đơn vị đường D-glucose gắn tại vị trí C-3 của aglycon và hai đơn vị đường L-rhamnose gắn trên đơn vị D-glucose này lần lượt tại các vị trí C-2″ và C-6″

Từ những dữ liệu trên kết luận BM3 là 7,4′-dimetylquercetin-3-O-[

α-L-rhamnopyranosyl(1→2)][α-L-rhamnopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranosid

Theo tra cứu trên SciFinder vào tháng 01 năm 2010, BM3 là một cấu trúc chưa từng

được công bố trên thế giới

Bảng 3: Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR và HMBC của hợp chất BM3

Tương quan HMBC ( 1 H → 13

3.2.4 H ợp chất BM4

Hợp chất BM4 được cô lập dưới dạng bột không màu, tan tốt trong

dung môi metanol, sắc ký lớp mỏng pha đảo giải ly bằng hệ dung ly metanol:nước (3:1) cho vết tròn có Rf 0.33, không hấp thu UV, hiện hình bằng acid sulfuric đặc nóng xuất hiện vết tròn màu tím đen

Phổ 1H-NMR của BM4 xuất hiện bảy tín hiệu mũi đơn ứng với bảy

nhóm metyl của một triterpen ở δH 0.72 (3H, s, H3-19), 0.90 (3H, s, H3-30), 0.92

(3H, s, H3-18), 1.08 (3H, s, H3-29), 1.16 (3H, s, H3-28), 1.61 (6H, s, H3-26, H3-27), một tín hiệu mũi đơn vùng trường thấp của nối đôi tại δH 5.27 (1H, s, H-24), một mũi đôi đặc trưng cho nhóm metyl của đơn vị đường α-L-rhamnose tại δH 1.59 (3H,

d, J 6.0, H3-6″), và bốn tín hiệu proton anomer của bốn đơn vị đường ở δH 4.85 (1H,

d, J 5.5, H-1′), δH 5.00 (1H, d, J 7.5, H-1″″), δH 5.06 (1H, d, J 7.5, H-1″′) và δH 6.10

(1H, s, H-1″)

Phổ 13C-NMR, DEPT-90 và DEPT-135 cho tất cả 53 tín hiệu carbon, trong đó có tám carbon metyl, 14 carbon metylen, 25 carbon metin, sáu carbon tứ cấp Bảy tín hiệu carbon metyl triterpen ở δC 15.6 (C-18), 16.5 (C-19), 16.5 (C-30), 16.7 (C-29), 17.7 (C-27), 25.7 (C-26), 27.9 (C-28), hai tín hiệu carbon vùng trường thấp của nối đôi ở δC 125.9 (C-24), 130.8 (C-25), ba tín hiệu carbon phần aglycon gắn với oxygen ở δC 76.1 (C-21), 76.3 (C-20), 88.1 (C-3) trong đó tín hiệu của carbon C-21 xuất hiện là mũi của một nhóm metylen oxygen hóa Ngoài ra, còn có tín hiệu của 23 carbon của các đơn vị đường, trong đó có bốn tín hiệu carbon anomer ở δC 101.7 (C-1″), 104.4 (C-1″′), 104.6 (C-1′) và 105.8 (C-1″″), cho thấy BM4

có bốn đơn vị đường Kết hợp phổ COSY và HSQC, xác định được các vị trí cộng

hưởng của proton và carbon của bốn đơn vị đường này, cho thấy BM4 có hai đơn vị

đường D-glucopyranose, một đơn vị arabinopyranose và một đơn vị rhamnopyranose

L-Phổ HMBC cho thấy các tín hiệu proton của nhóm metyl ở δH 0.90,

δH 0.92 cùng cho tương quan với hai carbon tứ cấp, trong khi đó proton ở δH 0.92

và δH 0.72 cùng cho tương quan với carbon metyl δC 50.9 (C-9) Do đó, ba nhóm metyl này lần lượt là H3-30 (δH 0.90), H3-18 (δH 0.92) và H3-19 (δH 0.72)

Tín hiệu proton của hai nhóm metyl ở δH 1.08, δH 1.16 cho tương quan HMBC với các tín hiệu carbon của nhau và tương quan với cùng một carbon

tứ cấp ở δC 39.7, như vậy các metyl này phải là H3-28 (δH 1.16) và H3-29 (δH 1.08) Tương tự, ta xác định được H3-26 (δH 1.61) và H3-27 (δH 1.61) nhờ tương quan giữa các tín hiệu proton và carbon của nhau và đều tương quan với hai carbon olefin tam cấp C-24 (δC 125.9) và tứ cấp C-25 (δC 130.8)

Phổ HMBC cho tương quan giữa proton ở δH 2.16 (1H, m, H-17) với

carbon tứ cấp gắn oxygen ở δC 76.3 và carbon metylen gắn oxygen ở δC 76.1 nên hai carbon này lần lượt là C-20 và C-21 Tương quan HMBC giữa proton olefin ở

δH 5.32 (1H, m, H-24) và hai carbon metylen ở δC 36.5 và δC 23.3 xác định được hai carbon này lần lượt là C-22 và C-23

Từ tất cả các dữ liệu trên cho thấy BM4 là một triterpen saponin có

khung dammaran, là khung triterpen có nhiều trong cây giảo cổ lam.[26]

O

OH

O Glu

Ara Glu

Rha

2 3

20

21 22 23 24

Töông quan HMBC

3

28 29 4

30 17

5

Phổ HMBC cho tương quan giữa proton anomer ở δH 5.00 (1H, d, J

7.5, H-1″″) của một đơn vị đường D-glucose và carbon metylen oxygen hóa C-21 (δC 76.1), tương quan giữa proton anomer δH 4.85 (1H, d, J 5.5, H-1′) của đơn vị đường L-arabinose và C-3 (δC 88.1), tương quan giữa proton anomer ở δH 6.10 (1H,

s, H-1″) của đơn vị đường L-rhamnose và proton anomer ở δH 5.06 (1H, d, J 7.5,

H-1″′) của đơn vị đường D-glucose còn lại lần lượt với C-2′ và C-3′ của đơn vị đường

L-arabinose Như vậy, BM4 có ba đơn vị đường gắn tại vị trí C-3 theo thứ tự như

trên và một đơn vị đường D-glucose gắn tại vị trí C-21

Từ tất cả những dữ kiện trên và so sánh với phổ chuẩn, kết luận BM4

chính là (20S)-3 β,20,21-trihydroxy-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(1→2)][

β-D-glucopyranosyl(1→3)]-

α-L-arabinopyranosyldammar-24-en-21-O-β-D-glucopyranosid đã được cô lập lần đầu tiên trong cây cùng chi G cardiospermum

vào năm 2006 [26], nhưng là lần đầu tiên được tìm thấy trong cây giảo cổ lam G

pentaphyllum

Bảng 4: Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR và HMBC của hợp chất BM4

Vị

Tương quan HMBC ( 1 H → 13

3.2.5 Hợp chất BM5

Hợp chất BM5 được cô lập dưới dạng bột không màu, tan tốt trong

dung môi metanol, sắc ký lớp mỏng pha đảo giải ly bằng hệ dung ly metanol:nước (3:1) cho vết tròn có Rf 0.5, không hấp thu UV, hiện hình bằng acid sulfuric đặc nóng xuất hiện vết tròn màu tím đen

Khối phổ phân giải cao (+)-HR-ESI-MS của BM5 cho mũi của ion

giả phân tử [M+H]+ ở m/z 1081.6153 (lý thuyết 1081.6158) cho thấy BM5 có CTPT

C53H92O22

Phổ 1H-NMR của BM5 xuất hiện bảy mũi đơn ứng với bảy nhóm metyl của một triterpen saponin tương tự như BM4 ở δH 0.88 (H3-18), δH 0.67 (H3-19), δH 1.33 (H3-26), δH 1.33 (H3-27), δH 1.10 (H3-28), δH 1.02 (H3-29) và δH 0.85 (H3-30), một mũi đôi đặc trưng cho nhóm metyl của đơn vị đường α-L-rhamnose ở

δH 1.53 (3H, d, J 5.5, H3-6″) và bốn tín hiệu proton anomer của bốn đơn vị đường ở

δH 4.81 (1H, d, H-1′), δH 4.89 (1H, d, J 7.5, H-1″″), δH 4.99 (1H, d, J 7.5, H-1″′), δH

6.00 (1H, s, H-1″) Tuy nhiên, BM5 không có tín hiệu của proton olefin nào như BM4

Phổ 13C-NMR, DEPT-90 và DEPT-135 cho tất cả 53 tín hiệu carbon

tương tự như BM4, trong đó BM5 không có sự xuất hiện của hai carbon olefin mà

thay bằng carbon metylen ở δC 44.9 (C-24) và carbon tứ cấp oxygen hóa ở δC 69.8 (C-25) Phổ 13C-NMR còn cho bốn tín hiệu carbon anomer ở δC 104.2 (C-1′), δC 101.2 (C-1″), δC 103.8 (C-1″′), δC 105.1 (C-1″″) xác nhận BM5 cũng có bốn đơn vị