Tổng quan về thành phần dịch trích bã bột cây thông
Trang 1PHAN TONG QUAN
- — Chương I ĐẠI CƯƠNG VỀ CÁC CÂY CÓ TÍNH LỢI SỮA — Chương II CÁC PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐỂ TÌM HIỂU
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA DỊCH TRÍCH
Trang 2Phần tổng quan - Chương |
Nhiều nghiên cứu đã thực hiện trên hột bông, nhưng chỉ tập trung trên phần
sợi Với phần hột, các nghiên cứu trên dịch trích bởi eter etil cho chat gossypol,
một sắc tố rất độc, có tính ngừa thai cho đàn ông ở Trung Quốc [68].Gossypol còn có tính ngừa thai cho phụ nữ vì nó cần ƯÓ sự sản xuất sieroid buồng trứng 123|
Gossypol có khả năng trị ung thư gan, phổi 129 và kháng H.I.V 142]
BANG 1: Một số cây thuốc VN có tính lợi sữa theo tài liệu và kinh nghiệm
Đông Y,
srr LIÊN VIỆT NĂM TÊN KHOA HỌC HO TÀI LIỆU THAM KHẢO
i | Bong bong Lygodium Mexuosum Schizaeaceae Đỗ Tất lợi |2 2 {Rong gao Gossampinus malabarica Bombacese Petelot [76] 3 | Béng vải Gossypium herbaceum Malvaceae Petelot
4° {Cho dé PhyUanthus urinaria Euphorbiaceae {Petelot 3 | Cổ sữa Euphorbia hirta Euphorbiaceas | Petelat
6 | Đính lăng Polyscias fructicosa Araliaceae Đỗ Tất Lợi
7 ]Ïï lớn (hoắc hướng) Hyplis suaveolens Lamiaceae Petelot 8 [1a thd 6 tdng Streptocaulon juventas Asclepiadaceae | Đã Tất lợi 9 |llat mo Sesanum indicum Poda Haccao Hỗ Tất Lợi
10 [Lá cách Premna integrifolia Verbenaceae Đỗ Ta Lai 1] [La mit Artocarpus integrifoba Moraceae Petelot 12 |Mướp hương Luffa cylindrica Cucurbitaceae | Peiclot ¡3 |Mùi Coriandram sativum Umbelliferae Đỗ Tất lợi
fd | lau má Centela asiaLica 1mbelhferae Petelot 1S | Rau day Corchorus oljlorius Pilaceae Petelot
16 |Sệp sộp Ficus pumila Moraceae Đã Tất Lợi i Sung Ficus glomerata Moraceae Đỗ Tất Lợi
i8 |Sữa Alstonia scholans Apocynaceae Petelot
19 | thâu đầu Ricinus communis Euphorbiaceae |Petelot 3 | Thong thao Teuapanax papyrifera Araliaceae Petelot
31 | Thuốc đồi Pouzolzia zeylanica Unticaceae Đỗ Tất Lợi
22 | Vong nom Urythrina indica Papilionaceae |Pctelot
Một số tác gid da nghiên cứu trên dich trích hệt bởi nước như GŨ
FUCHANG, TRUNG QUỐC, năm 1983 [22] cho biét là bã hột bông chứa
38,2 - 51,1 % protein g6m 16 loai amino acid, vdi acid glutamic và arginin có hàm
lượng 21,3 % va 12,1 % trên tổng số các amino acid,
Trang 3Phần tổng quan - Chương Ì —§—
amino acid nhu acid aspartic, acid glutamic, glicin va alanin Céc amino acid có
tính acid chiếm > 25,3%; amino acid có tính ba¿ chiếm < 13,6 % trên tổng số
các amino acid
LE XUAN CUONG [I cho biết việc thử nghiệm trên con trâu sữa Ấn Độ
với khấu phần gôm rơm và thức ăn tình 7,75 Kg/con/ngày, Nếu giảm khẩu phần cơ
sở nầy xuống 4,6 Kự và bổ sung thêm bánh MUH (rÏ mat va uré), cộng thêm bã hột bông (0,45 Kg) vẫn duy trì được năng suất sữa của trâu 7 livngay những tăng lợi tức cho người chăn nuôi lên 2 rupi/ngay
Nam 1989, theo GUYOMARCH [25] , dich trích hội bông bởi nước nóng
chứa polisacarid gồm ramnoz, arabinoz, xiloz, manoz va ghicoz, NGu ding chat
trích thô này để nuôi chuột cái 3 tháng tuổi, cho ăn 400 mg/ngày hoặc 500 mg/ngày, lượng mỡ sữa trong tuyến vú tăng lên 3 hoặc 4 lần
Nam [990 , PAVLOVSKAYA (Tashkent) [55], xac dinh ham ludng protein
trong hội bông Gossypium hirsuium la 31-40 % , wong G, burbudense 1a 46-48 % va tong G herbuceum là 28-30 %
Năm 1992, KENT và cộng sự [37], nghién cfu 14 mam của cây con
Gossypium hirsutum , 14 chifa enzym loai glioxisom để chuyển cdc lipid du uit
thành hidrat carbon cần thiết cho sự tăng trưởng của cây con
Tóm tất, sự nghiên cứu trên hột bông phần đông tập trung trên các phương
pháp ly trích gossypol từ hội bởi các dung môi hữu cơ ; phần trích ly bã hội bởi nước chưa được nghiên cứu
Mục đích của chúng tôi là tim hiểu phần dịch trích của bã hội bông bởi nước
nóng , làm Lăng tính lợi sữa thco kính nghiệm dân gian,
Cũng như các loại hột nói chung, hội bông chứa những cấu tử chính như celuloz, homiceluloz, pelisacarid, protcin, lignin và các chất ở tỷ lệ rất thấp như
protein du ui, glicoproicin ,cnzym, lipid, cdc chất có mầu và các chất vô cơ
Mặc dù người ta có thể phân tích các thành phần của thành tế bào, nhưng chưa có một hình ánh nào về cấu trúc phân tử của thành tế bào của cây được trình bày về polimer, về các nối liên kết giữa polimer Thí dụ thành tế bào nhất cấp gồm các sợi cơ bản là celuloz giống như một lõi kết ứnh có kết cấu trật tự cao, được bao quanh bởi những vùng vô định hình gồm những phân tử ccluloz gắn với polisacarid và glicoprotein một cách lỏng lẻo Polisacarid pectic va hemiceluloz là chất kết dính gắn chặt các sợi co luloz
Hiện nay, chưa có phương pháp nào có thể tách rời một loại chất ra khỏi các
chất nêu trôn, nhất là khi trích ly cây với nước, Vì vậy, nếu thời gian trích ly với
nước kéo đài, các polisacarid không tan, acid hữu cơ, anuno acid sẽ bị trích cùng lúc,
Tùy thuộc ngưồn gốc, polisacarid trích ly bởi nước có thể là gôm, chất nhầy,
Trang 4Phan tong quan - Chuong |
Phương pháp tổng quát trích các chất trong thành tế bào thực vat theo TREVOR ROBINSON [67] SOO I : Nguyên liệu thô - Trích bằng nước nóng i j Phan tan Phần không lan - Trích bởi NaOH 17,5 % - Elanol S0 % E—— _—_— Ĩ j Phần không tan Phần tan Phần không tan Phần tan œ-Ccluloz - Chal pectic - Phosphat - Tỉnh bột - Monosacarid - Gôm - Oligosacarid
- Chất nhầy - Hidrat carbon
Acid hóa - Fructan trọng lượng - Arabinogalacian phân tử thấp - ÑRamnogalacluronan - Chất có mầu F ] Phần trầm hiện Phần lan Hemuoe luloz Hemuce luloz có trọng hượng phần tử cao có trọng lượng phân tử thấp
vai trăm ngàn dalon Thông thường , polisacarid là chất đây thẳng ít tan hoặc không lan trong nước, nhưng polisacarid thực vật có chức năng dự trữ như hột ,sẽ
phan nhánh và dễ phân tần trong nước để tạo dạng keo
Các đại phân tử có thể có dạng hình cầu hoặc dạng chuỗi Đại phân tử hình
cầu phân nhánh mạnh, và chuỗi dây được cuộn lại chặt chế nên bền và để tỉnh chế
như giicogen, albumin, hemoglobin Đại phân tứ hình chuỗi kéo dài theo một chiều
Trang 5Phan téng quan - Chuong | — =
như thế chúng có nhiều điểm tiếp xúc nhau và các đại phân tử sẽ liên kết với nhau bởi nhiều loại nối, thường nhất là nội hidrogen Thí dụ như nguyên tử hidrogen của
nhóm -NH- của một prolcin và oxigon của nhóm carbonil ở chuỗi đạt phân tử nằm
kế bên Mặc dù nổi hidrogcn rất yếu (4-8 Kcal/mol) so với một nối hóa trị nhất cấp -(80- 150 Kecal/mol), nhưng với số lượng lớn của các cầu nối dọc thco chuỗi sẽ làm
các đại phân tử gắn với nhau chặt chẽ,
Các đại phần tử hình cầu,do chỉ có vài điểm tiếp xúc nhau, nên có thể dễ dàng tách rời nhau,Vì thế, các polimcr hình chuối ít tan hơn các polimer hình cầu 1471, 1671
TREVOR ROBINSON {67| nêu ra một phương pháp tổng quát để trích các
chải trong thành tế bào thực vật được trình bày trong sơ đồ 1, 1.2.2 Mô tả thực vật cây hông
Cây bông là loài cây nhỏ, sống lâu, lá có 4 đến § thùy, ít nhiều có khía, Hoa
don kom thoo 3 lá bắc lớn có răng cưa; tràng hoa mẫu vàng và trỞ nên đỏ sau khi
nở hoa, Hoa mọc ở nách hoặc trên nhánh con ngắn Trái có dạng nang hình khối
bầu dục (4-8 x 3-4) cm, có 3 đến 5 ngăn hình noãn Trong mỗi ngăn, có 6 đến 12
hội mang những sợi tợ dài, Những sợi tơ mọc lên từ bề mặt của hột
Có 4 lồi bơng :foai 2 diploid A Chau vdi sui day va ngan (Gossypium arboreum, Gossypium herbaceum), loat 2 tetraploid Chau My vi soi dai rung binh (Gossypium hirsutum L.) va vdi soi dat (Gossypium barbadense L.) [T2]
Theo PETELOT A {76|, tất cả các bộ phận của cây bông đều có tác dụng trị liệu; cây hạ sốt ; lá, hoa bổ phối Nước ngâm đậm đặc của lá, hoa có tính chống
viêm Ở Mỹ người da đcn dùng vỏ rễ làm thuốc phá thai, Dịch trích hội với nước nóng có tính lợi sữa, dùng cho phụ nữ đang cho con bú để làm tang lượng bo trong sữa,
Trang 6Phan iéng quan - Chuong I —8—
Chương 11 CÁC PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐỂ TÌM HIỂU THÀNH PHẦN
HOA HOC CUA DICH TRICH LY BA HOT BONG BOI NUGC,
Mười một (11) phương pháp khác nhau đã được áp dụng để tìm hiểu thành
phần hóa học cũng như hoạt tính lợi sữa của dịch trích ly bã hột bóng bởi nước Ở dạng đông cô chân không
H.1 Phương pháp siêu lọc để tách chiết sơ bộ một số cấu tử hóa học của dịch
trích ly bã hột bông hởi nước :
Trong thập niên 60, nhiều tác giả đã cô lập protcin từ bã hột bông bằng cách
cho kết tủa chất trích ly với dụng dịch muối NaCl 10 % cộng phosphat 0,1M ở
pH 7.4 1531, với dụng địch nhosphalt 3 % {15}, với dụng dịch NaC] 2 M {35] hoặc
vdi dung dich NaOH 0,015 N [8]
Cuối thập niên 70, vài tác giả đã cô lập proein trong bã hội bông bằng phương pháp siêu lọc [41], 1621 Đến cuối thập niên 80, phương pháp siêu lọc được phát triển thêm , dùng màng lọc với lỗ có đường kính khác nhau để lọc các phân tứ
có trọng lượng phân tử khác nhau, Các tác giả đã dùng phương pháp này để khảo - sái các polisacarid có trọng lượng phần tử > F0 KD và > 30 KD của 8 loại cây
vùng Trung Á, trong đó có hột cây bông 139]
HI.2 Phương pháp định lượng miễn dịch phóng xạ (R.LA = RADIO IMMUNO
ASSAY) để thử nghiệm tính lợi sữa của các phân đoạn siêu lọc :
H.2.1 Các yếu tố có ảnh hưởng đến sự phái triển tuyến sữa :
Với phụ nữ, tế bào của mô tiết chỉ xuất hiện trong lúc mang thai, dưới sự tác động của steroid buồng trứng (oestrogen, progesteron, corlicoid);, hormon tuyến
yên ( hormon tăng trưởng và nhất là prolacUn)
Ở các loài động vật có vú, Lyon L và cộng sự [46] chứng mình rằng steroid
buồng trứng (E2 L7 progostcron) không thể làm phát triển tuyến vú của chuột,
thỏ cái, dê cái Nếu các steroid budng trứng không hiện diện, nhưng khi cho tác
dụng một lượng cao hormon tuyến yên hoặc cấy tuyến yên vào chuột , có thé lam tăng trưởng luyến sữa]491 Khi cho tác dụng chất CB 154 ,mội chất ức chế sự lạo prolacun ở giai đoạn đầu của việc tiết sữa , sữa sẽ không tiết ra được |33]
Chính prolacun ,chớ không phải các steroid buồng trứng ,giữ vai trò chủ yếu trong việc tiết sữa Progesteron không phải là hormon tuyến sữa chính yếu mà chỉ kết hợp trong quá trình ban đầu với oestrogen làm tăng trưởng tuyến sữa, làm các
Trang 7Phần tổng quan - Chương II Go
Nơi loài động vật có vú sau khi sinh ,song song với hiện lượng tiết sữa, hàm
lượng prolacun cũng tăng theo một cách đáng kể trong máu,
Đo đó, nếu dịch trích ly của cây thuốc có ảnh hưởng đến việc kích thích sự tiết ra sữa, nó cũng kích thích sự tiết ra prolacún Vì thế ,việc định phan prolactin trong huyết tương của động vật được thứ nghiệm với chất trích của cây sẽ cho biết
tính lợi sữa của dịch trích cây trên,
Chúng tôi chọn phương pháp của tác giả MESSINGER H G |50] để đo hàm
lượng prolacun trong huyết tương của trờu và chuột cái bằng phương pháp định lượng miễn dịch phóng xa , nhằm m hiểu hoạt tính tăng sữa trên trừu và chuột của
các phân đoạn siêu lọc của dịch trích bã hội hông bởi nước
Việc thí nghiệm trên các sinh vật sống không phải bao giờ cũng đạt được kết
quả khả quan vì mỗi động vậi có độ nhạy cảm hormon khác nhau Ngoài ra có
nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự tiết prolacin nơi con trừu,
Hàm lượng prolactin cda itu thay d6i theo chu kỳ động dục, thời gian ngày
đêm, sự căng thẳng thần kinh khi bị lấy máu lần đầu, nhiệt độ (theo mùa có íL hay nhiều ánh nắng mặt rời) |6]
Tất cả các phương pháp đo hormon đều sử dụng phương pháp định lượng
chất miễn dịch phóng xạ Phương pháp này dựa vào sự cạnh tranh giữa một kháng
nguyên không mang tính phóng xạ và một kháng thể có mang đông vị phóng xa với số lượng biết trước, cả 2 sẽ gắn vào một kháng thể đặc biệt, có số lượng biết trước và số lượng này sẽ íLhơn hoặc bằng tổng số các kháng nguyên , Phản ứng chung là : Ag + Ac ———~* |Ag -Ac] + Ag (1) Phức kết tụ giữa kháng nguyên và kháng thể Với sự hiện diện của một kháng nguyên không phóng xạ, phản ứng sẽ là : Ax + Ag + Ac ==> [| Ag - Ac|+IAg-Ac]+Ag + Ag@)
và (2) sẽ cân bằng theo định luật báo toàn khối lượng, Cân bang nay sẽ đạt được
nhờ một huyết thanh miễn dich dic biét (immusérum spécifique) giúp cho việc kết tủa hai phức chất |Ag - Ác |và | Ag - Ac | Việc định lượng được thực hiện
Trang 8Phan téng quan - Chuong I] —] © |
Vẽ đường biểu diễn chuẩn biểu thị số phần trăm của kháng nguyên có phóng xa nối liền với kháng thể ,khi có sự hiện diện tăng dần của kháng nguyên
không phóng xXa.Song song, chuẩn bị các ống nghiệm trong đó phần trăm của các
kháng nguyên phóng xa cũng được xác định như trên, những các kháng nguyên
không phóng xa được thay thế bằng mẫu cần định phan HÌNH 1 : Đường biểu điễn chuẩn
% hoạt tính chung của LAg -Acl Mẫu cần đo aN Số đo được KH, „Nông độ kháng nguyên ~ 0 160 320 Nẵng độ Ag (ngán) Với Ag” > Ác, ta có đẳng thức : Bchung _ B` _ Ác Agchung Ag Ag+Ag’ Ac :_ Số lượng kháng thể
Ag chung _: Số lượng kháng nguyên chung (Ag + Ag` )
Ag : Số lượng kháng nguyên cần định phân Ag : Số lượng kháng nguyên có gắn phóng xa
H chung: Số lượng kháng nguyên gắn vào kháng thể, B :_ Số lượng kháng nguyên phóng xạ bị gắn
Phương trình được biểu dién bằng mội hiperbon dạng y = ——
và trong phòng thí nghiệm, các đỡ kiện được xử lý bói chương trình mấy tinh
11.3 Định phân hàm lượng đường tổng quát bằng phương pháp so màu [74]
Đường trung tính thường hiện điện trong thâo mộc là aldohexoz như D-galacioz, D-glucoz , D-mannoz hoặc những aldopentoz như D-arabinoz,
Trang 9Phan téng quan - Chuong II ¬ HÌNH 2: Cấu trúc các đường trung tính trong thảo mộc CHO CHO CHO CHO H —T-OH HO ——H H —7—OH HO —TTH HO —— H HO ——H HO ——H H -—7—-OH HO —— H H ——OH H-—+- OH H —-OH H -[†-OH H -—OH H —- OH HO TH
CH2OH CH2OH CH2OH CH3
l)-galacto⁄ l)-mrannioZ I)-glucoz L-fucoz
CHO CHO CHO H -+- OH H —— OH H ~~ OH H —+-OH HO —+—- H HO ——- H HO ——H H —~ OH HO —— H HO —†~H CH;OH CH;OH CH;
L-ramnoz D- xiloz L- arabinoz
Dưới tác dụng của acid vô cơ, pcnloz và hexoz trở thanh aldehid nhv
(ormaldchid, acctaldchid, crotonaldchid cùng với dẫn xuất của furfural như
5-hidroximetilfurfural hoặc 5-mectilfurfural và các sản phẩm giảm cấp không chứa
hệ thống nối đôi liên hợp
Tỉ lệ tương đối giữa dẫn xuất của furfura] với các chất hàm sắc thay đổi tùy theo nồng độ của acid, nhiệt độ, thời gian phan ứng Phương pháp này có sai số
trung bình khoảng 9 ‘%
Định phân bằng phương pháp so màu, các tác chất orcinol, antron, phenol, cistcin được sử dụng và antron được dùng nhiều nhất
Cơ chế phản ứng: antron hay 9,10-dihidro-9-oxoantraccn trong môi trường
acid nóng , kết hợp với sản phẩm giảm cấp của đường, chất dẫn xuất của furfural để tạo thành chất có màu xanh dương lục |34| (hình 3)
Phan ứng nay hị ức chế bởi các chất oxid hóa và được hoạt hóa hởi các chất khử hay chất kháng- oxid hóa Vài tác giả đề nghị dùng chất kháng- oxid hóa như tiourê để ổn định dung dịch antron
Độ hấp thu cực đại của các chất màu tạo thành từ chất đường ở khoảng
Trang 10Phân tổng quan - Chương H —12—
Acid uronic cling cho mau yu vdi antron, cé 46 hấp thu cực đại ở 560 nm;
ở 585 nm, độ hấp thu của acid uronic không đáng kể so với độ hấp thu của các chất
dường Osammn, acid sialic không tác dụng với antron,
H.Á Định phân các đường đơn trung tính qua dẫn xuất acetat alditol bằng phương pháp sắc ký khí 191
Polisacarid thủy gidi cho monosacarid, sau d6 monosacarid acctil héa thanh
dan xuat acetat bay hoi , x4c dinh bdi phudng pháp sắc ký khí,
Điều kiện cần thiết để chuyển hóa các polisacarid thành monomer thay đổi tùy theo câu trúc và thành phần cấu tao monomer cla cdc polisacarid Với _polisacarid đơn giản, sự thủy giải rất đễ đàng và khó khăn hơn nếu polisacarid chứa
đơn vị acid uronic hoặc osamin Các nhóm amino Ở vị trí C-2 của monomer của
hầu hết các polglicosamin bị prolon hóa khi thủy giải, do đó ổn định cầu nối gHcosic, Muốn bé gấy cầu nối này, cần điều kiện mạnh mẽ bơn với HCI 4 N,
Trang 11Phần Tổng Quan - Chương lÏ —14— CH,OH OH HO OH HO HO HO OH NHạ NHCOCH, Glucosamin N-acctil glucosamin (2-amino-2-deoxi-B-D-glucoz) (2-acetamido-2-deoxi-B-D-glucoz)}
Với polisacarid chứa đơn vị acid uronic, nghĩa là chứa nhóm -COOH ở C-6 của monosacarid, cầu nối glicosic sẽ ổn định Sự thủy giải một cách định lượng thành đơn vị acid uronie chỉ xảy ra với HE, - 23 ĐC [54] Sau khi thủy giải và khử, các dẫn xuất acid aldonic trở thành dẫn xuất trimeHlsẳHll (TMS) do tác dụng với hexameuil disilazon ; dang acelat cla acid aldonic không bay hơi,
Thông thường sau giải đoạn thủy giải, monosacarid bị khử bởi borohidrur natriurn NaBHa ,ở nhiệt độ phòng ; ngoại trừ glucoz, ramnoz bị khử chậm hơn,
Các dẫn xuất của bor sẽ tạo phức với alditol, làm ngăn cần sự acell hóa ở giải đoạn kế tiếp, Các chất này bị loại bởi motanol dudi dang borat trimetil,
Thực hiện sự aceHl hóa bởi anhidrid aceblic với xúc tác piridim, Trích các
acelat alditol vita tao thanh bdi acetal cul
Chất dẫn xuất acetat alditol rất bên, có tính bay hơi, và thường dùng để phân
tích đường trung tính bằng phương pháp sắc ký khí 169{, hoặc sắc ký lỏng cao ấp
gua dẫn xuất 2-aminopiridin [28]
11.5 Phương pháp định phân acid uronie [7A]
Có nhiều loại acid uronic như acid D-plicuronic, acid L-iduronic, acid
Trang 12Phần Tổng Quan - Chương H1 —l4—
OH
HO HO
Acid B-D-glicuronic Acid a-L-ideronic
Carhazol hay đibenzopirol, trong môi trường acid, nóng , kết hợp với acid uronic cho sản phẩm có màu tím đặc biệt |1 7|
Ome NH HOOC = o CHO
Carbazol Acid 5-formil furoic
Theo BOWNESS [16], sau khi so sánh phổ hấp thu tử ngoại của nhiều dẫn xuất của acid [uranic và các sản phẩm giảm cấp của acid uronic bởi H2SÓa, với
sự hiện diện hoặc khiếm diện của carbazol, chính acid 5-formill furoic là nguyên
nhân tạo ra màu
Sự hấp thu của các mâu thay đối tùy theo loại acid uronic Hexoz cũng cho
với tác chất carbazol-sulfuric một màu vàng nhạt, nhưng hấp thu cực đại ở 410 nm,
trong khi độ hấp thu cực đại của cdc acid uronic 12 530 nm
Osamin, acid sialic khéng cho phan dng vdi carbazol-sulfuric
Protcin không cho hiện tượng giao thoa, ngoại trừ ở nồng độ 200 pg/ml Neu nông độ cao hơn 200 Iig/ml, sự giẩm cường độ mầu Xây ra
Các muối natriam, kaHum, amonium làm giảm cường độ của phần ứng
Phương pháp sử dụng carbazol tiện lợi, tuy vậy mỗi lần định phân vẫn phải đo lại các dung dịch acid uronic chuẩn để thiết lập đường biểu diễn chuẩn,
ïl.6, Phương pháp định lượng protein toàn phần :
Protcin được định lượng thoo phương pháp so màu của LOWHRY [45] Cho
đến nay, phương pháp này vẫn còn hiệu quả ,với nhiều cái tiến bằng cách sử dụng thudc thd Coomassic Brilliant Blue G.250 [65]
Khi phẩm màu Coomassie nối với protein trong môi trường acid, có sự chuyển màu của dụng dịch từ nâu đỏ qua xanh đương, tương ứng với sự dịch
Trang 13Phần Téng Quan - Chuong II —l5— H; Hạ HsC, C;H; CH,-N& = N' CH; Na’ O;S SO; Na! OG2H;
Phẩm màu xanh Coomassie Brilliant G-250,
Trudc day, theo DIAMANT B [16] , phdm mau gan với protein ngang qua
nhóm sulfonic, nhờ lực hấp thu tinh dién Gan day, theo COMPTON S.J.[14]
Coomassie hiện diện ở 3 trạng thái cân bằng : cauon, trung tính và anion với các
mũi hấp thu quang phổ lần lượt là 595, 650 va 465 nm Dang anion gắn với protein - dựa trên sự dịch chuyển hấp thu từ 465 mm đến 595 mm Số lượng coomassic gắn
vào mỗi phân tử protein tỉ lệ với điện tích dương của protein :khoảng từ I,5 đến 3 phân tử chất màu cho | dién tich [64]
Thuốc thử coomassic của hãng PIERCE cực nhạy với nồng độ protcin thấp,
(thí dụ với bovine serum albumin | ug/ml) ; khong bị ảnh hưởng bởi hầu hết các
chất cần trở
Phức chất protein - phẩm màu ổn định trong thời gian 60 - 90 phút, ở nhiệt
độ phòng Tác chất được sử dụng để đo protein và polipeptid có trọng lượng phân tử >3 KD Tuy nhiên, do nồng độ phẩm màu thay đổi theo nhiệt độ, nên cần thiết phải thiết lập đường biểu diễn chuẩn cho mỗi lần đo |59|
II.7 Định phân Amino Acid bằng máy sắc ký lồng cao áp
Trong I0 năm gần đây, người ta thường định phân các amino acid bang phương pháp sắc ký lỏng cao áp, qua dẫn xuất của amino acid với fluorenil
Trang 14Phan Téng Quan - Chuong I —16—
Với FMỌOC
Hy -O-C- nà" ne COO"
Dẫn xuất của FMOCC
Phần ứng xảy ra nhanh ở nhiệt độ phòng; chất dẫn xuất của nó bền trong nhiều giờ Dẫn xuất FMOC bị ảnh hưởng bởi muối và các tạp chất Cần sử dụng dung môi hữu cơ để trích sản phẩm trước khi áp dụng sắc ký lỏng cao áp Với PILC pH 8-10 ‘ (O)- =C=$ + NH;,-CH.COO —— NEL NEE-EH-COO R $ Phenilisotiocianat Amino acid Anion phonildHocarbamil aminocarboxil (PITC) (PTC)
Ở nhiệt độ phòng, PITC phần ứng tương đối nhanh ( < 20 phút ) với amino acid, kể cả prolin Phương pháp này có khuyết điểm là một số dẫn xuất
PTC - amino acid có hiệu suất thấp và thay đổi bất bình thường (như asparlat,
glutamaU, nhất là khi có sự hiện điện của muối, kim loại, các lon của dụng dịch
độn Vì thế, sự chuẩn bị mẫu phân tích đòi hỏi nhiều giải đoạn như đông khô chân
không mẫu phân tích, làm bay hơi các chất dẫn xuất của amino acid, tỉnh chế chúng
bằng sắc ký trao đổi ion, cần thời gian ít nhất 105 phút để phân tích một mẫu
Véi OPA (orto-phtaldialdchid} |24|
Phương pháp này hiện đang thông dụng, vì OPA tao thành chất dẫn xuất nhanh với amino acid, Việc tách các dẫn xuất có thể thực hiện tốt ở nhiệt độ phòng,
với độ nhạy cao,Phương pháp ít cho phần ứng phụ, để thao tác tự động trên may
Tuy nhiên, OPA không phản ứng trực tiếp với amin nhị như prolin,
Trang 15Phần Tổng Quan - Chương II —Ì7—
với sự hiện điện của NaBHa, để tạo thành 4-anuno-I-butanol, Kế đó, chất trên được biến đổi thành chất dẫn xuất của OPA, SR? CHO $ pH7,2 + Š§R'` + HNCHCOO „ < con `“ CHO b AN ee OO @-phiadiaidehid Tiol Amino acid VGi_AQT ISI
6-Aminoquinolil-N-hidroxisucinimil carbamat (AQC) là tác chất cho dẫn
xuất hồn với amino acid nhất và nhị cấp ,rong vài giây đồng hỗ Sự tách các chất dẫn xuất rất dễ bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC
Phương pháp có ưu điểm là các tác chất thừa trỏ thành aminoguinolin
(AMO), với độ hấp thu À cực đại = 520 nm khác hẳn so với dé hấp thu của AQC (A cực đại = 395 mm) AGC + HNR,R Amin nhất + HạO và nhị cấp nhanh 1 giấy chậm 15 giây O NHạ \OH Ñ OF AMQ NHS Acces = 395 am Amex = 520 5m
Các phương pháp trên đều có ưu và khuyết điểm, tùy thuộc điều kiện, sử dụng một
Trang 16Phin Téng Quan - Chuone H BANG 2 : Vai amino acid tìm thấy trong cây có COO OY €00 00 HẠN -C-H HạN”- H H;N”-C-H HạN”-C-H H CH, wt Hạ H,C `CH; (cH HC ‘cH,
Glicin(Gh) Alanin(Alanin) — VahnCVal) Leucin(Leu)
COO COO coo coo
HẠNˆ-È-H H)N* H H;N”-C-H HạN”-C-H
H H-C-OH H-C-OH Ci
CoH, CH, H éH, C,Hs
Isoleucin (He) Serin (Ser) Treonin (Thr) Phenilalanin (Phe)
goo" ĐO coo HLN*-C-H - HN” C-H HN -Ệ-H goo "Hy CHS Hạ HạN”- C-H CoH, Hạ Oe CH, bu-p CH, CH, C= CH CH, N-H HN NH "NH C=NH¿` H NH,
Tirosin (Tin Lisin (Lis) Arginin (Arg) Histidin (His)
Trang 17Phần Tổng Quan - Chuong II —]9—
L8 Phương pháp sắc ký lọc GEL
Một trong những phương pháp đầu tiên thường được sử dụng để tính chế các
đại phân tử như protein, acid nucleic hay polisacarid là sắc ký lọc gel (chromatographic par gel filration) Nguyên tắc của phương pháp là các phân tử trong dung dịch được tách do kích thước khác nhau của chúng và tách theo phân tử khối giảm dần Các gel thông dụng có tên thương mại như Sephadex, Sephacryl, Scpharoz Chất gol là một loại polimcr phân nhánh của dextran va biacrilamid, - không tan nhưng rất ngậm nước Nó có dạng hình cầu tròn, đường kính trung bình
là 100 pm,
Làm trương nở gel trong dung môi sẽ dùng trong phép sắc ký ; cho gel vào
cột ; cho tiếp mẫu chất vào đầu cột gol Khi giải ly, các phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ, phân bố trong dung môi ở khoảng trống giữa các hạt gel, nó cũng có
thể xuyên vào và nằm trong những hạt gol ; các phân tử có trọng lượng phân tử
lớn, không thể chui vào các hạt gol, nằm trong dung dịch , chiếm không gian giữa
các hạt gel Khi giải ly, phân tử lớn sẽ di chuyển nhanh ,, ra khỏi cột gel trước tiên
HÌNH 4 : Sự tách các phân tử do kích thước khác nhau bằng phương pháp sắc ký lọc gcl Phân tử lớn —_—_ Phân tử nhỏ e C) ° - (M1
Tùy theo mẫu chất có chứa phân tử có trọng lượng phân tử lớn hay nhỏ ,lựa
chọn loại gel thương mại có độ chặn từ ! K]) đến 20000 KI
Ưu điểm của phương pháp là bảo toàn được hoạt ứnh sinh học của protcin
khảo sát, nghĩa là, sau phép sắc ký lọc gol, cấu trúc nguyên thủy của protein vẫn
giữ nguyên
Khuyết điểm của phương pháp là khả năng tách có giới hạn.Thí dụ : protcin
Trang 18Phần Tổng Quan - Chuong —20——
này có thể tương tác với pha động bằng nhiều cách, làm ảnh hưởng đến thành phần chất giải ly
Tùy theo pH của dung dịch độn, lực ion, điểm đẳng điện của protein, có 3
loại tương tác giữa protein với pha ứnh của sắc ký : thí dụ protein có điện tich 4m trong dụng dịch độn ,bị giải ly lớn hơn dự đoán, so với khối lượng phân tử tương đối của — nó |!ð9], Vài loại gel thương mại của hãng PHARMACIA (Bảng 3)
BANG 3: Vai loại gel thương mại của hãng PHARMACIA
Tên Khả năng phân tích Chất cá thể Kích thước
luại gel dextran protein dang c4u ap dung hat gel tran (um) Sephacryl 100 HR 1 Q00 - 190000 Peptid-protein 25-75 Sephacry! 200 HR 1000 - 80000 $000 - 250000 Polisacarid 25-75 Đại phân tử Sephadex G-100F 1000 - 100000 4000 - 150000 -nt- 40 - 120 Sephadex G-100 SF {000 - 100000 4000 - 100000 -nt- 20 - 50 Superoz 12 1006 - 300000 LQ00 - 300000 Dang cho may FPLC 20 - 40
Bondage! 11-125 2000 - 50000 Dang cho may HPLC 20 - 50
H.8 Phương pháp sắc ký trao đổi lan :
11.9,1,Khái niêm tổng quái về thành tế bào thực vật :
Theo TREVOR ROBINSON [671 , vách của thành tế bào thực vật gồm ba
load polisacarid rcolulo2, homicc lIlQ2, polsaocarild poobHc Nhóm polisacarid pectic
gồm tất cả các polisacarid trích ly từ thành tế bào bởi nước nóng Hemuiceluloz được trích bởi dụng dịch kiềm tương đối mạnh và phần bã còn lại sau khi trích kiềm là
celuloz,
Polisacarid pectic 1a hén hợp phức tạp polmer acid và trung tính [73|., Nó
là thành phần chú yếu trong trái, hội rau Chuối dây chánh gồm các acid D- galacturonic ni vdi nhau bằng œ 1-4 va day chánh nầy xen kẻ bởi những đơn vị
L.-ramnoz L-rammoz nối vào acid uronic bởi C-Í và C-2 của nó để tạo nên góc lệch - 90” so với trục chánh gọi là khuýu pecbc Trên những carbon C-2, C-3, C-4 của ramnoz và acid galacturonic, đôi khi có gắn thêm những đường khác như 6-D-xHoz, 8-ID-galacloz, L-arabinoz Do chức acid, pecun để tan trong nước,
Cấu trúc tiêu biểu của pecun [79] được trình bày wong hình 5
Chất pectic của cây tìm thấy nhiều trong tế bào nhấp cấp (55 %) và liên tế bào, hiện diện nhiều trong cây 2 lá mâm hơn là cây 1 lá mầm Nó gồm hỗn hợp
araban, galactan, metil eter cla galacturonan, chứa xioz, ramnoz Cá phân tử là
Trang 19Phân Tổng Quan - Chuang H —21—
HÌNH 5 : Cấu trúc phân tử tiêu biểu của pectin
L-Ramnoz Acid galacturonic COOH ⁄⁄ Nhánh bên OH _OH ee & Nhánh bên (có galacloz, arabinoz, xioz) 5 ioe 8 —OH o HQ — <—— Acid galacturonic
Poctc polisacarid là một hỗn hơn phức tạp của polimor acid va trung tính, Dong chat trao 46i ion DEAE Sephadex để tách các polisacaril mang tính acid, ramnogalackironan, ra khỏi polisacaril trung tính như araban, galaclan (không gắn vio DEAE mic đù chúng có gắn mạnh vào ramnogalacturonan) |36]
Ở pH cao, nhiều carbon hidrat hoạt động như anion và có thể tách bởi resin
trao đối anion,/Trong vài trường hợp , có thể đồng resin trao đổi cation H.9.2.Phương pháp sắc ký trao đổi iọn :
Kỹ thuật này dùng để cô lập và tách các chất có mang điện tích,với điều kiện là một vài chất có thể gắn bằng lực nối tĩnh điện với chất trao đổi ion và một
số chất khác không có tính chất trên, thoo tiến trình được mô tả như hình 6
Nguyên tẮc này có thể áp dụng cho chất có mang một loại điện tích đơn
giản, nhưng vẫn có thể áp dụng cho các đại phân tử như protein, mang những điện
tích âm và dương cùng trên một phân tử, i
Trong sắc ký trao đổi ion, sự lựa chọn loại ma trận (anion hay cation) thy
thuộc vào điểm đẳng điện pI của protcin, và độ bền của protein trong một khoảng
Trang 20Phần Tổng Quan - Chuong I ae 1 HINH 6 : Quá trình trao đối của chất trao đổi lon A B Cc D + YH va Z sgt Gradicnt sin z Gradient thực „ Chấm dứt sàng hiện xong ! phần gradient x Fe xX |m le fx pr ~ +X > +YH - +x 2 +X ) = + ~ +7 -~ +7 ~ +X + + + + + + + + X X YH 7 xã x x + : : XOX XE XE [YHYHYHYHF | zt zt gt ott
Hình 6A : Chuẩn bị để chất trao đổi lan mang đầy đủ các điện tích
Hình 6B : Các chất cần phân tích được cho tiếp xúc với chất trao đổi ion trong một thời gian vừa đủ để thiết lập cân bằng
ay ` - Dat on wes 2
Chto tiin 11a cane thion SY = s
Chất trao đổi ion @ + Z C— chất rao đổiion © © Z
Chất trao đổi ion mang điện tích âm và X”, VYHỲ, Z' là các lon đương Còn các
phân tử trung tính và các lon âm không gán vào cột sẽ được loại ra khỏi cật
Hình ÓC, 6D ; Những ion dương VYHT, 2” gắn vào chất nền duần tự bị đuổi ra khỏi
cột trao đổi ian khi tăng nồng độ X ; để X” có khả năng thay VHỲ và 2 trong cân
hằng trên, hoặc tăng dé pH dé chuyén YH" va Z thank ¥°, ZOH
Khi nồng độ X” được tăng; lực nổi tày thuộc vao sO dién tich cha YH* va Z* Chất càng mang điện tích lớn, nồng độ của X” phải càng lớn để duổi nó ra khỔi cội
Hoặc khi pH thay đổi lực nối tày thuộc pK cia loai ion (YH + ON === Y + HOH hoặc 7 + ON === ZOH), néu pK chaion
2 hoặc VHT càng cao, pH của dụng dịch phải lán,
Nói chung, sắc ký trao đổi anion đùng để tách các protein acid và sắc ký trao đổi caton dùng để tách protein mang tính baz [13] Tuy vậy,tầy thuộc pH, phân tử
protein c6 thé trở nên âm điện hoặc đương điện Nếu pH tăng, protein trở nên âm
điện HẠH - CH(R) - COO” và gắn vào chất trao đối anion và nếu pH thấp, acid, potcin tr nên dương điện HẠN” - CH(H) - COOH và gắn vào chất trao đổi
Trang 21Phần Tổng Quan - Chuong H —23— HÌNH 7 : Ảnh hướng của pH trên điện tích toàn phần của protein Điện tích toàn phần “NH, của proteing H~ ¢ ~COOH_ gắn vào chất trao đổi cation R Ạ | Diém dang dién pl Ỉ i i i Ỉ Ĩ 7 pH 4 6 § 16 NH» nọ COO` gắn vào chất trao đổi anion
Protein có đặc tính lưỡng tính, nên có thể gắn vào chất trao đổi anion hoặc trao đổi catlon, tùy thuộc vào pH của dung dịch Đo đó,sắc ký trao đổi ion có thể dàng để tình chế các protein Một số chất trao đổi ion thông dung ghi trong bang 4
BẢNG 4: Mội số chất trao đổi ion thông dụng
1Loại chất trao Đặc tính Nhóm chức hoạt động - | Chất phân
đổi iạn lon
DEAE — A.235 | Chất trao đổi anion, baz yếu Dietilaminoetil | -
Sephadex À.50 -O-CHa-CH2- NH(C2Hs)2ÖlÐ CI QAR A.25 | Chất trao đổi anion, baz manh | Dietil-(2-hidroxipropiDaminoetil
Scphadex A.50 falls fcr
-O-(CH)2— CHạ-CH-CH3, CI
C2Hs OH
cM C-25 | Chất trao đổi cation, acid yéu Carboximetil + : Sephadex C-50 -O-CH5-COO Na Na
SP C-25 | Chất trao đổi cation, acid manh Sulfopropil
Sephadex C-50 -Q-(CH2)3-SO3 NaT Na*
Chỉ số A-25 hay C-50 với A là chất trao đổi anion; C là chất trao đổi cation Số 50 cho biết chất trao đối ton có nhiều lễ xốp hơn, thích hợp cho đại phân tử có
Trang 22Phan Téng Quan - Chuang H — 24
11.18 Phương phdap sie ky di luc véi Concanavalin A :
1.10.1 Nguvyén tac của phương pháp sắc ký ái lực :
Phương pháp sắc ký ái lực dựa trên tác dụng sinh học của các đại phân tử :
chúng có thể gắn bởi nối cộng hóa trị với phân tử đặc biệt của một ma trận rắn cố định, thí dụ chuối sacaro7
Hình ảnh sau đây mình họa sự sắc ký ái lực :khi cho mdi hén hop chứa đại
phân tử cần khảo sát, ngang qua một ma trận (được tiêu biểu bởi hình cầu tròn
đen có mang mội mỗi tên nhọn, thí dụ được gọi là phân tử Con A), đại đa số các
phân tử không có ái lực với phân tử Con Á_ nhanh chống bị đuổi ra khỏi cột sắc ký, những đại phân tử có đặc tính nhận ra phân tử Con A, gắn vào phân tử này
và bị giữ lại rong cột, Sau khi tất cả các phân tử không gắn vào Con À, bị đuổi ra khỏi cột; thay đổi dung dịch giải ly để có thể tách rời đại phân tử khỏi phân tử Con A, và được đuổi ra khỏi cội
Với phương pháp trên đại phân tử được tỉnh chế từ hỗn hợp ban dau [66]
Dung dịch giải ly để tách các đại phân tử ra khỏi phân tử Con A phải có ái lực mạnh hơn với phân tử Con A
HÌNH 8: Sự tách các đại phân tử bằng HÌNH 9: Biểu đồ biểu diễn cấu trúc
phương pháp sắc ký ái lực tcamer của Con A Những vị trí nối
Trang 23Phần Tổng Quan - Chuang Il — 75
ILIG 2 Gidi thiéu so lược về các đai phân tử có tính ái lực,
Các phan wf cé tinh ai luc duge goi chung 18 lectin Protein lectin wang tac
đặc biệt với hidrat carbon Nhiều loại có đặc tính làm tích tụ tế bào máu đồ nên còn
được gọi là hemagluunin.Một phần ba loài thực vật đều có chứa hemaglutinin, nhất
ia trong hot Theo KENNETH IC {301 có nhiều loại lecHn có ái lực với các loại
đường khác nhau (bang 5)
BẰNG 5: Mội số loại lecũn thường gặp +
Ngudn géc lectin Ái lực đặc biệt với đường
Canuvalia ensjornis trong hội đậu | a-D ghicoz, a-D- mannoz
Lotus letragonolobus L - fucoz
Ricinus communis 1) - galactoz
Phaseolus vulgaris Ñ - AccuHlglucosamun
Cytisus sessilifolius N - Acetilghicosamin
Trong cdc lectin, Concanavalin A d& được nghiên cứu nhiều nhất và áp dụng
ngoài thưởng mại,
Su sac ky ai luc sy dung Con A - Sepharoz 14 Concanavalin A ghép vào
Sepharoz 4B Chat nay 1a Dextran B13SS gém chuỗi D - giucoz có trọng lượng
phân tử cao và độ phân nhánh cao [57]
Concanavalin A là một prolem trích từ cây đầu Canavalia ensiformis, NG
gồm bốn chuối phân tử đường, hai chuỗi ngắn và hai chuỗi dài có trọng lượng phân tử lần lượi là 8000 và 8000 Các chuỗi này nối với nhau bởi mội lực tương tác không hóa trị, chiếm các vị trí đối xứng cân bằng trong phân tử tetramer của Con A Con A có dạng hình cầu, kích thước ba chiều trong không gian là 42 x 40 x
349 A và có trọng lượng phân (tử là 52000 (hình 9) 1301
Con A Ja loai hemagluunin, hay còn gọi lecun, chứa các protein có tác dụng như kháng thể, Nó có khả năng tương tác đặc biệt với một vài nhóm chức, nhất là
các hidrat carbon, Con A có khả năng cho trầm hiện với polisacarid hoặc
glicoprotein có độ phân nhánh cao và tận cùng của dây là đơn vị
đường a-D-glucopiranoz-D-arabinoz 2a} hoặc a-D-glucopiranoz
hoặc œ-D-manopiranoz, Các đơn vị đường trên mang các nhóm hidroxil 6 C-3, C-4,C-6 và C-Í có cấu hình œ [27]
Để tách các polsacarid ra khói Concanavalin A, thường sử dụng dung dịch giải ly là dung dịch đệm đang dùng trong sắc ký ái lực, cộng vdi a-D-metilmanoz
hoặc œ mebHlglucoz có nồng độ từ 0- 0,5M
Sau cùng, dùng phép điện di để phân tích, so sánh các phân đoạn thu được
Trang 24.Phần Tổng Quan - Chương II —— 26 — HÌNH 10 : Sự chuyển hóa glữa các đường trong cây Nucleosid-trishosphat Fructoz ——_> SU670-phosphat Nucleosid-diphosphoglucoz NK UUP-D-Galactoz Fructoz-phosphat 1 “—> Tinh hột | BO eee Catala cid CN OHHO NV Glucosid GDP-manoz — Manan ÿH;0H D- SN HCOOH KH Hồ Hạ0H oe be —e
NEL RHO ———> Xian
Acid L- A 5 bie - Ascorbic ‘> : H 3 † P- D "lucuronic Uòp
» tl UDP-D ilar
§H;0H 0 aes Gulonalacton HO y-—9 ạ c0ÊH HĐˆ—0., ` if Glicoprotein Acid K0H ——> KOH Ả ——> Araban
© UDP-D-Galacturonic xu? ƒ 8 UDRP H on UDP'T -Arabinoz L-Galacten-y-Lacton Acid 0-Galacturonic + N ¢ 1 { (vere L-Arabinoz Acid L-Galacturonic
{1.10 3 Glicoprotein thuc vat :
Trong những năm gần đây, người ta quan lâm nhiéu dén glicoprotein chita trong cây có Thành tế bào thực vật chứa các cấu thử chánh celuloz, hemiceluloz,
Trang 25Phần Tổng Quan - Chuong H 27
cay iA cnzym, phenol, pid, pham mau, mudi v6 cd va dade biết là glicoprotoin, Glicoprotein hiện điện trong nhiều loại cây nhưng tác dụng của nó vẫn chưa được
xác định Người ta cho rằng các glicoprotoin có tác dụng chống côn trùng, vị khuẩn,
Nó đồng vai rò như một cn⁄ym hoặc cấu trúc điều khiển sự nấy mầm [60|
Sự hiện diện của glicoprolcin trong cây đã được khẳng định bởi TRESOR
‘ROBINSON [67] Ông cho biết là có sự chuyển hóa giữa các loại đường đưa đến sự
tạo thành glicoprotcin trong cây Sơ đỗ chuyển hóa giữa các đường đơn, đưa đến
sự tao thành acid uronic, pectic cling nhu giicoprotcin được trình bay trong hình L9
C6 hai loai ghcoprotein trong thuc vat: “extensin” va “arabinogalactan
proicin”,
a) Extensin (26):
Extensin là gicoprolein, trong đó phần protein có tinh baz chiếm 35- 70 %, với hidroxiprolin ở tÍ lỆ cao nhất (4G %) và đóng vai trò nối protein vào
polisacarid; do đó, hidroxiprolin được xem như chất chuẩn của "extensin” Ngoài
ra, các amuno acid khác như serin, isin, tirosin cũng hiện điện,
Phần polisacarid chiếm 40 % là arabinoz, furanoz va galactoz
Vì tạo nối cộng hóa trị với thành tế bào, nên cxtcnsin rất khó tan và không thể trích nó bởi các dung môi cổ điển nhu dung dich mudi, dung dich SDS 3% cong
1% 2-morcapmooctanol hoặc dung dich acid lạnh hoặc dung dịch kiềm Thí dụ
cxtensin bền ở điều kiện kiềm (10 mg extensin bén trong | mJ dung dịch bảo hòa
Ba(OH)2, 90°C irong 8 gid 148]).Cdc ndi glicosic trong extensin thudng bên trong
điều kién kigm Noi nay bi cdi dwt bai dung dich HCE 75 mM - 100 mM , 690 °c,
rong 1 giờ |38] Extensin được trích bởi NaC1O2 acid hóa nhẹ (chất này không
cắt đứt nối nopdHd)
Người tìm thấy exiensin trong cây thuốc lá, cà chua, dau
HÌNH II: Cơng thức phối cảnh của các loại đường có thể gắn vào
Trang 26Phan Tong Quan - Chuong U — 22
b) Arabinogalacltan protein [7| :
Chất tan trong nước, được tìm thấy trong các loại ngũ cốc.Protein của nó
chiếm 2-10 %, chứa các đơn vị hidroxiprolin, serin, alanin , glicin
Hidrat carbon có độ polimer cao, gdm galactoz, arabinoz, furanoz, tamnoz,
manoz va acid galacturonic Nó gồm một dây chánh với galacloz và những đường khác như arabinoz, acid uronic gắn vào lối này,
Nối giữa prolcin và hidrat carbon có thể là nối D-gal(1—> 4)-L-hidroxiprolin hoặc là một nối khác
Theo GEOFFREY B F [19] arabinogalactan protein hién điện trong các
loại cây nở hoa ( Angiospermes), ở phần lá, thân, rễ, phần cho hoa và hột,
Nối peptid của glicoprotcin thủy giải hoàn toàn khi đun hoàn lưu một lượng glicoprotein (S mg) trong dung dịch HCI 6M (1 mi), rong vài giờ {43|
Theo ADRIENNE E C |6], arabinogalactan protein có công dụng như chất
kết dính, cung cấp chất dinh dưỡng , làm cho cây phản ứng khi bị nhiễm nấm va vi khuẩn
El.11 Phương pháp điện di,
Phép điện di SDS-PAOE hiện nay được ấp dụng rộng rãi để tìm hiểu các đại
phân tử có mang điện tích như protcin, pocũn và các loại nohsacarid [12]cũng như
để xác định trọng lượng phân tử của chúng Chúng tôi đã dùng phương nháp này để
xác dinh protein và polisacarid cua dịch trích nước bã hội bông , H.11.1.Nguyên tác của phép dién di SDS-PAGE 140] :
Điện di SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrvlamude gel electrophoresis) ding gel poliacrilamid lam m6i trường điện đi có nhiều lổ rỗng Gel có chứa sodiuam dodecil sulfat CH3-(CH2)19-CH2OSO03Na 1a chat hoat dong
bê mặt dạng ion , nó gần với các protcin tan trong nước, theo một tỉ lệ định lượng
đặc biệt (1,4 g SDS gắn với ! g protein) bang cầu nối hidrogen giữa oxigen cia -
nhóm suifat và hidrogen của nối peptid [SG] Vé mat thuc nghiém, SDS da gan
như loại bỏ được sự khác biệt về mặt điện tích : các phức chất SDS-polipenud có
cùng điện tích toàn phần 152], do đó, phép điện di SDS-PAGE sẽ tách các đại phân tử dựa trên kích thước của chúng,
Trong quá trình đi chuyển từ catod đến anod, đại phân tử sẽ di chuyển cho đến khi gặp lỗ rỗng nhỏ nhất ngăn cần sự di chuyển và nó sẽ nằm lại tại chỗ, mặc dù quá trình điện đi vẫn tiếp tục [75| Phép điện đi SDS-PAGE sử dụng gel có nồng độ acrilamid tăng đần tuyến tính theo chiều di chuyển của đại phân tử, có nghĩa là
kích thước của lỗ rỗng của gei nhỏ đần, đễ dàng tách các đại phân tử thành vệt sắc
nét : khi đại phân tử đi chuyển đều vào vùng gel có kích thước ngày càng nhỏ dần,
vùng phía trước của đại phân tử di chuyển chậm hơn so với vùng được kéo theo
Trang 27Phần Téng Quan - Chuong II — 29 —
11.11.2 Cấu ưrúc gel poliacrilamid ;
Gei poliacrilamid là polimer của đơn vị monomer acrlamid khi có sự hiện
điện của chất tạo mạng N.N'-mculen bisacrlamud, khi, chất xúc tác persulfat
armonium hòa tan trong HƯớc, nó tạo thành gốc tự đo (S2O§F > 2 §04 + ); gốc tự đo này giúp acrilamid tạo thành chuỗi đài Dung địch chuỗi polimer này rất nhớt nhưng không tạo thành gel, do các chuỗi có thể trợi lên nhau Để tạo gel, cần có N,N'-mctilcn bisacrlamid để nối mạng ngang các chuỗi trên lại với nhau (hình 12)
Gel poliacrilamid v6i T, CC khác nhau có kích thước lỗ rỗng, độ cứng, độ
bền, đặc tính trương nở khác nhau Sự liên quan tuyến tính giữa T, C của go và trọng lượng phân tử của các chất điện di được trình bày trong bảng 6 [26|
Hình 13 là đường biểu diễn của logio trọng lượng phân tử các polipepdd
theo gel poliacrilamid gradient T % = 5-20, C % =2,6 của các chất : miosin
(212.000), RNA polimeray (165.000), B-galactosidaz (130.000), phosphphorilay, a
(932,500), bovine scrum albumin (68.000), caalaz (37.500), ovalburmin (43.000),
gliccraldchid-3-phosphat dehydrogenaz (36.000), chimotripsmogen A (25.700),
soybean tripsin inhibitor (20.100), lisozin (14.300) [44]
BẰNG 6 : Trọng lượng phân tử các chất điện di với gel có T và C khác nhau, %' % € TRONG LUOGNG PHAN TU CUA CHAT ĐIỆN DI < 2,5 2,7 1.006,000 5 27 | 25.000 - 300.000 7 2,7 100.000 LÔ 2,7 15.000 - 70.000 l5 2,7 12.000 - 50.000 30 2/7 2.000 7-25 ime 14.300 - 330.000 5-20 2,6 14.300 - 210,000 (Hinh 13) 3-30 84 13.000 - 950.006
H.ib.a Phép dién di SDS-PAGE
Nha ph4m xanh bromophenol, quá trình điện di được theo dõi và ngừng lại
khi vệt mầu của phẩm xanh xuống còn cách đáy bản gel khoảng 0,5 cm, - ® HIỆN HÌNH BẢN GEL
Trang 29Phân Tổng Quan - Chương Ú1 —3!—-
HINH 13 : Đường biểu diễn logis trọng lượng phân tử các polipepud và gel
poliacrilamid bang gradicnt (T % = 5-20, C % = 2,6) 200 igo sof og 1" = = 4 so“ c = x wg AOR = a Ƒ— 3 = a 20r x = ¡01 | i 3 id F§ z0 Ofy TF
Dung dich nhuOm mau gel : xanh Coomassie 0,1 % trong hỗn hợp nước :
metanol : acid acetic lodng (4:5: 2 theo thể tích) Để yên 1-2 gid, ở nhiệt độ
phòng, Nếu tầng nhiệt độ lên 40-50 °c tiến trình sẽ nhanh hơn,
Tẩy màu hẳn gef: hỗn hợp nước ; metanol: acid accúc hãng (5:5:1)
Anion của phẩm xanh Coornassie lan trong môi trường acid kết hợp với các
nhóm amino_ proton hóa của prolein bằng lực tương tác tĩnh điện , tạo thành phức
Có màu xanh đậm
Bang dung dịch nirại bạc, phương pháp này nhạy gấp 100 lần phương pháp trên, có thể phái hiện 0,2 ng protein và polisacarid Phương pháp gồm 10 giai đoạn với
thời gian ít nhất 3 giờ lã phút
® PHƯƠNG PHÁP SDS-PAGE ĐỂ ĐO TRONG LUONG PHAN TỬ
Tùy thuộc chất cần phân tích, chọn gel có %T, % € thích hợp và lựa chọn các chất
chuẩn có trọng lượng phân tử biết rước Phương pháp SS-PAGE có thể cho biết
Trang 30PHAN NGHIEN CUU
— Chương I ĐỀ NGHỊ MỘT PHƯƠNG PHÁP ĐƠN GIẢN,
HIỆU QUÁ ĐỂ CÔ LẬP CÁC PHÂN ĐOẠN CỦA
DICH TRICH BA HOT BONG BỞI NƯỚC
— Chương Il, THU NGHIEM HOAT TINH LOI SUA TREN CAC PHAN BOAN SIEU LOC
— Chương HH XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC PHAN BOAN SIEU LOC
Trang 31Phần Nghiên Cứu - Chương ï —32—
Chương | ĐỀ NGHỊ MỘT PHƯƠNG PHÁP ĐỚN GIẢN, HIỆU QUÁ ĐỂ
CO LAP CAC PHAN DOAN CUA ĐỊCH TRÍCH BÃ
HOT BƠNG BỞI NƯỚC 1.1 Trích bã hột bông bởi nước
Ngudn ba hOt bong vai Gossypium herbaceum được cùng cấp bởi XÍ nghiệp
GUYOMARC NUTRITION ANIMAL tai ving VANNES, nude Cong HOa Phap
Hột hông sau khi loại bỏ sợi, được phơi khô bằng một luồng hơi nóng hoặc phơi khô tự nhiên, kế đó ,lau chuốt bằng cơ học để loại bỏ rác bấn Hột được cán thành mảnh nhỏ , nấu chín để làm kết tủa prolein cũng như để loại bỏ gossypol và tạo sự thuận tiện cho việc trích đầu tiếp theo.Dầu được trích bằng dụng môi hoặc ép Dầu sau khi loại nhầy ,trung hòa ấy màu ,mòi được dùng trong thực phẩm.Bã còn lại,
là nguồn thực phẩm cho động vật nhai lại và là nguồn nguyên liệu mà chúng tôi
ding trong nghiên cứu [4]
Chúng tôi khảo sát vài thông số kỹ thuật của phương pháp trích ly bã hột bông với nước ,căn cứ trên phóp điện đi SDS - PAGE
iJ Khảo sát vài thông số kỹ thuậi của phương pháp trích ly
Lida Khao sát số lần trích ký hiệu
a) Trích lần thứ nhất: 10g bã hột bông +100 ml H2O, 20 phú!,95°C — (AI)
b) Trích lần thứ nhì : Căn lần Í + 100 mi H2O, 20 phút, 95 °c (iB)
©) Trich fin thé ba : Cặn lần 2 + 100 mí H2O, 20 phút, 95 °C (ic) đ) Trộn cả ba lần trích (iD) Nhdn xét + Kéi qua dién di ( hin 14) cho thay 1A, 1B, IC giống nhau, vậy cân trích ít nhất 2 lần !.1.1b Khảo sát hàm lượng nước sử dụng ký hiệu a) TÔ g bã + 100 ml nước , 20 phút, 95 ”C (2) hỳ 10 g bã + 300 mÌ nước , 20 phút, 95 °C (3}
Nhận xét : Kết quả điện di ( hình 15) cho thấy lượng nude trich 100 mi hodc 300 mi cho kết quá giống nhau
Trang 32Phan Nghién Citu - Chuong I —33— L1.1.d Khảo sát nhiệt độ trích Ký hiệu a) 10 g ba +100ml nước, 20 phút, 75 °C (7) b) 10 g ba+ 100 ml nước, 20 phút, 80 °C (8) c) I0 g bã+ 100 mÌ nước, 20 phút, 95 ”C (9) Nhận xét : Kết quả điện di ( hình I5) cho thấy trích ở nhiệt độ khác nhau, cho kết quả tương tự I.1.I.c Kết luận Với bã hột bông (10 ø) cần trích với nước (I00 ml), ít nhất 2 lần ở nhiệt độ 75-95 ”C, trong 20 phút
I1.2 Xử lý nguyên liêu ban đầu
Dựa trên kết quả ở phần I.I.I, chúng tôi chuẩn bị nguyên liệu ban đầu theo sơ đồ 2 như sau :
Đun nóng bã hột bông (I0 kg)với nước (2 x 100 lí), ở 90 - 952 C, trong 20 phút ; lọc Đông cô chân không dịch lọc, cho chất đông cô chân không A
Chất này được tiếp tục xử lý với ctanol 90 để loại các chất hữu cơ có trọng
lượng phân tử nhỏ, oligosacarid, sắc tố ([lavon, gossypol .) theo phương pháp sau
đây : Khuấy đều chất đông cô chân không thô A (100g)với ( 2 x I lit) etanol 90° trong 30 phút Ly tâm ở vận tốc 9.500 vòng/phút Cho 2 phần : phần tan trong
clanol B và phần không tan trong ctanol C
Phần không tan C được tiếp tục xử lý như sau : ĐÐun sôi chất C (100g) với I lít nước, ở 90 - 95" trong 20 phút Ly tâm Lọc bằng ống lọc giấy ,có lỗ xốp lần
Jugt 14 25 um, 8 um va | um ở áp suất l kg/cm” Đông cô chân không dịch lọc,
cho chất D
Kết quả thử nghiệm tính lợi sữa cho thấy dung dịch trích ly của hột bông có
trọng lượng phân tử nhỏ hơn 5 KD không có hoạt tính lợi sữa, nên chúng tôi dùng phương pháp siêu lọc với độ chặn 5 KD, áp dụng trên chất D thu được phân đoạn >5 KD, gọi là chất E
Chất ID và E_ là nguyên liệu đầu dùng cho tất cả các phản ứng sau này Chất D và E không chứa gossypol (đã được kiểm tra bằng sắc ký lỏng cao áp
thco phương pháp của SHERIF A, [63]
1.2 Phương pháp trầm hiện chọn lọc
1.2.1 Dung dung dich sulfat amonium
Ap dung phudng phap BRUNO JIRGENSONS [31] ,chting tôi sơ bộ tách các
Trang 33Phan Nehién Cu - Chuong I —34—
aỳ Hồ tan chất đơng cơ chân không D (1g) trong nước cất (20 m) Đun trên bếp cách thủy 10 phút Ly tâm ở vận tốc 15,000 vòng/phút, rong 20 phút Chia đều
phần nổi trên , trong 5 ống nghiệm (4 mÐ, đánh số A, B,C, Ð, E,
SƠ ĐỒ 2; Trích ly bã hột hông với nước Bã hội bông đã loại dầu (10 Kg) - Đun nóng với nước (2 x 100 l0, 907-95”C trong 20 phút ~ Loc -Đông cô chân không dịch lọc Chất đông cô - Bianol 90” - Lục Chất không tan trong Chất lan trong etanol € (2,1 kg) Fianol B (0,04 Kg) - Đun nóng với nước (21 l0, 90-95” C ,trong 20 phút - Lọc ( lỗ xốp lum) -Đông cô chân không
Chất tan trong Chất không tan
Trang 34Phần Nghiên Cứu - Chuong |
HÌNH 14: Kết quả điện di trong việc khảo sát vài thông số kỹ thuật của
phương pháp trích ly bã hột bông bởi nước
Trang 35Phần Nghiên Cứu - Chương I —36-—
HÌNH I5 : Kết quả điện di trong việc khảo sát vài thông số kỹ thuật của phương pháp trích ly bã hột bông bởi nước
Điện di SDS-PAGE với T= 10-20 %, C= 2,7 %.Ban gel 10cm x10cm,
đầy Imm.Cường độ dòng điện không đổi 10 mA trong 160 phút
Trang 36Phần Nghiên Cứu - Chương ï — 37 —
b) Cho sulfa amonium khan vào các ống nghiệm wén dé ndng dé sulfat amonium ở các Gng nghiém A, B, C, D, E dat 20%, 40%, 60%, 80% và 100% Khuấy đều
bằng máy từ trong 30 phút, ở nhiệt độ phòng Để yên,
€) Sau khi quan sát các ống nghiệm, chúng tôi nhận Xét:
Trong ống nghiệm A : không có ầm hiện (-)
Trong ống nghiệm B : rất ít rầm hiện (-)
Trong ống nghiệm € : có trầm hiện (4)
Trong ống nghiệm 1): có trầm hiện (++) Trong ống nghiệm E: có trầm hiện (+44)
đ)ì Ly tâm các ống nghiệm ở vận tốc 15.000 vòng/phút, trong 15 phút, Mỗi ống nghiệm (ngoại trừ ống nghiệm A) gồm một lớp cặn và lớp nổi lên trên Thẩm tách với nước cất cả 2 phần, trong 24 giờ để loại muối Đông cô chân không Kiểm tra các sản phẩm thu được bằng phương pháp điện đi SDS-PAGH, ©} Kết quả : phí trong bảng 7, BẰNG 7 :Kết quả phương pháp trầm hiện chọn lọc, sứ dụng su at amonium,
Số thứ tự ống | Nông độ dung dịch| Chất đông cô | Đặc tính của sẵn
nghiệm sulfat amonium chân không, phẩm (mg) AL phan néi 20 % 35,4 Bột trắng A 2 phần cặn 20 % 0 Kt phan nổi 40 % 65, Bột trắng H2 phần cặn 40 % 14,7 Bột nâu đẹn Ci phan nổi 60 % 48,5 Bột trắng C2 phần căn 60 % 39,2 Bột nâu
DE phan di 80 % 534 Bội nâu
132 phan cặn S0 % 53,3 Bội nâu E1 phần nổi 100 % 31,7 Bột nâu E2 phần cặn 100 % 61,8 Bội nâu nhại 514,8 mg / {000 mự ban dau
Trang 37Phần Nghiên Citu - Chuong | — 38 — Hình 16 : Kết quả điện di của phương pháp trầm hiện chọn lọc, sử dụng sulfat
amonium
HÌNH 16
Các cột theo thứ tự từ trái sang phải
Cột Í : chất đơng cô chân không D Cột 2: chất AI (Bảng 7) Cội 3: chất BI (Bảng 7) Cội 4: chất B2 (Bảng 7) Cội 5 : chất CI (Bảng 7) Cột 6: chất C2 (Bang 7) Cội 7: chất D1 (Bảng 7) Cột 8: chấ D2 (Bảng 7) C619: chdt E2 (Bảng 7)
Cột 10 : chất chudn hang PHARMACIA
I.2.2.Phương pháp trầm hiện chọn lọc, dùng dung dịch cetavlon (cetiltrimetil
amonium C¡oH42BrN)
Trang 38Phần Nghiên Cứu - Chương ï —39—
a) Phần thực nghiệm
Hòa tan chất đông cô chân không D (200 mg) trong nước cất (40 mủ)
Đun nóng; khuấy đều; ly tâm ở vận tốc 15000 vòng/phút, trong 20 phút để loại các chất không tan Sau đó, thêm dung dịch cetavlon 3 % (5 ml) vào ,Khuấy đều trong 20 phút Ly tâm để thu chất ầm hiện, Hòa tan chất trong nước để thấm tách trong
24 giờ, trước khi đông cô chân không ,Phân tích sản phẩm thu được bang phóp điện
di SDS-PAGE
hì Két gua va hién ludn
Phương pháp thực nghiệm nầy được lập lại 3 lần ,Tách sơ bộ các thành phần
hóa học của dịch trích bã hội bông với nước ,bằng cách cho trầm hiện với dung
địch cetavion 3 %, không cho kết quả như mong muốn San phẩm cuối cùng dù đã được thấm tách với nước cất hoặc dùng phương pháp siêu lọc với màng lọc có độ
chặn 3 KỈ ,vẫn còn chứa nhiều cotavion, Điều này gây khó khăn cho việc phan
lich bang phép didn di SDS-PAGE va không tính được hiệu suất sản phẩm
1.3, Phương pháp siêu lọc,
Phương pháp này thường dùng để sơ bộ tách các phân tử có trọng lượng phân tử rãi khác nhau, Trong phòng thí nghiệm, chúng tôi dùng bình siêu lọc của hãng AMICON có dụng tích 350 mi, sử dụng khí nirogen Ở áp suất l,5 Kg/cm”.,
Mang loc thuộc loại trực điện (ultrafdtratHon trontale), có điện tích 0,0032 m”, Sử
dụng các loại măng lọc YM 100, XM 50, YM 10, YM 5, YM 2 (các chữ XM, YM
là ký hiệu của nhà sản xuất ; các số 100, 50, 20 để chỉ màng lọc sẽ giữ lại các phan
tử có trọng lượng phân tử > 100 K, > 50 K2 hoặc > 20 KD)
Hiện nay, nhà sản xuất SARTORIUS đã chế lạo màng lọc tiếp tuyến (ultrafiltration tangentielie) kiểu nhỏ dùng cho phòng thí nghiệm Loại này có u
điểm là kích thước gọn nhẹ (l cm x fom x 18cm), diện tích màng lọc lún 0,1m;
lớn gấp 30 lần màng lọc trực diện, nên tiết kiệm thời gian và tránh sự lên men của
các dung dịch siêu lọc bởi môi trường, nhiệt độ Nhưng loại siêu lọc với măng lọc tiếp tuyến chỉ có 2 cỡ độ chặn là 20 KD và 100 KD
1.3.1 Siêu lọc bằng nước
a) Phân thực nghiệm
Hòa tan chất đông cô chân không Ð (50 g) trong nước cất (2 lí) Thực hiện
siêu lọc với các màng lọc khác nhau, theo sơ đồ 3
Điều kiện thực hiện khác nhau : siêu lọc ở phòng lạnh @ °C) hoặc ở nhiệt đệ
phòng (25 ”C) ; với màng lọc trực tiếp hoặc màng lọc ĐIẾp tuyển ; với nguyên liệu
đầu là chất đông cô chân không Ð hoặc E (thu được từ phần L.1.2.)
Trang 39Phần Nghiên Cúu - Chương Ì —40—
Các phân đoạn này được phân tích bằng phương pháp điện di SDS-
PAGE (Hình l7), cũng như bằng các phương pháp hóa học khác (Chương ID
bỳ Kết quả ; Ghi trong bằng 8
BANG 8: Hiéu sudt % của các phân đoạn siêu lọc từ phương pháp siêu lọc trong
các điều kiện khác nhau
Hiệu suất % của các phân đoạn siêu lọc Điều kiện siêu lọc >I09 | 50-100 | 20-50 | 5-20 | 25 | Tổng KD KD KD KD Ki) | cộng Siêu lọc với màng lọc trực tiếp ở phòng lạnh, 16,0 0,52 0,66 174 1475 | 82,1 Áp dụng trên nguyên liệu đầu D Siêu lọc với màng lọc trực tiếp ỏ nhiệt đồ 6,6 0,80 i 40 i i JO 67,0 86,8 phong.Ap dụng trên nguyên liệu đầu Ð Siêu lọc với màng lọc trực tiếp, ở phòng lạnh 24,3 6,80 9,50 41,2 11,5 | 93,3
Ap dung trên nguyên
liệu đầu Eý Siêu lọc với màng lọc trực tiếp ở nhiêt đô 16,4 8,90 16,70 38,6 152 95,8 phòng, 4p dụng trên nguyên liệu đầu E
1.3.2, Siêu lọc bằng các dung dich mudi
- Áp dụng phương pháp siêu lọc theo sơ đồ 3, trên nguyên liệu đầu là chất
đồng cô chân không Ð, với màng lọc trực điện, thực hiện ở nhiệt độ phòng, Sử
dụng các loại dụng dịch muối :
- Dung dich phosphat 100 mM + NaCiM -Dung dich guanidin 5S M
Trang 40Phần Nghiên Cứu - Chương ï —4l—
SƠ ĐỒ 3 : Áp dụng phương pháp siêu lọc trên chất đông cô chân không thô Ð